等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于蝦肝腸孢蟲檢測的研究進(jìn)展

譚念秋，魏春梅，文鈺淞，范曉東

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400000)

目前，對蝦養(yǎng)殖業(yè)是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要組成部分，產(chǎn)值超過260億美元[1-2]。但在養(yǎng)殖過程中，對蝦一直受到各種病原(真菌、細(xì)菌、病毒、寄生蟲等)的威脅，如蝦肝腸孢蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)等[3]。EHP隸屬于腸孢蟲屬(Enterocytozoon)，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，主要感染對蝦肝胰腺上皮細(xì)胞[4]，傳播途徑可分為水平傳播和垂直傳播。從幼蝦到成蝦的各成長階段均會感染EHP，雖然感染后的對蝦不會死亡，但會出現(xiàn)攝食減少、生長緩慢等病癥[5]。目前尚無有效治療EHP感染的特效藥，導(dǎo)致該病難以防治，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[6-7]，如2014—2015年印度對蝦產(chǎn)業(yè)因受EHP感染，年產(chǎn)量減少10%～20%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)千萬美元[8]。

近年來，EHP在中國、委內(nèi)瑞拉、泰國、馬來西亞、越南等國家大面積暴發(fā)[9-11]，在尚未發(fā)現(xiàn)有效治療EHP方法的情況下，對其進(jìn)行預(yù)防檢測就顯得尤為重要。EHP的檢測手段主要包括組織病理學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測，其中屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域中的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因具有簡便性、低成本、較高的靈敏度和特異性等優(yōu)點(diǎn)而成為重要的田間檢測技術(shù)。為此，本文擬對EHP的常規(guī)檢測方法進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)和重組酶等溫?cái)U(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)檢測技術(shù)及其在EHP檢測中的應(yīng)用，以期能在EHP感染早期進(jìn)行陽性篩查，為EHP的高效防治提供理論參考。

1 EHP的檢測方法

在EHP感染早期，宿主無明顯、特定的病理特征，因此無法通過直觀視覺診斷EHP感染，需要借助現(xiàn)有的光學(xué)儀器設(shè)備及相關(guān)的分子檢測手段。目前，EHP的檢測方法主要包括組織病理學(xué)、原位雜交以及分子生物學(xué)等。

組織病理可通過光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡對感染的組織切片進(jìn)行觀察[4]，而各種染色技術(shù)的應(yīng)用則使感染肝胰腺組織中的EHP能被更清晰地觀察到[12]。但組織病理學(xué)觀察適用于感染后期，EHP感染早期的組織切片因無明顯感染的組織學(xué)跡象，容易產(chǎn)生漏檢而導(dǎo)致檢測人員錯誤判斷，如Salachan P V等[13]研究發(fā)現(xiàn)，組織病理學(xué)觀察無法判斷是否感染了微孢子蟲，但其核酸檢測為強(qiáng)陽性。Zhao R H等[14]利用熒光染色劑鈣熒光白(Calcofluor white，CFW)對EHP進(jìn)行檢測，結(jié)果表明其可快速檢測懸液、糞便中的EHP孢子，但該方法特異性和靈敏度較差。組織病理學(xué)觀察適用范圍有限，容易造成假陰性，只能作為輔助性的EHP檢測方案。

原位雜交常作為一種輔助組織病理檢測的手段而被應(yīng)用于EHP的檢測[15-18]。如Tangprasittipap A等[18]利用地高辛標(biāo)記探針，開發(fā)了一種用于EHP檢測的原位雜交方法，其具有良好的靈敏度和特異性。但該方法操作復(fù)雜，無法在現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，需在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行使用。

EHP的分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時熒光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，RT-PCR)、等溫?cái)U(kuò)增方法(LAMP和RPA)、數(shù)字PCR等。PCR是世界動物衛(wèi)生組織方案中概述的許多蝦病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，在EHP檢測中常用的方法主要有巢式PCR[18]和一步法PCR[19]。目前，在EHP的檢測中，研究者常用SSU-rRNA和SWP等基因作為檢測靶標(biāo)[15-20]。其中SSU-rRNA作為檢測靶標(biāo)是早期主要的PCR檢測方法，但存在特異性低等問題，而現(xiàn)在的研究以SWP和β-tubeulin等為檢測靶標(biāo)[21]，有效地提高了PCR檢測的特異性。汪浩等[22]基于EHP孢壁蛋白建立了熒光定量檢測體系，該方法在5.02×101～5.02×108copies/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；馬來等[23]研發(fā)了基于TaqMan-MGB探針的熒光定量檢測方法，對蝦樣品的檢測下限為10 copies/mg；Zhang H等[24]建立了靈敏、準(zhǔn)確的雙鏈液滴數(shù)字PCR(ddPCR)方法，可以同時檢測和定量兩種病原體，其中EHP的檢測下限為2.3 copies/μL，極大地提高了檢測靈敏度。采用PCR、熒光定量PCR以及數(shù)字PCR檢測EHP時，需要借助聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀、數(shù)字PCR檢測儀等儀器，因而只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，無法在田間進(jìn)行快速檢測。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是基于傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法而發(fā)展起來的，通過水浴鍋、恒溫儀等設(shè)備，在恒溫條件下快速放大目的基因，操作簡單，具有發(fā)展為快速高效的現(xiàn)場檢測方法的潛力。目前用于EHP的等溫檢測技術(shù)主要包括LAMP和RPA等[25]。陳進(jìn)會等[26]基于18S基因建立了檢測EHP的LAMP檢測方法；黃紀(jì)徽等[27]分別以EHP的SWP和SSU-rRNA為靶標(biāo)建立了實(shí)時熒光RPA檢測方法。

隨著科技發(fā)展，研究人員對以上檢測方法進(jìn)行了持續(xù)改良，以期尋找到特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法，但各種技術(shù)手段都存在明顯的優(yōu)缺點(diǎn)(表1)，在進(jìn)行檢測時，應(yīng)根據(jù)需求選擇最佳的實(shí)驗(yàn)方法。Thawatchai C等[3]比較了幾種檢測EPH的技術(shù)，其中巣氏PCR、RT-PCR、LAMP、RPA的靈敏度最高，各種檢測技術(shù)的特異性與靶標(biāo)基因相關(guān)，其中PTP2和SWP基因的特異性最佳，而組織病理學(xué)的靈敏度和特異性相對較差，因此靶標(biāo)基因的選擇與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改良同等重要。

表1 EHP常規(guī)的檢測技術(shù)比較Tab.1 Comparison of detection techniques for EHP

2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過程始終保持恒溫狀態(tài)，通過添加不同活性的酶和特異性引物達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的，因其具有高靈敏度、高特異性、低成本、操作方便等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于檢測食源性和環(huán)境病原體，但LAMP和RPA并未被大范圍應(yīng)用。隨著對交叉學(xué)科研究的增多，研究者結(jié)合熒光染料、探針等手段對LAMP和RPA的方法進(jìn)行改良，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域。

2.1 LAMP研究進(jìn)展

LAMP是一種能在恒定溫度下，利用特異性引物和具有鏈置換特性的Bst.DNA聚合酶快速擴(kuò)增的技術(shù)，具有低成本、檢測操作簡單快捷、特異性強(qiáng)和靈敏度高[25]等特點(diǎn)，是能夠被推廣并應(yīng)用到田野上的檢測技術(shù)。常規(guī)的LAMP存在較多的缺點(diǎn)，如擴(kuò)增后產(chǎn)物不易被分析[28]、缺乏特異性高且成本較低的染料、擴(kuò)增產(chǎn)物容易造成氣溶膠污染、導(dǎo)致假陽性[29]等。

為彌補(bǔ)LAMP的不足，研究者們將各種染料加入LAMP反應(yīng)中，Wu C等[30]通過在LAMP體系中加入顯色靈敏的金屬指示劑羥基萘酚藍(lán)(HNB)，建立了一種快速可視化檢測金黃色葡萄球菌的方法，這是一種有巨大潛力的快速診斷金黃色葡萄球菌感染的技術(shù)手段。常規(guī)的LAMP檢測只關(guān)注基因擴(kuò)增后的結(jié)果，而熒光實(shí)時定量方法不僅可以實(shí)時觀察基因擴(kuò)增情況，且可以對基因進(jìn)行定量分析，能更加直觀地獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[31]。Gadkar V J等[32]在環(huán)引物的3’端連接了一個羧基熒光素基團(tuán)，探針僅在與靶標(biāo)結(jié)合時發(fā)出熒光，而在未結(jié)合狀態(tài)時淬滅，可更直觀地觀察擴(kuò)增結(jié)果；Elbeaino T等[33]將Taqman熒光探針應(yīng)用于LAMP中，結(jié)果顯示該方案有效地提高了LAMP的特異性，避免了假陽性；Lin F等[34]設(shè)計(jì)了一種雙重逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)橫溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動試紙條(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification and lateral flow dipstick，RT-LAMP-LFD)檢測法來檢測引起蝦白尾病的羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)諾達(dá)病毒(MrNV)與超小型病毒(XSV)，將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記在內(nèi)引物FIP的5’端上，該方法的特異性強(qiáng)和靈敏度高。

2.2 RPA的研究進(jìn)展

RPA是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在等溫條件下(最佳溫度37 ℃)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)[35-36]。近年來，由于RPA的檢測時間極短，因此許多研究者將其應(yīng)用于病原微生物的檢測。如Kersting S等[37]利用RPA的原理發(fā)明了一種能同時進(jìn)行多重檢測的芯片，可在20 min內(nèi)檢測不同的病原體，其對金黃色葡萄球菌和腸道沙門氏菌的檢出限均為10 cfu；Kim T H等[38]開發(fā)了一種用于檢測牛奶樣品中沙門氏菌的離心微流體設(shè)備，該設(shè)備可在30 min內(nèi)以全自動工作流程完成DNA提取、RPA反應(yīng)和產(chǎn)品檢測等過程。

與LAMP相同的是，RPA常規(guī)的結(jié)果分析方法為電泳檢測，因此其無法被用于快速檢測。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者們將RPA與CRISPR-Cas12a結(jié)合，再應(yīng)用于微小隱孢子[39]、非洲豬瘟[40]、支原體[41]以及(SARS)-CoV-2[42]的現(xiàn)場快速檢測。此外Wang Y等[43]建立的RPA側(cè)向流試紙條(RPA-LFS)方法通過在RPA反應(yīng)系統(tǒng)的5’端添加異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的探針、用生物素標(biāo)記反向引物的5’端，將其作為擴(kuò)增產(chǎn)物在試紙條上反應(yīng)時的比色指示劑，結(jié)果表明RPA與試紙條的結(jié)合進(jìn)一步提高了該技術(shù)的靈敏度和特異性，其對病原體檢測下限為1 cfu/μL。Ge R等[44]研究了RPA與光電化學(xué)(Photoelectrochemistry，PEC)生物傳感器結(jié)合的技術(shù)(RPA-PEC)，這也為便捷檢測病原奠定了基礎(chǔ)。

3 應(yīng)用于檢測EHP的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

3.1 LAMP對EHP的檢測

自從發(fā)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能低成本且快速靈敏地檢測EHP，研究者們便將研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的改良上，試圖找到一種最佳的檢測方案，以實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)場快速、準(zhǔn)確地可視化檢測EHP。為實(shí)現(xiàn)此目的，研究者們將LAMP與熒光染料結(jié)合起來，并進(jìn)行了諸多探索。如Ma B等[45]將SYTO-16 DNA結(jié)合染料應(yīng)用于LAMP，開發(fā)出一種新的技術(shù)——實(shí)時定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Quantitative loop-mediated isothermal amplification，qLAMP)，其既能實(shí)時觀察，也能有效提高EHP檢測的靈敏度；Kumar T S 等[46]利用SYBRTMgreen Ⅰ染料在封閉管系統(tǒng)中目視檢測擴(kuò)增的LAMP產(chǎn)物，建立了一種可視化的LAMP方法，在農(nóng)場水平診斷EHP方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。由于EHP可通過水體傳播和親本垂直傳播，因此在孵化前篩選親本、在蝦池放養(yǎng)前篩選幼體、檢測自然攜帶者對對蝦健康養(yǎng)殖十分重要。在對蝦養(yǎng)殖過程中，除了EHP外，其他病原也會造成對蝦生長異常，如白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、十足類虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1，DIV1)，對蝦在患病時免疫力會隨之下降，更容易感染其他病原體。Hu K S等[47]建立了一種能以特異性檢測EHP、WSSV、DIV1病原的基于LAMP的微流控芯片技術(shù)，其能同時檢測蝦體內(nèi)的多種病原，最大程度地節(jié)約時間和成本，滿足快速檢測的需求。李英瑕等[48]設(shè)計(jì)了一種基于LAMP原理的EHP現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其滿足了靈敏度、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及簡便快捷的現(xiàn)場檢測要求，可被用于對蝦養(yǎng)殖場EHP的檢測。

3.2 RPA對EHP的檢測

在EHP檢測中，RPA對溫度的要求比LAMP低，但檢測速度更快。2020年，Zhou S H等[49]首次將RPA應(yīng)用于蝦EHP的檢測，實(shí)驗(yàn)表明RPA在30 ℃恒溫、反應(yīng)40 min條件下，即可出檢測結(jié)果，且無交叉反應(yīng)，但其靈敏度與PCR相當(dāng)，而低于RT-PCR。Kanitchinda S等[50]將RPA和CRISPR-Cas12a結(jié)合，最低可以檢測到50個拷貝的DNA，雖然這個過程需要在37 ℃下反應(yīng)1 h，但是可以通過紫外/藍(lán)光激發(fā)或者橫向流動進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)肉眼觀察的可能。Li G等[51]開發(fā)了一種實(shí)時RPA方法，其條件為38.5 ℃反應(yīng)15 min，檢測限達(dá)到10 copies/μL DNA。Ma C等[52]將熒光分析與RPA系統(tǒng)相結(jié)合，可在39 ℃、3～7 min內(nèi)快速檢測EHP，且能達(dá)到每個反應(yīng)12 copies/μL DNA，有效地縮短了檢測的時間、保證了檢測的質(zhì)量。Yang L H等[53]將激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)的核酸酶PfAgo與RPA結(jié)合，將靈敏度提高到了單拷貝，是目前靈敏度最高的分子檢測方法。

近些年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)體系的靈敏度、特異性以及便攜性顯著提高。在EHP檢測中，靶標(biāo)基因的選擇十分重要，優(yōu)良特異的靶標(biāo)可以有效地提高檢測的靈敏度和特異性，以便更早地診斷出EHP的感染，有利于早期防治。目前，EHP的分子檢測主要是以SSU-rRNA[15]、SWP[20]、PTP2[54]、18S[25]、β-tubulin[21]為靶標(biāo)基因，其中SWP、PTP2特異性較高，適合用于各種檢測方案的建立。隨著對EHP研究的不斷深入，研究者們將會獲得更多的EHP感染后特異表達(dá)的潛在標(biāo)記基因，并將它們應(yīng)用于對其檢測和防治技術(shù)的提升的工作中。近5年等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在EHP檢測中所使用的靶標(biāo)基因如表2所示。

表2 等溫?cái)U(kuò)增在EHP檢測中的靶標(biāo)基因Tab.2 Targets for isothermal amplification in EHP detection

續(xù)表2

4 結(jié)語

EHP對全世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，同時由于有效治療EHP感染的方法尚未被發(fā)現(xiàn)，因此，EHP感染的早期診斷和預(yù)防對對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重大意義。

盡管組織學(xué)觀察、原位雜交、巢氏PCR、qPCR等技術(shù)方法應(yīng)用在檢測EHP感染上已較為成熟，但這些方法存在反應(yīng)時間長、依賴實(shí)驗(yàn)室和昂貴設(shè)備等缺點(diǎn)，限制了其在野外的大規(guī)模使用。而等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)具有簡便、快捷、不需要昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，具有應(yīng)用于EHP現(xiàn)場檢測的潛力。隨著等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)研究的深入，研究者通過在等溫?cái)U(kuò)增體系中加入熒光染料、探針等以解決靈敏度差、無法直接觀察等問題，以便該技術(shù)能更好地應(yīng)用于EHP的現(xiàn)場檢測。此外，現(xiàn)有報(bào)道中通過等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)的改良方案所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)僅僅是在實(shí)驗(yàn)室條件下，最終將其應(yīng)用于EHP的現(xiàn)場檢測還需要對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化，同時還需降低檢測成本，開發(fā)出一種簡單、成熟的試劑盒，以便對蝦養(yǎng)殖人員進(jìn)行獨(dú)立檢測。

隨著現(xiàn)代交叉學(xué)科研究的不斷深入，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)本身存在的局限性會被進(jìn)一步突破，未來可能會形成一套成熟的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)體系并應(yīng)用于EHP及其他蝦病的聯(lián)合檢測。此外，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與試紙條及核酸適配體等進(jìn)行聯(lián)合可能會成為未來快速檢測判斷病原微生物感染的新技術(shù)。