騰沖重樓根莖的化學(xué)成分及抗菌活性研究

楊瑩莉 ，白 雪，楊 珺，羅吉鳳，段曉燕，王躍虎

1.中國科學(xué)院昆明植物研究所 資源植物與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201

2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

重樓屬ParisL.植物為藜蘆科（Melanthiaceae）多年生草本植物，生長(zhǎng)在常綠闊葉林、落葉闊葉林、針葉林、竹叢和灌木叢中[1-2]；包括33 個(gè)種和15 個(gè)變種[2]，主要分布于歐亞大陸的熱帶和溫帶地區(qū)，中國大部分地區(qū)均有分布。西南地區(qū)居多[2-3]。重樓屬植物有很高的藥用價(jià)值，在民間，有十幾個(gè)種或變種作為藥用植物被利用。據(jù)《中國藥典》2020 年版記載，重樓藥材的基原植物是云南重樓（滇重樓）ParipolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.和七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐等病癥[4]。云南重樓提取物[5]和球藥隔重樓P.fargesiiFranch.根莖提取物[6]已被批準(zhǔn)為化妝品原料。

騰沖重樓P.tengchongensisY.H.Ji, C.J.Yang &Y.L.Huang 僅發(fā)現(xiàn)于云南，生長(zhǎng)于海拔2 750～3 200 m 常綠闊葉林、竹林和灌叢中[7]，騰沖重樓被當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)作重樓藥材使用，一般用于治療毒蛇咬傷和跌打傷痛[8]。目前，關(guān)于騰沖重樓化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)較少，僅報(bào)道了從騰沖重樓中分離得到的20 個(gè)甾體皂苷類化合物，其中，化合物paristengoside A對(duì)人紅白細(xì)胞白血病HEL 細(xì)胞和人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用[9]。為了更全面地認(rèn)識(shí)和合理利用騰沖重樓，本研究對(duì)騰沖重樓進(jìn)行了化學(xué)成分研究和抗菌活性評(píng)價(jià)。從其根莖提取物中共分離出16 個(gè)化合物（圖1），分別鑒定為parisvanioside A（1）、kingianoside K（2）、7-氧薯蕷皂苷（7-oxodioscin，3）、pariposide A（4）、parisvanioside B（5）、parisrugoside H（6）、(25R)-17α-羥基螺甾-5-烯-3β-基O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（(25R)-17α-hydroxyspirost-5-en-3β-ylO-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucopyranoside，7）、麥冬皂苷C?（ophiopogonin C?，8）、纖細(xì)薯蕷皂苷（gracillin，9）、重樓皂苷Ⅰ（paris saponin Ⅰ，10）、重樓皂苷II（paris saponin II，11）、重樓皂苷Ⅵ（paris saponin Ⅵ，12）、pennogenin 3-O-β-chacotrioside（13）、重樓皂苷H（paris saponin H，14）、重樓皂苷Ⅶ（paris saponin Ⅶ，15）和β-蛻皮激素（β-ecdysone，16）。其中化合物1～7 首次從騰沖重樓中分離得到。

1 儀器與材料

HPD-100 型大孔樹脂（上海吉至生化科技有限公司），柱色譜用硅膠（80～100、200～300、300～400 目，青島美高集團(tuán)有限公司），反相（RP）C18硅膠（40～75 μm，F(xiàn)uji Silysia Chemical 有限公司），Sephadex LH-20 凝膠色譜（GE Healthcare Bio-Sciences AB），薄層色譜（TLC）板（100 mm×50 mm，青島美高化工有限公司），SK3300LH 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司），AL204 型電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司），循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SB-1300 型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），500 MHz/800 MHz 核磁共振波譜儀（德國Brucker 公司），DFS 型快原子轟擊離子源質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific），Agilent 1200 Series 高效液相色譜儀半制備。

實(shí)驗(yàn)用騰沖重樓根莖樣品于2021 年10 月采自云南省蘭坪縣重樓種植基地，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所楊珺實(shí)驗(yàn)師鑒定為藜蘆科重樓屬植物騰沖重樓P.tengchongensisY.H.Ji, C.J.Yang & Y.L.Huang，憑證標(biāo)本（YJ2021050）保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物標(biāo)本室。

2 提取與分離

騰沖重樓干燥根莖（3 kg）粉碎，加70%乙醇（3L）60 ℃超聲提取6 次（每次1 h），濾過，取濾液，60 ℃減壓回收溶劑，得粗提物浸膏（660.0 g），加水（1 L）混懸，分別用等體積石油醚、醋酸乙酯和正丁醇分別萃取5 次，60 ℃減壓濃縮，得石油醚部分（118.1 mg）、醋酸乙酯部分（3.1 g）和正丁醇部分（182.0 g）。將正丁醇部分（170.2 g）用4 L 蒸餾水溶解，過 HPD100 大孔樹脂柱，乙醇-水（30%→50%→70%→95%）梯度洗脫后得4 部分：T1（1.7 g）、T2（5.4 g）、T3（22.7 g）和T4（50.0 g）。T1（1.7 g）經(jīng)RP C18硅膠柱色譜及Sephadex LH-20 凝膠柱（甲醇）分離純化后，得到化合物16（78.1 mg）。T2（5.4 g）經(jīng)RP C18硅膠柱色譜分段及HPLC（乙腈-水40∶60）分離純化后得到化合物15（4.9 mg，tR＝21.4 min）和14（11.7 mg，tR＝27.0 min）。T3（22.7 g）經(jīng)RP C18硅膠柱色譜得到T3-1（2.3 g）和T3-2（12.3 g）。T3-1 經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇15∶1→1∶1）得到T3-1-1（57.9 mg）、T3-1-2（567.8 mg）和T3-1-3（34.7 mg）3 個(gè)組分。T3-1-1 用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜（甲醇）及HPLC（甲醇-水77∶23）分離純化得到化合物1（1.1 mg，tR＝25.5 min）、4（5.7 mg，tR＝32.4 min）、7（2.8 mg，tR＝22.3 min）和12（19.1 mg，tR＝23.7 min）。T3-1-2用Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）及HPLC（甲醇-水83∶17）分離純化得到化合物5（1.1 mg，tR＝32.5 min）、6（1.1 mg，tR＝23.0 min）、3（0.9 mg，tR＝29.3 min）和13（26.9 mg，tR＝25.7 min）。T3-1-3 經(jīng)HPLC（甲醇-水68∶32）分離純化后得到化合物2（0.5 mg，tR＝34.2 min）。T3-2 經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇15∶1→1∶1）得到T3-2-1（88.5 mg）、T3-2-2（1.0 g）和T3-2-3（10.1 mg）3 個(gè)組分。T3-2-1 用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜（MeOH）及HPLC（甲醇-水85∶15）分離純化得到化合物8（3.5 mg，tR＝25.0 min）。T3-2-2 經(jīng)RP C18硅膠柱色譜（80.7 mg）及HPLC（乙腈-水45∶55）分離純化得到化合物11（6.7 mg，tR＝17.9 min）和9（5.2 mg，tR＝21.6 min）。T3-2-3 經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶（甲醇）得化合物10（9.1 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1：白色無定型粉末，分子式為C39H58O14。ESI-MSm/z: 774 [M＋Na]+，。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ: 6.64(1H, d,J= 8.6 Hz, H-7), 6.37 (1H, brs, H-1?), 6.29 (1H,d,J= 8.6 Hz, H-6), 5.47 (1H, m, H-11), 4.88 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-1?), 4.26 (2H, m, H2-6?), 1.74 (3H, d,J=6.2 Hz, H3-6?), 1.20 (3H, s, H3-19), 1.04 (3H, d,J= 6.7 Hz, H3-21), 0.87 (3H, s, H3-18), 0.65 (3H, d,J= 4.7 Hz,H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 143.7 (C-9), 136.4 (C-6), 130.5 (C-7), 119.1 (C-11), 109.2 (C-22), 101.7 (C-1?), 100.7 (C-1?), 82.7 (C-5), 80.5 (C-16),79.3 (C-3?), 77.9 (C-5?), 77.5 (C-8), 77.2 (C-2?), 74.0(C-4?), 73.5 (C-3), 72.6 (C-3?), 72.2 (C-2?), 71.3 (C-4?),69.2 (C-5?), 66.7 (C-26), 62.1 (C-6?), 61.3 (C-17), 48.3(C-14), 42.1 (C-20), 41.3 (C-13), 41.2 (C-12), 38.4 (C-10), 33.3 (C-4), 32.8 (C-1), 31.5 (C-23), 30.3 (C-25),29.6 (C-15), 29.2 (C-2), 28.9 (C-24), 25.3 (C-19), 18.5(C-6?), 17.0 (C-27), 16.9 (C-18), 14.3 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[10]，故鑒定化合物1 為parisvanioside A。

化合物 2：白色無定型粉末，分子式為C44H68O17。ESI-MSm/z: 891 [M＋Na]+，。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ: 5.74(1H, brs, H-6), 6.30 (1H, brs, H-1?), 5.92 (1H, brs, H-1???), 4.93 (1H, m, H-1?), 4.32, 4.23 (2H, m, H2-6?), 4.25,4.16 (2H, m, H2-5???), 1.75 (3H, d,J= 5.9 Hz, H3-6?),1.13 (3H, d,J= 6.8 Hz, H3-21), 1.10 (3H, s, H3-19),0.83 (3H, s, H3-18), 0.66 (3H, d,J= 4.3 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 200.7 (C-7), 164.9(C-5), 126.1 (C-6), 109.4 (C-1???), 109.1 (C-22), 101.6(C-1?), 100.2 (C-1?), 86.5 (C-4???), 82.5 (C-2???), 80.8 (C-16), 77.7 (C-2?), 77.5 (C-3???), 76.8 (C-3), 76.8 (C-3?),76.8 (C-5?), 76.7 (C-4?), 73.9 (C-4?), 72.6 (C-3?), 72.4(C-2?), 69.3 (C-5?), 66.6 (C-26), 62.3 (C-6?), 61.7 (C-17), 61.2 (C-5???), 49.8 (C-14), 49.6 (C-9), 44.8 (C-8),41.7 (C-20), 41.0 (C-13), 38.6 (C-4), 38.5 (C-10), 38.5(C-12), 36.2 (C-1), 34.1 (C-15), 31.6 (C-23), 30.4 (C-25), 29.5 (C-2), 29.0 (C-24), 20.9 (C-11), 18.4 (C-6?),17.1 (C-27), 16.8 (C-19), 16.2 (C-18), 14.9 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[11]，故鑒定化合物2 為kingianoside K。

化合物 3：白色無定型粉末，分子式為C45H70O17，，ESI-MSm/z:907 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.40 (1H, brs, H-1?), 5.84 (1H, brs, H-1???), 5.76 (1H, s,H-6), 1.74 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6???), 1.62 (3H, d,J=6.0 Hz, H3-6?), 1.12 (3H, d,J= 6.9 Hz, H3-21), 1.10(3H, s, H3-19), 0.82 (3H, s, H3-18), 0.66 (3H, d,J= 4.8 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 200.8(C-7), 165.0 (C-5), 126.0 (C-6), 109.0 (C-22), 102.6 (C-1???), 101.6 (C-1?), 100.2 (C-1?), 81.1 (C-16), 78.3 (C-4?), 77.6 (C-5?), 77.2 (C-2?), 76.8 (C-3?), 76.5 (C-3),73.8 (C-4???), 73.6 (C-4?), 72.5 (C-3???), 72.4 (C-3?), 72.3(C-2???), 72.2 (C-2?), 70.2 (C-5???), 69.2 (C-5?), 66.5 (C-26), 61.6 (C-17), 61.0 (C-6?), 49.7 (C-14), 49.5 (C-9),44.7 (C-8), 41.7 (C-20), 40.9 (C-13), 38.6 (C-4), 38.5(C-10), 38.4 (C-12), 36.2 (C-1), 34.1 (C-15), 31.5 (C-23), 30.3 (C-25), 29.5 (C-2), 28.9 (C-24), 20.8 (C-11),18.4 (C-6???), 18.2 (C-6?), 17.0 (C-19), 16.8 (C-27), 16.2(C-18), 14.9 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[12]，故鑒定化合物3 為7-氧薯蕷皂苷。

化合物 4：白色無定型粉末，分子式為C39H60O14，，ESI-MSm/z:775 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.49 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-7), 6.37 (1H, d,J= 1.2 Hz,H-1?), 6.22 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6), 4.88 (1H, d,J=7.3 Hz, H-1?), 1.74 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.08 (3H,d,J= 6.9 Hz, H3-21), 0.93 (3H, s, H3-19), 0.88 (3H, s,H3-18), 0.66 (3H, d,J= 5.8 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 136.1 (C-6), 130.7 (C-7), 109.3(C-22), 101.9 (C-1?), 101.1 (C-1?), 82.2 (C-5), 80.9 (C-16), 79.6 (C-3?), 78.7 (C-8), 78.1 (C-5?), 77.5 (C-2?),74.2 (C-4?), 74.0 (C-3), 72.8 (C-3?), 72.5 (C-2?), 71.6(C-4?), 69.4 (C-5?), 66.9 (C-26), 62.8 (C-17), 62.4 (C-6?), 51.8 (C-9), 51.5 (C-14), 42.3 (C-13), 41.5 (C-20),39.6 (C-12), 37.6 (C-10), 35.0 (C-1), 34.5 (C-4), 31.8(C-23), 30.6 (C-25), 29.2 (C-2), 29.2 (C-24), 29.1 (C-15), 23.2 (C-11), 18.7 (C-19), 18.2 (C-6?), 17.3 (C-27),17.0 (C-18), 14.9 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物4 為pariposide A。

化合物 5：白色無定型粉末，分子式為C45H70O18，，ESI-MSm/z:921 [M＋Na]+。1H-NMR (800 MHz, pyridine-d5)δ:6.50 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-7), 6.35 (1H, d,J= 8.5 Hz,H-6), 6.32 (1H, brs, H-1?), 5.81 (1H, brs, H-1???), 4.78(1H, d,J= 7.1 Hz, H-1?), 1.74 (3H, d,J= 6.1 Hz, H3-6???), 1.61 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.10 (3H, d,J=6.9 Hz, H3-21), 0.94 (3H, s, H3-19), 0.89 (3H, s, H3-18),0.67 (3H, d,J= 5.0 Hz, H3-27)；13C-NMR (200 MHz,pyridine-d5)δ: 135.2 (C-6), 130.2 (C-7), 109.0 (C-22),102.3 (C-1???), 101.5 (C-1?), 100.3 (C-1?), 81.9 (C-5),80.4 (C-16), 78.3 (C-8), 77.9 (C-4?), 77.2 (C-2?), 76.2(C-5?), 73.5 (C-4???), 73.5 (C-4?), 73.3 (C-3), 72.2 (C-3?), 72.1 (C-3???), 72.0 (C-2???), 71.9 (C-2?), 69.9 (C-5?),69.0 (C-5???), 66.4 (C-26), 62.2 (C-17),60.6 (C-6?), 51.3(C-14), 51.0 (C-9), 41.9 (C-13), 41.0 (C-20), 39.1 (C-12), 37.0 (C-10), 34.5 ( C-1), 33.9 (C-4), 31.3 (C-2),30.0 (C-25), 29.5 (C-23), 28.7 (C-15), 28.5 (C-24), 22.8(C-11), 18.1 (C-6???), 18.0 (C-19), 17.8 (C-27), 16.8 (C-18), 16.5 (C-6?), 14.4 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[10]，故鑒定化合物5 為parisvanioside B。

化合物 6：白色無定型粉末，分子式為C44H66O17，，ESI-MSm/z:889 [M＋Na]+。1H-NMR (800 MHz, pyridine-d5)δ:6.41 (1H, s, H-1?), 6.29 (1H, s, H-6), 5.92 (1H, s, H-1???), 4.95 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1?), 1.79 (3H, d,J= 6.0 Hz, H3-6?), 1.33 (1H, s, H-19), 1.13 (3H, d,J= 7.0 Hz,H3-21), 0.83 (3H, s, H3-18), 0.67 (3H, d,J= 5.2 Hz, H3-27)；13C-NMR (200 MHz, pyridine-d5)δ: 185.3 (C-7),161.1 (C-5), 133.0 (C-9), 126.7 (C-6), 109.3 (C-1???),109.1 (C-22), 102.6 (C-1?), 101.5 (C-1?) 86.4 (C-4???),82.4 (C-2???), 81.8 (C-16), 77.9 (C-4?), 77.6 (C-3), 77.3(C-3???), 76.7 (C-3?), 76.7 (C-2?), 76.7 (C-5?), 73.8 (C-4?), 72.4 (C-3?), 72.3 (C-2?), 69.2 (C-5?), 66.5 (C-26),62.2 (C-5???), 61.1 (C-6?), 60.2 (C-17), 47.9 (C-14), 42.1(C-10), 42.0 (C-20), 40.4 (C-13), 38.4 (C-4), 35.5 (C-12), 34.4 (C-1), 32.9 (C-15), 31.6 (C-23), 31.5 (C-25),30.3 (C-2), 29.7 (C-24), 23.9 (C-11), 23.2 (C-19), 18.4(C-6?), 18.2 (C-27), 17.0 (C-18), 15.8 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[14]，故鑒定化合物6 為parisrugoside H。

化合物 7：白色無定型粉末，分子式為C45H72O18，，ESI-MSm/z:923 [M＋Na]+。1H-NMR (800 MHz, pyridine-d5)δ:6.38 (1H, s, H-1?), 5.28 (1H, brd,J= 4.1 Hz, H-6), 5.01(1H, d,J= 7.5 Hz, H-1?), 1.76 (3H, d,J= 6.3 Hz, H3-6?), 1.23 (3H, d,J= 7.2 Hz, H3-21), 1.05 (3H, s, H-19),0.95 (3H, s, H3-18), 0.67 (3H, d,J= 6.0 Hz, H3-27)；13C-NMR (200 MHz, pyridine-d5)δ: 140.5 (C-5), 121.5(C-6), 109.6 (C-22), 104.2 (C-1???), 101.5 (C-1?), 101.0(C-1?), 89.9 (C-17), 89.7 (C-16), 82.4 (C-4?),79.4 (C-5???), 78.0 (C-3???), 77.6 (C-3), 77.6 (C-3?), 77.4 (C-2?),77.0 (C-5?), 74.7 (C-2???), 73.9 (C-4?), 72.6 (C-3?), 72.3(C-2?), 71.5 (C-4???), 69.2 (C-5?), 66.6 (C-26), 62.4 (C-6???) , 62.2 (C-6?), 52.7 (C-14), 49.9 (C-9), 44.9 (C-20),44.5 (C-13), 38.7 (C-4), 37.3 (C-1), 36.9 (C-10), 32.1(C-7), 31.8 (C-15), 31.5 (C-12), 31.4 (C-8), 30.3 (C-25), 30.1 (C-2), 29.9 (C-23), 28.5 (C-24), 20.7 (C-11),19.2 (C-19), 18.4 (C-6?), 17.0 (C-27), 16.9 (C-18), 9.5(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[15]，故鑒定化合物7 為 (25R)-17α-羥基螺甾-5-烯-3β-基O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物 8：白色無定型粉末，分子式為C39H62O12，，ESI-MSm/z:745 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.36 (1H, d,J= 1.0 Hz, H-1?), 5.29 (1H, brd,J= 5.5 Hz, H-6), 5.02 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1?), 1.76 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.12 (3H, d,J= 7.0 Hz, H3-21), 1.03(3H, s, H3-19), 0.80 (3H, s, H3-18), 0.67 (3H, d,J= 5.5 Hz, H3-27；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.9(C-5), 121.8 (C-6), 109.3 (C-22), 102.1 (C-1?), 100.4(C-1?), 81.2 (C-16), 79.7 (C-2?), 78.3 (C-3), 78.0 (C-3?),77.9 (C-5?), 74.2 (C-4?), 72.9 (C-3?), 72.6 (C-2?), 71.8(C-4?), 69.6 (C-5?), 66.9 (C-26), 62.9 (C-17), 62.9 (C-6?), 56.7 (C-14), 50.3 (C-9), 42.0 (C-20), 40.5 (C-13),39.9 (C-12), 39.0 (C-4), 37.5 (C-1), 37.2 (C-10), 32.3(C-7), 32.3 (C-15), 31.9 (C-23), 31.7 (C-8), 30.6 (C-25), 30.2 (C-2), 29.3 (C-24), 21.2 (C-11), 19.5 (C-19),18.7 (C-6?), 17.4 (C-27), 16.4 (C-18), 15.1 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[16]，故鑒定化合物8 為麥冬皂苷C?。

化合物 9：白色無定型粉末，分子式為C45H72O17，，ESI-MSm/z:907 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.40 (1H, brs, H-1?), 5.30 (1H, brd,J= 5.1 Hz, H-6),5.11 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1???), 4.95 (1H, d,J= 7.2 Hz,H-1?), 3.96 (1H, m, H-3), 1.77 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.14 (3H, d,J= 7.0 Hz, H3-21), 1.10 (3H, s, H3-19), 0.82 (3H, s, H3-18), 0.69 (3H, d,J= 5.1 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5),121.9 (C-6), 109.3 (C-22), 104.6 (C-1???), 102.3 (C-1?),100.0 (C-1?), 89.6 (C-3?), 81.1 (C-16), 78.8 (C-5???), 78.6(C-3???), 77.9 (C-3), 77.7 (C-5?), 77.0 (C-2?), 75.0 (C-2???), 74.2 (C-4?), 72.8 (C-3?), 72.5 (C-2?), 71.5 (C-4???),69.6 (C-4?), 69.6 (C-5?), 66.9 (C-26), 62.9 (C-17), 62.4(C-6???), 62.4 (C-6?), 56.7 (C-14), 50.3 (C-9), 42.0 (C-20), 40.5 (C-13), 39.9 (C-12), 38.7 (C-4), 37.5 (C-1),37.1 (C-10), 32.3 (C-7), 32.2 (C-15), 31.8 (C-8), 31.7(C-23), 30.6 (C-25), 30.1 (C-2), 29.3 (C-24), 21.1 (C-11), 19.4 (C-19), 18.7 (C-6?), 17.4 (C-27), 16.4 (C-18), 15.1 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[17-18]，故鑒定化合物9 為纖細(xì)薯蕷皂苷。

化合物10：無色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 276～278 ℃，分子式為C44H70O16，，ESI-MSm/z: 877 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ: 6.28 (1H, d,J= 1.1 Hz, H-1?),5.92 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-1???), 5.29 (1H, brd,J= 5.5 Hz, H-6), 1.76 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.12 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-21), 1.03 (3H, s, H3-19), 0.81 (3H, s, H3-18), 0.68 (3H, d,J= 5.5 Hz, H3-27)；13C-NMR (126 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5), 121.8 (C-6), 109.6(C-1???), 109.3 (C-22), 102.0 (C-1?), 100.2 (C-1?), 86.7(C-4???), 82.7 (C-16), 81.1 (C-2???), 78.1 (C-3), 77.9 (C-5?), 77.7 (C-3???), 77.4 (C-2?), 77.0 (C-4?), 76.7 (C-3?),74.2 (C-4?), 72.8 (C-3?), 72.5 (C-2?), 69.5 (C-5?), 66.9(C-26), 62.9 (C-17), 62.5 (C-5???), 61.4 (C-6?), 56.6 (C-14),50.3 (C-9), 42.0 (C-20), 40.5 (C-13), 39.9 (C-12), 39.0 (C-4), 37.5 (C-1), 37.2 (C-10), 32.3 (C-7), 32.2 (C-15), 31.8(C-23), 31.7 (C-8), 30.6 (C-25), 30.2 (C-2), 29.3 (C-24),21.1 (C-11), 19.4 (C-19), 18.7 (C-6?), 17.3 (C-27), 16.4(C-18), 15.1 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[19-20]，故鑒定化合物10 為重樓皂苷I。

化合物 11：白色無定型粉末，分子式為C51H82O20，，ESI-MSm/z:1037 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.41 (1H, brs, H-1?), 6.30 (1H, brs, H-1????), 5.85 (1H,brs, H-1???), 5.31 (1H, brd,J= 5.0 Hz, H-6), 4.95 (1H,d,J= 7.0 Hz, H-1?), 1.77 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?),1.60 (1H, d,J= 2.7 Hz, H3-6???), 1.59 (1H, d,J= 2.8 Hz,H3-6????), 1.14 (3H, d,J= 6.9 Hz, H3-21), 1.05 (3H, s,H3-19), 0.83 (3H, s, H3-18), 0.69 (3H, d,J= 5.2 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5),121.9 (C-6), 103.4 (C-1???), 102.3 (C-1?), 102.3 (C-1????),100.4 (C-1?), 81.2 (C-16), 80.5 (C-2?), 78.1 (C-5?), 78.0(C-4???), 77.8 (C-4?), 77.7 (C-3), 77.1 (C-3?), 74.2 (C-4?), 74.1 (C-4????), 73.4 (C-2?), 72.9 (C-2????), 72.7 (C-3?), 72.6 (C-3????), 70.5 (C-3???), 69.6 (C-5?), 68.4 (C-5???), 66.9 (C-26), 62.9 (C-17), 61.3 (C-6?), 56.7 (C-14),50.3 (C-9), 42.0 (C-20), 40.5 (C-13), 39.9 (C-12), 39.0(C-4), 37.6 (C-1), 37.2 (C-10), 32.4 (C-7), 32.3 (C-15),31.9 (C-8), 31.7 (C-23), 30.7 (C-25), 30.2 (C-2), 29.3(C-24), 21.2 (C-11), 19.5 (C-19), 19.0 (C-6?), 18.7 (C-6???), 18.5 (C-6????), 17.4 (C-27), 16.4 (C-18), 15.1 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[21]，故鑒定化合物11 為重樓皂苷Ⅱ。

化合物12：白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 261～264 ℃，分子式為C39H62O13，，ESI-MSm/z: 761 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ: 6.38 (1H, brs, H-1?), 5.28 (1H,brd,J= 5.0 Hz, H-6), 1.77 (3H, d,J= 6.3 Hz, H3-6?),1.20 (3H, d,J= 7.1 Hz, H3-21), 1.08 (3H, s, H3-19),0.95 (3H, s, H3-18), 0.68 (3H, d,J= 5.6 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5), 121.8(C-6), 109.8 (C-22), 102.1 (C-1?), 100.3 (C-1?), 90.2(C-17), 90.0 (C-16), 79.7 (C-2?), 78.3 (C-5?), 77.9 (C-3), 77.8 (C-3?), 74.2 (C-4?), 72.9 (C-2?), 72.6 (C-3?),71.8 (C-4?), 69.5 (C-5?), 66.7 (C-26), 62.7 (C-6?) , 53.0(C-14), 50.2 (C-9), 45.2 (C-13), 44.8 (C-20), 39.0 (C-4), 37.6 (C-1), 37.2 (C-10), 32.5 (C-7), 32.4 (C-8), 32.1(C-15), 31.8 (C-12), 31.8 (C-23), 30.4 (C-25), 30.2 (C-2), 28.8 (C-24), 21.0 (C-11), 19.5 (C-19), 18.7 (C-6?),17.3 (C-27), 17.2 (C-18), 9.8 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[22]，故鑒定化合物12 為重樓皂苷Ⅵ。

按表1皮膚反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)結(jié)果，32例受試者中出現(xiàn)1級(jí)皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于5例，或2級(jí)皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于2例，或出現(xiàn)任何1例3級(jí)或3級(jí)以上皮膚不良反應(yīng)時(shí)，判定受試物對(duì)人體有皮膚不良反應(yīng)。

化合物 13：白色無定型粉末，分子式為C45H72O17，，ESI-MSm/z:907 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.35 (1H, brs, H-1?), 5.81 (1H, brs, H-1???), 1.71 (3H, d,J= 6.2 Hz, H3-6?), 1.60 (3H, d,J= 6.1 Hz, H3-6???), 1.21(3H, d,J= 7.1 Hz, H3-27), 1.05 (3H, s, H3-19), 0.93(3H, s, H3-18), 0.66 (3H, d,J= 5.7 Hz, H3-21)；13CNMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5), 121.9 (C-6), 109.9 (C-22), 102.9 (C-1???), 102.1 (C-1?), 100.2 (C-1?), 90.2 (C-17), 90.0 (C-16), 78.6 (C-2?),78.1 (C-4?),78.1 (C-5?), 77.9 (C-3), 76.9 (C-3?), 74.1 (C-4???), 73.9(C-4?), 72.8 (C-2?), 72.8 (C-3?), 72.7 (C-2???), 72.5 (C-3???), 70.4 (C-5???), 69.5 (C-5?), 66.7 (C-26), 62.5 (C-6?),53.0 (C-14), 50.2 (C-9), 45.2 (C-13), 44.8, (C-20), 38.9(C-4), 37.5 (C-10), 37.1 (C-1), 32.4 (C-12), 32.3 (C-7),32.1 (C-8), 32.1 (C-23), 31.8 (C-15), 30.4 (C-25), 30.1(C-2), 28.8 (C-24), 20.9 (C-11), 19.4 (C-19), 18.6 (C-6???), 18.5 (C-6?), 17.3 (C-27), 17.2 (C-18), 9.8 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[23]，故鑒定化合物13 為pennogenin 3-O-β-chacotrioside。

化合物 14：白色無定型粉末，分子式為C44H70O17，，ESI-MSm/z:893 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ:6.28 (1H, brs, H-1?), 5.92 (1H, brs, H-1???), 5.28 (1H,brd,J= 3.8 Hz, H-6), 4.94 (1H,J= 7.6 Hz, H-1?), 1.75(3H,J= 6.3 Hz, H3-6?), 1.22 (3H, d,J= 7.2 Hz, H3-21), 1.08 (3H, s, H3-19), 0.94 (3H, s, H3-18), 0.67 (3H,d,J= 5.9 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridined5)δ: 140.8 (C-5), 121.9 (C-6), 109.9 (C-1???), 109.7 (C-22), 102.0 (C-1?), 100.2 (C-1?), 90.2 (C-17), 90.1 (C-16), 86.7 (C-4???), 82.7 (C-2???), 78.1 (C-3???), 77.9 (C-3),77.8 (C-3?), 77.5 (C-2?) , 77.0 (C-5?), 76.8 (C-4?), 74.2(C-4?), 72.9 (C-3?), 72.5 (C-2?), 69.6 (C-5?), 66.8 (C-26), 62.5 (C-5???), 61.4 (C-6?), 53.1 (C-14), 50.3 (C-9),45.2 (C-13), 44.8 (C-20), 39.0 (C-4), 37.6 (C-1), 37.2(C-10), 32.5 (C-15), 32.4 (C-7), 32.1 (C-12), 32.1 (C-23), 31.9 (C-8), 30.5 (C-25), 30.2 (C-2), 28.9 (C-24),21.0 (C-11), 19.5 (C-19), 18.7 (C-6?), 17.4 (C-27), 17.2(C-18), 9.8 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[24]，故鑒定化合物14 為重樓皂苷H。

化合物15：白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 263～265 ℃，化學(xué)式為C51H82O21，，ESI-MSm/z: 1053 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5)δ: 6.41 (1H, brs, H-1?), 6.29 (1H,brs, H-1????), 5.85 (1H, brs, H-1???), 5.32 (1H, brd,J= 6.0 Hz, H-6), 1.76 (3H, d,J= 6.3 Hz, H3-6?), 1.60 (3H, d,J= 6.0 Hz, H3-6????), 1.59 (3H, d,J= 6.0 Hz, H3-6???),1.22 (3H, d,J= 7.3 Hz, H3-21), 1.08 (3H, s, H3-19),0.95 (3H, s, H3-18), 0.67 (1H, d,J= 5.6 Hz, H3-27)；13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5)δ: 140.8 (C-5), 121.9(C-6), 109.8 (C-22), 103.4 (C-1???), 102.2 (C-1?), 102.2(C-1????), 100.3 (C-1?), 90.2 (C-17), 90.0 (C-16), 80.4(C-4???), 78.0 (C-2?), 78.0 (C-4?), 77.8 (C-3), 77.7 (C-3?),77.0 (C-5?), 74.2 (C-4?), 74.1 (C-4????), 73.3 (C-3???),72.9 (C-3?), 72.9 (C-2???), 72.9 (C-3????), 72.7 (C-2????),72.6 (C-2?), 70.5 (C-5?"), 69.6 (C-5"), 68.3 (C-5???),66.7 (C-26), 61.2 (C-6?), 53.1 (C-14), 50.3 (C-9), 45.2(C-13), 44.8 (C-20), 39.0 (C-4), 37.6 (C-1), 37.6 (C-12), 37.2 (C-10), 32.5 (C-7), 32.4 (C-15), 32.1 (C-23),31.8 (C-8), 30.5 (C-25), 30.2 (C-2), 28.8 (C-24), 21.0(C-11), 19.5 (C-19), 18.9 (C-6""), 18.7 (C-6"), 18.5 (C-6???), 17.3 (C-27), 17.3 (C-18), 9.8 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[25]，故鑒定化合物15 為重樓皂苷Ⅶ。

化合物 16：白色無定型粉末，分子式為C27H44O7，，ESI-MSm/z:503 [M＋Na]+, 984 [2M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz,pyridine-d5)δ: 6.24 (1H, d,J=2.2 Hz, H-7), 4.22 (1H,m, H-3), 4.19 (1H, m, H-2), 3.87 (1H, m, H-22), 3.58(1H, m, H-9), 3.00 (1H, m, H-5), 2.99 (1H, m, H-17),1.58 (3H, s, H3-21), 1.36 (6H, s, H3-26,27), 1.21 (3H, s,H3-18), 1.06 (3H, s, H3-19)；13C-NMR (125 MHz,pyridine-d5)δ: 203.6 (C-6), 166.2 (C-8), 121.7 (C-7),84.2 (C-14), 77.6 (C-22), 76.9 (C-20), 69.6 (C-25), 68.2(C-2), 68.1 (C-3), 51.5 (C-5), 50.2 (C-17), 48.2 (C-13),42.7 (C-24), 38.7 (C-10), 38.0 (C-1), 34.5 (C-9), 32.5(C-4) ,32.1 (C-12), 31.8 (C-15), 30.2 (C-27), 30.0 (C-26), 27.5 (C-23), 24.5 (C-19), 21.7 (C-21), 21.5 (C-16),21.2 (C-11), 18.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[26]，故鑒定化合物16 為β-蛻皮激素。

4 抗細(xì)菌、真菌活性實(shí)驗(yàn)

對(duì)分到的化合物進(jìn)行抗細(xì)菌和抗真菌活性實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行活性評(píng)價(jià)[27]。

4.1 抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)

將單體化合物溶于DMSO 中，放入96 孔板中稀釋，在各孔中加入細(xì)菌菌液（大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌金黃亞種ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300），終濃度為5×105CFU/mL；設(shè)置培養(yǎng)基為空白對(duì)照、細(xì)菌對(duì)照以及頭孢他啶、青霉素G 鈉陽性藥對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)625 nm 吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)菌抑制率。

細(xì)菌抑制率＝(A空白對(duì)照－A實(shí)驗(yàn))/A空白對(duì)照

結(jié)果顯示，化合物1 和3～16 均對(duì)大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌金黃亞種ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300 無明顯抑制作用，在化合物濃度為100 μmol/L 時(shí)，其抑制率低于50%。

4.2 抗真菌實(shí)驗(yàn)

將化合物溶于DMSO 中，放入96 孔板中稀釋，在各孔中加入真菌菌液（絮狀表皮癬菌CBS 566.94、紅色毛癬菌ATCC4438、石膏樣小孢子菌CBS118893、白色念珠菌氟康唑耐藥株），終濃度為1×105CFU/mL（白色念珠菌氟康唑耐藥株）和5×105CFU/mL（絲狀真菌）；設(shè)置培養(yǎng)基為空白對(duì)照、真菌對(duì)照以及兩性霉素B、鹽酸特比萘芬陽性藥對(duì)照。白色念珠菌氟康唑耐藥株37 ℃培養(yǎng)24 h，絲狀真菌25 ℃培養(yǎng)5 d，酶標(biāo)儀檢測(cè)625 nmA值，計(jì)算真菌抑制率。

真菌抑制率＝(A空白對(duì)照－A實(shí)驗(yàn))/A空白對(duì)照

當(dāng)濃度為100 μmol/L 時(shí)，化合物3 對(duì)絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌抑制率為70%～74%；化合物5、6、8、9 對(duì)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌的抑制率為65%～96%；化合物7、10～15 對(duì)白色念珠菌氟康唑耐藥株、絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌的抑制率為54%～100%（表1）。故進(jìn)一步對(duì)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌有抑制活性的化合物進(jìn)行50%最低抑菌濃度（50% minimun inhibitory concentration，MIC50）測(cè)試，結(jié)果顯示，化合物3、5～15 對(duì)絮狀表皮癬菌有較強(qiáng)抑制作用（表2），MIC50為0.07～93.60 μmol/L；化合物5～15 對(duì)紅色毛癬菌有較強(qiáng)抑制作用（表3），MIC50為0.06～73.08 μmol/L；化合物3、5～8、10～15 對(duì)石膏樣小孢子菌有很強(qiáng)的抑制作用（表4），MIC50為0.04～69.92 μmol/L。

表1 騰沖重樓化合物對(duì)4 種真菌的抑制作用 (n = 3)Table 1 Inhibitory effects of compounds from P.tengchongensis on four strains of fungi (n = 3)

表2 化合物對(duì)絮狀表皮癬菌的MIC50 值 (n = 3)Table 2 MIC50 values of compounds against Epidermophyton floccosum (n = 3)

表3 化合物對(duì)紅色毛癬菌的MIC50 值 (n = 3)Table 3 MIC50 values of compounds against Trichophyton rubrum of (n = 3)

5 討論

為了更進(jìn)一步發(fā)掘其利用價(jià)值，本研究對(duì)騰沖重樓正丁醇萃取物進(jìn)行系統(tǒng)的研究。通過對(duì)騰沖重樓根莖的提取、分離，共得到16 個(gè)化合物，其中化合物1～7 為首次從騰沖重樓中分離得到，豐富了騰沖重樓的化學(xué)成分類型。

前人僅報(bào)道了騰沖重樓中化合物的細(xì)胞毒活性[9]，本研究較系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了該物種中化合物的抗細(xì)菌和抗真菌活性。研究顯示滇重樓甲醇提取物可抑制宋內(nèi)氏痢疾桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 個(gè)化合物均對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用。皮膚癬菌是常見的臨床病原真菌，會(huì)引起人類頭發(fā)、皮膚及指趾甲的感染，可用兩性霉素B、鹽酸特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑等藥物進(jìn)行治療[29]，但重樓皂苷進(jìn)行抗皮膚癬菌方面的研究較少，故進(jìn)行抗皮膚癬菌方面的研究。陸克喬等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓的正丁醇提取物能有效抑制體外白色念珠菌的生物膜形成，可抑制白色念珠菌?；衔?、12～15 對(duì)白色念珠菌氟康唑耐藥株抑制率可達(dá)100%?；衔?1 對(duì)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌抑菌效果最好，MIC50值分別為0.07、0.06、0.04 μmol/L。目前只對(duì)騰沖重樓進(jìn)行抗菌活性的研究，后續(xù)可進(jìn)行細(xì)胞毒活性等的測(cè)試，使對(duì)騰沖重樓的研究更加全面。騰沖重樓化合物對(duì)深部真菌白色念珠菌氟康唑耐藥株和3 種皮膚癬菌有較好的抑制作用，為今后對(duì)騰沖重樓治療皮膚及深部真菌感染疾病方面的開發(fā)利用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突