綠鰭馬面鲀早繁生殖調(diào)控期間親魚性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察

毛欣童，劉立明，王九龍，劉 琰，吳艷慶，姜宏利，徐文剛*

(1.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.煙臺普勝水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264100)

綠鰭馬面鲀(Thamnaconusmodestus)隸屬鲀形目(Tetraodontiformes)、單角鲀科(Monacanthidae)、馬面鲀屬(Thamnaconus)，廣泛分布于中國東海和黃渤海、韓國沿岸海域以及日本北海道等地[1-3]，一般棲息于水深50～110 m、水溫10～28 °C的近海海域[4-5]。綠鰭馬面鲀體型側(cè)扁，頭部與馬面相似，且食用前需要將魚皮剝?nèi)ィ视直环Q為剝皮魚、象皮魚、面包魚、馬面魚、扒皮狼等[6-7]。綠鰭馬面鲀味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟價值[8]，曾經(jīng)是中國漁撈歷史上的大宗漁業(yè)產(chǎn)品，二十世紀(jì)七八十年代年捕撈量一度高達(dá)25×104t[9]。近年來，日益增長的市場需求導(dǎo)致綠鰭馬面鲀捕撈過度、自然資源量銳減。但隨著人工繁育技術(shù)的突破及人工養(yǎng)殖技術(shù)的提高，綠鰭馬面鲀已成為極具開發(fā)潛力且值得推廣的優(yōu)良養(yǎng)殖品種。

為開展綠鰭馬面鲀自然資源的增殖放流、推動綠鰭馬面鲀養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，近年來對其苗種繁育和人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究日漸增多。目前已對綠鰭馬面鲀工廠化早繁苗種培育技術(shù)[10]及其早期生長發(fā)育與攝食特性[11]開展了研究。綠鰭馬面鲀親魚自然繁殖期較晚(山東沿海大概在5—6月)，而北方沿海受冬季低溫影響期較長，常溫條件下培育親魚所獲的魚苗在當(dāng)年達(dá)到商品規(guī)格的難度較大，因此可通過升溫手段對親魚進(jìn)行生殖調(diào)控，延長其養(yǎng)殖生長期，則有望實現(xiàn)當(dāng)年養(yǎng)成商品魚(體質(zhì)量大于200 g)的目標(biāo)。

目前，國內(nèi)有關(guān)綠鰭馬面鲀繁殖生物學(xué)的研究主要集中于親魚性成熟規(guī)格[12]、CYP17-Ⅰ基因克隆[13]及其生長周期中性類固醇激素受體的表達(dá)[14]等，關(guān)于其生殖調(diào)控期性腺發(fā)育的研究尚未見報道。此外，綠鰭馬面鲀基于體表第二性征的性別二態(tài)性不明顯[15]，難以通過魚體形態(tài)等外部特征來準(zhǔn)確判別雌雄及性腺的發(fā)育階段。因此，本實驗以綠鰭馬面鲀親魚為研究對象，在早繁生殖調(diào)控期間，通過測量性腺生長指數(shù)，收集精巢和卵巢，觀察性腺外部形態(tài)特征和組織學(xué)切片，闡明綠鰭馬面鲀性腺發(fā)育的結(jié)構(gòu)特征及其在繁殖周期的變化規(guī)律，以期進(jìn)一步豐富綠鰭馬面鲀繁殖生物學(xué)的基礎(chǔ)資料，為其人工繁育和資源狀況評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用綠鰭馬面鲀親魚取自山東煙臺普勝水產(chǎn)有限公司，年齡約3～5齡。將綠鰭馬面鲀親魚飼養(yǎng)在水泥池中，為開放式流水養(yǎng)殖，鹽度為29～33，pH為 7.8～8.3，溶解氧在5 mg/L以上，保持24 h增氧，試驗期間記錄水溫的變化。親魚每天早晚各投喂一次，所用餌料為冷凍扇貝邊、牡蠣、玉筋魚或小蝦。從2021年11月至2022年3月，每隔20天采集一次，每次采集雌、雄綠鰭馬面鲀親魚各3尾，期間共采集5次，共計30尾；試驗觀察至2022年5月。

1.2 試驗方法

采用麻醉劑MS-222將綠鰭馬面鲀親魚麻醉，對其外部形態(tài)拍照觀察，測量魚體全長(Total length，TL)和體質(zhì)量(Body weight，BW)，然后解剖取出肝臟和性腺并測定性腺重量(Gonadal weight，GW)和肝臟重量(Liver weight，LW)。對性腺進(jìn)行拍照觀察后，立即將其置于波恩試劑中固定24 h后，用70%乙醇置換固定至無色，再保存于70%乙醇中，用于組織學(xué)分析。性腺指數(shù)(Gonadosomatic index，GSI)和肝胰腺指數(shù)(Hepatopancreas index，HSI)的計算公式如下：

GSI=GW/BW×100%

(1)

HSI=LW/BW×100%

(2)

將固定好的性腺樣品按80%、85%、90%、95%和100%乙醇濃度梯度進(jìn)行逐級脫水處理。用二甲苯對樣品進(jìn)行透明，然后石蠟包埋并進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約5 μm。之后用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，置于Olympus CX32型光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 綠鰭馬面鲀親魚培育池水溫的變化

自2021年11月中旬開始，對綠鰭馬面鲀親魚進(jìn)行人工馴養(yǎng)和越冬培育，主要通過控制水溫和餌料營養(yǎng)強化等技術(shù)進(jìn)行促熟，培育水溫變化如圖1所示。于11月15日開始將水溫逐漸從15 °C降至12～13 °C，持續(xù)11 d，直至11月26日，然后將溫度升至13～15 °C進(jìn)行越冬。1月20日開始升溫至17 °C進(jìn)行促熟，使綠鰭馬面鲀親魚自然產(chǎn)卵受精。試驗期間，培育池水溫的變化范圍為12.7～21.5 °C。綠鰭馬面鲀親魚在2月上旬水溫16.5 °C時開始少量產(chǎn)卵，到2月中旬水溫18.5 °C時產(chǎn)卵量稍多，到2月下旬水溫21 °C時大量產(chǎn)卵。3月上旬水溫降至17.0 °C，至5月上旬，綠鰭馬面鲀親魚產(chǎn)卵結(jié)束。

2.2 綠鰭馬面鲀親魚生長指標(biāo)的變化

如表1所示，采樣期間綠鰭馬面鲀雌、雄親魚的體長、體質(zhì)量、肝胰腺重量以及肝胰腺指數(shù)變化均無顯著性差異(P>0.05)。但綠鰭馬面鲀雌魚性腺重量和性腺指數(shù)均在2月時達(dá)到最大，且顯著高于其他月份(P<0.05)，雄魚性腺重量和性腺指數(shù)也均在2月時達(dá)到最大，且顯著高于11月、12月和1月采樣時間段(P<0.05)。

表1 綠鰭馬面鲀親魚生長指標(biāo)的變化Tab.1 Changes in the growth index of the parental T.modestus

2.3 綠鰭馬面鲀性腺發(fā)育的分期

2.3.1 綠鰭馬面鲀卵巢中生殖細(xì)胞發(fā)育的過程及特點

綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育以卵巢中卵母細(xì)胞最發(fā)達(dá)的階段作為生殖腺的發(fā)育階段，參照劉筠[16]對鯉科魚類研究的分期標(biāo)準(zhǔn)對性腺發(fā)育進(jìn)行分期，將早繁生殖調(diào)控期間綠鰭馬面鲀的雌性生殖細(xì)胞發(fā)育分為6個時期(圖2)。

注：A.核仁外周期(Pn)；B.卵黃囊泡期(Yv)；C.初級卵黃球期(Py)；D.次級卵黃球期(Sy)；E.三級卵黃球期(Ty)；F.成熟期(Ri)。Notes：A.Perinucleolus (Pn)；B. Yolk vesicle (Yv)；C. Primary yolk (Py)；D. Secondary yolk (Sy)；E.Teritary yolk stage (Ty)；F.Ripe (Ri).

1)第Ⅱ時相早期卵母細(xì)胞(圖2A)：核仁外周期，11月綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育處于此階段，為初級卵母細(xì)胞小生長期，細(xì)胞呈多角形的圓形。細(xì)胞體積小，細(xì)胞直徑為(99.54±10.01)μm；細(xì)胞質(zhì)較多，呈強嗜堿性；細(xì)胞核呈微嗜酸性，核直徑為(54.78±5.41)μm，核膜清晰可見，有分布在核的中央或邊緣的核仁9～15個。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間出現(xiàn)透明的環(huán)核圈，圈中含有少量的物質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中有少量的透明液泡，液泡在細(xì)胞質(zhì)中環(huán)繞，數(shù)量不斷增多。細(xì)胞質(zhì)被蘇木精染色深，核呈現(xiàn)巨大化，核中出現(xiàn)很多小的核仁。

2)第Ⅱ時相晚期卵母細(xì)胞(圖2B)：卵黃囊泡期，12月綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育處于此階段，為小生長期，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞直徑為(115.17±10.81)μm。細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性，但與第Ⅱ時相早期卵母細(xì)胞相比減弱；細(xì)胞核直徑為(55.69±5.21)μm，核質(zhì)呈嗜酸性，核仁呈嗜堿性，有核仁9～20個。胞質(zhì)外出現(xiàn)兩層濾泡膜，其中有一層嗜酸性的放射帶，細(xì)胞質(zhì)中的濾泡有1～2層。

3)第Ⅲ時相早期卵母細(xì)胞(圖2C)：初級卵黃球期，此時相是初級卵母細(xì)胞由小生長期階段轉(zhuǎn)到大生長期階段的過渡時期。1月綠鰭馬面鲀處于此階段，細(xì)胞直徑為(159.57±8.51)μm，細(xì)胞核體積變大，核直徑為(70.86±3.00)μm，有分布在核邊緣的核仁10～18個。液泡不斷增多，由一層發(fā)展成兩層甚至充滿整個細(xì)胞質(zhì)，卵徑大小懸殊。

4)第Ⅲ時相中期卵母細(xì)胞(圖2D)：次級卵黃球期，2月初綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育處于此階段，為大生長期，細(xì)胞體積不斷增大，卵黃顆粒不斷增加，最后幾乎充滿整個核外空間。細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，細(xì)胞直徑為(210.25±13.31)μm，細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性，胞質(zhì)外出現(xiàn)的兩層濾泡膜變得更加清晰，放射帶明顯增厚，核直徑為(80.05±6.85)μm，核質(zhì)呈嗜酸性，有核仁11～19個，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)被染為紫紅色的卵黃顆粒并逐漸增多，由細(xì)胞質(zhì)邊緣向內(nèi)細(xì)胞中央不斷積累，但仍夾雜少量液泡。

5)第Ⅲ時相后期卵母細(xì)胞(圖2E)：三級卵黃球期，2月底綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育處于此階段，細(xì)胞直徑為(361.5±16.13)μm，卵黃顆粒逐漸融合形成粗大的卵黃板；油滴融合形成油球。

6)第Ⅳ時相卵母細(xì)胞(圖2F)：此時相是初級卵母細(xì)胞發(fā)育的晚期，是卵黃顆粒逐漸充滿的時期，也是卵母細(xì)胞達(dá)到生長成熟的時期。3月綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育處于此階段，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞直徑為(292.25±18.39)μm，卵黃顆粒充滿整個胞質(zhì)，細(xì)胞核直徑為(89.5±7.70)μm，核膜開始溶解，核仁開始向外排出。

2.3.2 綠鰭馬面鲀精巢中生殖細(xì)胞發(fā)育的過程及特點

根據(jù)精巢組織學(xué)切片上大部分生殖細(xì)胞所處的階段，并結(jié)合李霞[17]對精巢發(fā)育的分期，將綠鰭馬面鲀的雄性生殖細(xì)胞發(fā)育分為5個時期(圖3)。

注：a.精原細(xì)胞(Sg)；b.初級精母細(xì)胞(Ps)；c.次級精母細(xì)胞(Ss)；d.精子細(xì)胞(St)；e.精子(Sz)。Notes：a.Spermatogonium (Sg)；b. Primary spermatocyte (Ps)；c.Secondary spermatocyte (Ss)；d.Spermatid (St)；e.Spermatozoon (Sz).

1)第Ⅰ時相(圖3a)：精原細(xì)胞，11月綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育處于此階段。細(xì)胞呈圓形，體積較大。細(xì)胞質(zhì)為弱嗜堿性或嫌色性(即對染料無明顯的親和力)；細(xì)胞核一般比較大，呈嗜堿性，位于細(xì)胞中央。

2)第Ⅱ時相(圖3b)：初級精母細(xì)胞，12月綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育處于此階段。由精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，直徑比精原細(xì)胞小。細(xì)胞質(zhì)為嫌色性，染色質(zhì)豐富，因此其染色比精原細(xì)胞深，沒有明顯的核仁，核直徑為(2.29±0.43)μm。

3)第Ⅲ時相(圖3c)：次級精母細(xì)胞，1月綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育處于此階段。由初級精母細(xì)胞經(jīng)第一次成熟分裂而形成。細(xì)胞呈圓形，體積較小，細(xì)胞質(zhì)很少，為嫌色性。細(xì)胞核的嗜堿性比上一階段增強，核直徑為(1.73±0.21)μm。

4)第Ⅳ時相(圖3d)：精子細(xì)胞，2月綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育處于此階段。由次級精母細(xì)胞分裂而成，細(xì)胞體積小，無明顯的細(xì)胞質(zhì)，只含有強嗜堿性的圓形細(xì)胞核，核直徑為(1.54±0.23)μm。

5)第Ⅴ時相(圖3e)：精子，3月綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育處于此階段。由精子細(xì)胞發(fā)育而成，細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞體積最小，細(xì)胞核的嗜堿性最強，核直徑為(1.14±0.13)μm，由頭、頸、尾三部分組成。

3 討論

3.1 人工繁殖綠鰭馬面鲀親魚性腺發(fā)育成熟的時間

國內(nèi)外對綠鰭馬面鲀產(chǎn)卵期的時間均有相關(guān)報道，如許學(xué)龍[18]報道日本新潟沿海馬面鲀的產(chǎn)卵期是5月下旬到7月上旬，備后灘的為5月下旬到6月下旬，太平洋西南海域的則在3月下旬開始產(chǎn)卵；陳蓮芳等[19]通過對東海綠鰭馬面鲀產(chǎn)卵場和產(chǎn)卵期的調(diào)查，表明綠鰭馬面鲀的產(chǎn)卵期是4月中旬到5月中旬，產(chǎn)卵盛期是4月中下旬，產(chǎn)卵場是釣魚島漁場；張家男[20]對渤海區(qū)綠鰭馬面鲀產(chǎn)卵期進(jìn)行研究，表明綠鰭馬面鲀的產(chǎn)卵期是5月下旬到7月上旬。本研究中，在人工生殖調(diào)控條件下，綠鰭馬面鲀親魚的精巢和卵巢大部分在2月底達(dá)到成熟，且于2月底開始產(chǎn)卵，較自然海區(qū)提前了近2～3個月。研究表明，環(huán)境中的水溫、光周期和光照強度對魚類性腺發(fā)育成熟有重要的影響[21-23]，如綜合運用水溫和光照調(diào)節(jié)能有效誘導(dǎo)五條鰤(Seriolaquinqueradiata)[24]和赤點石斑魚(Epinephelusakaara)[25]性腺的發(fā)育成熟；在 14 °C水溫條件下，大西洋鮭(Salmosalar)的成熟率顯著高于其他溫度條件[26]；此外，水溫提高至16～24 °C能夠加強水流對草魚(Ctenopharyngodonidellus)的刺激影響，從而促進(jìn)其性腺的發(fā)育成熟[27]。本實驗結(jié)果與上述結(jié)論基本一致，在人工生殖調(diào)控期間，水溫調(diào)節(jié)有效地加快了綠鰭馬面鲀的新陳代謝，刺激了性腺，從而促進(jìn)其提前發(fā)育成熟。

3.2 繁殖前后綠鰭馬面鲀卵子和精子的發(fā)生規(guī)律

目前對魚類性腺發(fā)育的規(guī)律和分期，在國際上尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究所采用的分期方法以卵母細(xì)胞的內(nèi)含物及其演變狀態(tài)為依據(jù)，參照《中國養(yǎng)殖魚類繁殖生理學(xué)》[16]對鯉科魚類研究的分期標(biāo)準(zhǔn)對綠鰭馬面鲀卵巢發(fā)育的時相進(jìn)行分期，卵巢的發(fā)育分期以出現(xiàn)的最高時相卵母細(xì)胞為準(zhǔn)，該方法結(jié)合生理學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)理論進(jìn)行分期劃分，為國內(nèi)大部分學(xué)者認(rèn)同。

此外，按照卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，硬骨魚類的卵巢可以分為三種類型：1)完全同步型，卵巢內(nèi)所有卵母細(xì)胞處在同一發(fā)育階段，一生只產(chǎn)卵一次，產(chǎn)后便死亡，如大西洋鮭[28]；2)分批同步型，卵巢內(nèi)至少含有兩種不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，每年通常成熟產(chǎn)卵一次，繁殖季節(jié)很短，如軍曹魚(Rachycentroncanadum)[29]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[30]；3)分批非同步型，卵巢內(nèi)含有各個階段的卵母細(xì)胞，一年內(nèi)可以多次產(chǎn)卵，繁殖周期長，如半滑舌鰨(Oplegnathuspunctatus)[31]和青鳉(Oryziaslatipes)[32]。通過對卵母細(xì)胞的組織學(xué)觀察，結(jié)果表明綠鰭馬面鲀的卵巢在不同發(fā)育時期含有不同時相的卵母細(xì)胞，且即使在同一發(fā)育期，仍有其他不同時相的卵母細(xì)胞，如在成熟卵巢中，次級卵黃球卵母細(xì)胞占比最高，此外還含有少量的未成熟卵母細(xì)胞，表明綠鰭馬面鲀產(chǎn)卵類型為非同步發(fā)育分批產(chǎn)卵型。本研究結(jié)果為綠鰭馬面鲀雌魚分批次產(chǎn)卵生殖調(diào)控提供了科學(xué)依據(jù)。

硬骨魚類精巢懸系于鰾的腹面、腹腔兩側(cè)的腹腔系膜上，一般成對出現(xiàn)[33]。關(guān)于精巢組織結(jié)構(gòu)，也有多種標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)學(xué)者普遍采用Nagahama Y等[34]和Billard R[35]的觀點，根據(jù)生精細(xì)胞的排列方式，將精巢結(jié)構(gòu)分為小管型和小葉型。已有研究表明，綠鰭馬面鲀[36]、黃鱔(Monopterusalbus)[37]、鯰(Silurusasotus)[38]等的精巢為典型的小葉型結(jié)構(gòu)。與其他脊椎動物一樣，魚類精子的發(fā)生是在精巢中經(jīng)過生殖、生長、成熟和變態(tài)幾個連續(xù)時期中進(jìn)行。與其他魚類[39-41]相比，本研究在同一發(fā)育階段的綠鰭馬面鲀雄性生殖細(xì)胞雖然在外形和大小等方面略有差別，但基本結(jié)構(gòu)是一致的。本研究結(jié)果中，綠鰭馬面鲀精巢發(fā)育的分期及其成熟時間的確定為雄魚的生殖調(diào)控提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

綜上所述，在人工早繁生殖調(diào)控期間，通過對水溫的調(diào)控，綠鰭馬面鲀雌、雄親魚在2月均能達(dá)到完全成熟階段，且在2月即開始產(chǎn)卵，較自然海區(qū)提前了2～3個月；雌性生殖細(xì)胞(卵巢)的發(fā)育為核仁外周期、卵黃囊泡期、初級卵黃球期、次級卵黃球期、三級卵黃球期和成熟期6個時期，雄性生殖細(xì)胞(精巢)的發(fā)育則分為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子5個時期。本研究結(jié)果可為今后綠鰭馬面鲀?nèi)斯し敝臣捌涿绶N生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。