黑老虎果實(shí)中1 個(gè)新的聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素

劉 健 ，陶袁志，吳沁昱，馬 靜，陳俐親，吳文明，金 岸 *

1.南華大學(xué)藥學(xué)院，湖南 衡陽 421200

2.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化 418000

3.江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）藥學(xué)部，江西 南昌 330006

黑老虎Kadsuracoccinea(Lem.) A.C.Smith 為五味子科南五味子屬常綠木質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)于中國南部[1]，其根莖在民間常用來治療胃腸疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從黑老虎中分離得到的化學(xué)成分有三萜、倍半萜、木脂素、甾體、單萜和氨基酸類等[4]。其中，木脂素和三萜類成分作為黑老虎的主要化學(xué)成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗艾滋病病毒和保肝等功效[5-7]。目前，對(duì)于黑老虎化學(xué)成分的研究主要集中在根和藤莖上，而對(duì)于果實(shí)部位研究相對(duì)較少。

黑老虎果實(shí)民間又被稱為“血藤果”“布福娜”“冷飯團(tuán)”。黑老虎果實(shí)除含有豐富的維生素、氨基酸及多種微量元素外，還具有廣泛的藥用價(jià)值[8]，因此可作為一種功能性水果進(jìn)行開發(fā)利用。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，黑老虎果實(shí)中提取到的木脂素類成分具有一定的抗艾滋病病毒[9]及保肝活性[10]，多酚與花色苷類成分具有抗氧化活性[11]。為進(jìn)一步揭示黑老虎果實(shí)中的化學(xué)成分，豐富黑老虎化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型，本實(shí)驗(yàn)從干燥的黑老虎果實(shí)中分離鑒定了11 個(gè)單體化合物（圖1），其中，化合物1 為新化合物，鑒定為 (aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-芐酰氧基-7,7',8,8'-四氫-4,5-亞甲二氧基-3,3',4',5',7'-五甲氧基-8,8'-二甲基-二苯并[a,c]環(huán)辛烯 ｛(aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-dibenzoyloxy-7,7',8,8'-tetrahydro-4,5-methylenedioxy-3,3',4',5',7'-pentamethoxy-8,8'-dimethyl-dibenzo[a,c]cycloocten，1｝，已知化合物分別鑒定為3,4-二羥基-3',4'-二甲氧基-6,7'-環(huán)木脂素（3,4-dihydroxy-3',4'-dimethoxy-6,7'-cyclolignan，2）、kadsuralignan H（3）、(＋)-(8S,8'R)-4,4'-二羥基-3,3',5'-三甲氧基木脂烷 [(＋)-(8S,8'R)-4,4'-dihydroxy-3,3',5'-trimethoxylignan，4]、前戈米辛（pregomisin，5）、松脂醇（pinoresinol，6）、aromadendrane-4β,10β-diol（7）、nephthediol（8）、oplodiol（9）、1β,11-dihydroxy-5-eudesmene（10）、pubinernoid A（11）?；衔? 命名為血藤果素A，化合物2、4、7～11 為首次從該屬中分離得到。同時(shí)，對(duì)分離得到的11 個(gè)單體化合物開展了抗炎活性評(píng)價(jià)。

圖1 化合物1～11 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1—11

1 儀器與材料

LTQ-Orbitrap XL 質(zhì)譜儀（賽默飛公司，美國）；Bruker Avance（400、500 MHz）核磁共振波譜儀（布魯克公司，德國）；Autopol Ⅳ型旋光儀（魯?shù)婪蚬?，美國）；J-810 型圓二色光譜儀（佳司科公司，日本）；快速純化制備色譜儀（三泰科技有限責(zé)公司，常州）；柱色譜硅膠（40～63 μm，三泰科技有限責(zé)公司，常州）；Sephadex LH-20 凝膠（GE 公司，美國）；MCI 小孔樹脂（75～150 μm，三菱化學(xué)，日本）；Easysep-3030 Unimicro 全自動(dòng)高效液相色譜儀（通微公司，上海）；MULTISKAN MK3 酶標(biāo)儀（賽默飛公司，美國）；十八烷基硅烷鍵合填料（C18，50 μm，YMC 公司，日本）；SHIMADZU LC-20A 制備液相色譜儀（島津公司，日本）；色譜柱ZORBAX Bonus-RP（150 mm×21.2 mm，7 μm，安捷倫公司制備柱，美國）及Eclipse XDB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司半制備柱，美國）；色譜級(jí)甲醇（邁瑞達(dá)公司）；分析純?cè)噭▕W普升化工有限公司，天津）。DMEM（批號(hào)SH30243.01B，Hyclone公司，美國），胎牛血清（批號(hào)SH30084.03，Hyclone公司，美國）；PBS（批號(hào)C10010500BT，Life 科技公司，美國），胰酶（批號(hào)25200072，GIBCO 公司，美國），MTT（批號(hào)M5655-1G，Sigma 公司，上海）；L-NIL（批號(hào)HY-12116，MCE 公司，美國）；總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0023，上海碧云天公司）。

樣品于2018 年采自湖南省懷化市通道縣，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院汪冶教授鑒定為南五味子屬植物黑老虎K.coccinea(Lem.) A.C.Smith 的成熟果實(shí)。樣品（201801）保存于湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院。

2 方法

2.1 提取與分離

取黑老虎干燥果實(shí)（32 kg），粉碎后加入75%的乙醇冷浸提取4 次，濃縮得到粗提物浸膏。加適量水將浸膏混懸，用石油醚萃取5 次并收集萃取液，濃縮得到石油醚部位的浸膏1.2 kg。石油醚浸膏用硅膠拌樣后經(jīng)硅膠柱色譜粗分，以石油醚-醋酸乙酯（15∶1～0∶1）梯度洗脫得到12 個(gè)組分（Fr.A～L）。

Fr.B（205 g）首先用MCI 柱（甲醇～水1∶3→1∶0）分離成4 個(gè)部分Fr.B1～B4。Fr.B1（50 g）用快速純化制備色譜儀經(jīng)ODS 色譜柱（甲醇～水1∶4→1∶0）得到餾分Fr.B1-1～B1-11，其中Fr.B1-5 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱（二氯甲烷～甲醇1∶1）色譜分離得到2 個(gè)組分Fr.B1-5-1 和Fr.B1-5-2，F(xiàn)r.B1-5-2 經(jīng)反相制備型高效液相色譜（65%甲醇）得到化合物2（10.5 mg）和5（13.2 mg）；Fr.B1-8 經(jīng)半制備HPLC 分離得到化合物1（6.5 mg，tR＝5.5 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）、化合物3（7.4 mg，tR＝6.1 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）和Fr.B1-8-1（14.4 mg，tR＝12.3 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min），F(xiàn)r.B1-8-1 再經(jīng)半制備色譜柱反復(fù)純化得到化合物4（6.2 mg，tR＝19.8 min；甲醇-水55∶45，3.3 mL/min）和化合物6（6.8 mg，tR＝17.8 min；甲醇-水55∶45，3.3 mL/min）。Fr.C 浸膏（140 g）通過MCI 梯度洗脫（甲醇-水1∶3→1∶0）后得到6 個(gè)組分Fr.C1～C6，其中的Fr.C3 經(jīng)Sephadex LH-20（二氯甲烷-甲醇1∶1）柱色譜分離到4 個(gè)組分Fr.C3-1～C3-4，F(xiàn)r.C3-2 經(jīng)ODS 色譜柱（甲醇-水1∶4→1∶0）梯度洗脫得到4 個(gè)組分Fr.C3-2-1～C3-2-4，F(xiàn)r.C3-2-2 經(jīng)半制備HPLC 得到化合物9（9.3 mg，tR＝10.8 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min）和10（8.5 mg，tR＝15.8 min；甲醇-水60∶40，3 mL/min），F(xiàn)r.C3-2-3 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物8（11.3 mg）；Fr.C3-3 經(jīng)ODS 開放柱（甲醇-水1∶3→1∶0）及半制備HPLC 進(jìn)一步純化得到化合物7（7.4 mg，tR＝10.4 min；甲醇-水65∶35，3 mL/min）和11（6.7 mg，tR＝13.5 min；甲醇-水65∶35，3 mL/min）。

2.2 抗炎活性測(cè)定

2.2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 取正常生長的RAW264.7 細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。以添加不含藥物的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以分別加入終濃度為100 μmol/L 的待測(cè)樣品（1～11）為給藥組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。采用MTT 法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞存活率。若化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞有毒性，則選擇更低濃度重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，直至篩選到對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無明顯毒性的濃度，再以此濃度進(jìn)行抗炎活性實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 抗炎活性篩選 取正常生長的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。誘導(dǎo)型NO合成酶抑制劑（L-NIL）為陽性對(duì)照。設(shè)置空白對(duì)照組、LPS（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）＋L-NIL（30 μmol/L）組和LPS（1 μg/mL）＋化合物1～11（化合物3、5 用20 μmol/L，化合物2、4 用50 μmol/L，其余用100 μmol/L），培養(yǎng)24 h 后，收集上清液，按照NO 試劑盒說明書檢測(cè)NO 含量。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR 和13C-NMR 譜中（表1）顯示2 個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)δH6.53 (1H, s, H-6), 6.63 (1H, s, H-6') 和12 個(gè)芳香碳信號(hào)δC133.4 (C-1), 121.4 (C-2), 141.7(C-3), 136.2 (C-4), 148.6 (C-5), 102.8 (C-6), 133.0 (C-1'), 123.7 (C-2'), 151.9 (C-3'), 141.7 (C-4'), 152.1 (C-5'), 111.1 (C-6')，5 個(gè)甲氧基信號(hào)δH3.86 (3H, s), 3.09(3H, s), 3.58 (3H, s), 3.99 (3H, s), 3.04 (3H, s)，1 個(gè)亞甲二氧基質(zhì)子信號(hào)δH5.96 (2H, overlapped)，由此推測(cè)化合物1 中存在聯(lián)苯基團(tuán)。在1H-1H COSY 譜（圖2）中可看出-CH (H-7)-CH (H-8)-CH (H-8')-CH(H-7')-，-CH (H-8)-CH3(H-9)-和-CH (H-8')-CH3(H-9')-3 個(gè)相連片段；HMBC 譜（圖2）中H-7 與C-2, 6相關(guān)，H-6'與C-7'相關(guān)，H-9 同C-7, 8, 8'相關(guān)，H-9'同C-7', 8'存在相關(guān)信號(hào)。以上數(shù)據(jù)表明化合物1具有聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素的基本骨架。此外，1H NMR 譜中證實(shí)化合物中還存在2 個(gè)甲基信號(hào)δH1.08 (3H, d,J= 7.3 Hz, H-9) 和1.03 (3H, d,J= 7.2 Hz, H-9')；13C NMR 譜中還顯示存在1 組芐酰氧基信號(hào)δC166.0 (C-1''), 129.8 (C-2''), 129.9 (C-3'', 7''),128.2 (C-4'', 6''), 132.1 (C-5'')[12]。

表1 化合物1 的1H- 和13C-NMR 數(shù)據(jù) (400/100 MHz, CDCl3)Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (400/100 MHz, CDCl3)

圖2 化合物1 的結(jié)構(gòu)以及主要HMBC、1H-1H COSY 相關(guān)Fig.2 Structure of compound 1 and key HMBC, 1H-1H COSY correlations

結(jié)合HMBC 譜分析，5 個(gè)甲氧基信號(hào)分別與C-3、C-3'、C-4'、C-5'、C-7'相關(guān)，由此確定5 個(gè)甲氧基分別位于C-3、C-3'、C-4'、C-5'和C-7'。亞甲二氧基質(zhì)子信號(hào)與C-4 和C-5 有關(guān)聯(lián)表明該基團(tuán)連在C-4 和C-5 位上。H-7 (δH6.05, 1H, s) 和C-1''(δC166.0) 的HMBC 相關(guān)性證實(shí)了C-7 上存在芐酰氧基。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析得到化合物1 的平面結(jié)構(gòu)。CD 譜中顯示在225 nm 附近呈現(xiàn)正的Cotton 效應(yīng)，240 nm 附近則呈現(xiàn)負(fù)值，表明1 具有S-聯(lián)苯構(gòu)型[13]。同時(shí)在NOESY 譜中（圖3）顯示H-6 與H-7, H-8 相關(guān)，H-6'與H-7', H3-9'相關(guān)，以及H3-9 與H3-9'相關(guān)，表明H-7'，CH3-9'和CH3-9 是α 構(gòu)型，H-7 是β 構(gòu)型，化合物1 中的環(huán)辛二烯結(jié)構(gòu)符合扭曲船椅式[14]，其絕對(duì)構(gòu)型為：C-7 (R), C-8 (R), C-8'(S), C-7'(R)。故化合物1 的結(jié)構(gòu)鑒定為(aS,7R,8R,8'S,7'R)-7-芐酰氧基-7,7',8,8'-四氫-4,5-亞甲二氧基-3,3',4',5',7'-五甲氧基-8,8'-二甲基-二苯并[a,c]環(huán)辛烯。經(jīng)Scifinder 數(shù)據(jù)庫檢索為新化合物，命名為血藤果素A。

圖3 化合物1 的重要NOESY 相關(guān)Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

3.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

3.2.1 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 采用MTT 法，首先測(cè)定了在100 μmol/L 濃度下化合物1～11 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明（圖4），在100 μmol/L 濃度下，化合物3 和5 顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，RAW264.7 細(xì)胞的存活率分別為2.00%和12.38%；化合物2 和4 具有一定的細(xì)胞毒性，RAW264.7 的存活率分別為75.32%和63.73%。因此，選擇更低濃度測(cè)定化合物2～5 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性。最終，化合物2 和4 在50 μmol/L 下，化合物3 和5 在20 μmol/L 下對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無明顯毒性。

圖4 RWA264.7 細(xì)胞化合物1～11 作用下的存活率Fig.4 Survival rates of RWA264.7 cells under effects of compounds 1—11

圖 5 化合物1～11 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RWA264.7 細(xì)胞生成NO的影響Fig.5 Effect of compounds 1-11 on NO production in RWA264.7 cells induced by LPS

3.2.2 抗炎活性的評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)選擇化合物3、5 濃度為20 μmol/L，化合物2、4 濃度為50 μmol/L，其余化合物濃度為100 μmol/L。結(jié)果表明（圖5），與LPS 組相比而言，所有的化合物對(duì)NO 的釋放都有一定的抑制效果，其中化合物4 在抑制NO 釋放上展示出更好的效果，抑制率為64.45%。30 μmol/L 的L-NIL 作為陽性對(duì)照，抑制率為74.57%。

4 討論

本研究從黑老虎果實(shí)的乙醇提取物中分離得到11 個(gè)多種類型的化合物包括1 個(gè)新的聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素、2 個(gè)環(huán)木脂素、2 個(gè)簡(jiǎn)單木脂素、1 個(gè)雙環(huán)氧木脂素、4 個(gè)倍半萜及1 個(gè)單萜，充分的表明黑老虎果實(shí)中存在木脂素和萜類等化學(xué)成分。同時(shí)，本次研究發(fā)現(xiàn)，在100 μmol/L 時(shí)，化合物3 和5 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性。在濃度為50 μmol/L，無細(xì)胞毒性的條件下，化合物4 在抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 上表現(xiàn)出較好的效果，表明具有一定的抗炎活性。此外，黑老虎果實(shí)中除含有豐富的木脂素外，萜類成分也需得到足夠的關(guān)注，值得進(jìn)行深入研究，同時(shí)也為后續(xù)資源利用和產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突