仿刺參南移養(yǎng)殖溫度耐受性相關(guān)基因的差異表達(dá)分析

朱志煌，林 琪，吳建紹，楊求華

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是棘皮動(dòng)物門海參綱刺參科動(dòng)物的統(tǒng)稱，具有較高的營養(yǎng)、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。仿刺參屬于溫帶種類，自然分布區(qū)域北起俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，經(jīng)朝鮮、韓國、日本，南至中國北部，雖然在福建的自然海區(qū)無分布，但其所具有的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值推動(dòng)該品種養(yǎng)殖業(yè)從北往南擴(kuò)張[1]。自2005年以來，福建省從遼寧等地引進(jìn)仿刺參，并大力開展“北參南養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)。2022年福建海參產(chǎn)量達(dá)到45 636t，占全國總產(chǎn)量的18.36%，穩(wěn)居全國第三位。

仿刺參為淺海底棲生物。水溫是影響仿刺參生長、生理性能和免疫反應(yīng)等功能的重要環(huán)境因素，并且在水溫升高到一定范圍后，其立即進(jìn)入攝食停止、活動(dòng)減少的“夏眠”狀態(tài)。福建地區(qū)夏季的高溫會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖仿刺參發(fā)生大規(guī)模死亡，這給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。目前，缺乏仿刺參耐高溫良種是制約該產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。選擇育種是獲得水生動(dòng)物新品系的重要方法[2-4]。研究證明，熱脅迫刺激能夠一定程度地提高動(dòng)物耐高溫的能力[5-7]。熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)和小熱休克蛋白(Small heat shock proteins，sHSPs)作為細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，能夠防止蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集，提高細(xì)胞的耐熱能力[8-13]。以往研究表明，HSPs是誘導(dǎo)耐熱的主要介質(zhì)，其表達(dá)模式與生物體的耐熱水平直接相關(guān)[14-18]。此外，致死必需蛋白 [Protein lethal (2)essential for life，Protein l(2)efl]基因也是一種小熱休克蛋白的同源基因，其表現(xiàn)出與sHSPs類似的功能，主要與生物的耐熱能力有關(guān)，并在一定程度上保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。HSP26、gp96、HSP70、HSP90a和proteinl(2)efl基因均屬于熱休克蛋白家族的成員，其表達(dá)的水平可用于評估高溫誘導(dǎo)下仿刺參的熱耐受力。

目前，國內(nèi)外對北方仿刺參的研究較為系統(tǒng)，眾多學(xué)者在組織形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等方面展開大量研究并取得了豐碩的研究成果[19-22]。有研究指出，在高溫脅迫下，仿刺參的HSP70、proteinl(2)efl、HSP90和HSP26等熱休克蛋白基因的表達(dá)量會(huì)上調(diào)[23-24]。針對北方仿刺參夏眠前、后展開轉(zhuǎn)錄組測序的分析研究，發(fā)現(xiàn)溫度波動(dòng)會(huì)對其熱休克蛋白的表達(dá)產(chǎn)生顯著的影響[25]。還有研究表明，仿刺參的耐熱性是可塑的，預(yù)先的熱沖擊實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱岣咂淠蜔崮芰26-27]。因此，將北方仿刺參轉(zhuǎn)移到南方來進(jìn)行養(yǎng)殖適應(yīng)，能在一定程度上提高其耐熱性能。

本研究從山東青島購入仿刺參幼苗，將其飼養(yǎng)于溫度較高的福建漳州戶外淺池塘中，使其經(jīng)歷長期的高溫海水刺激，以此作為南移福建養(yǎng)殖的仿刺參實(shí)驗(yàn)組，并以北方相同苗齡的仿刺參作為對照組，比較兩組間的抗熱性能，以期為仿刺參耐高溫品系的培育提供理論參考。

在道路橋梁路線設(shè)計(jì)階段，設(shè)計(jì)單位應(yīng)該綜合自身掌握的地形地質(zhì)條件、周邊自然環(huán)境資料等對工程投入運(yùn)營后可能會(huì)出現(xiàn)的問題進(jìn)行分析預(yù)測，在此基礎(chǔ)上制定科學(xué)合理的維護(hù)養(yǎng)護(hù)和檢測維護(hù)計(jì)劃，促進(jìn)道路橋梁工程使用壽命的提升。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和馴化

2016年冬季從山東省青島市即墨養(yǎng)殖場(36°30′43.5″N、120°50′59.0″E)購買仿刺參幼苗，并將其分至兩地養(yǎng)殖，一部分放在原養(yǎng)殖場養(yǎng)殖，另一部分轉(zhuǎn)移到福建省漳州市東山養(yǎng)殖場室外飼養(yǎng)淺池塘進(jìn)行養(yǎng)殖(23°34′34.1″N、117°23′28.8″E)，兩地養(yǎng)殖的仿刺參均在自然光周期和水溫下飼養(yǎng)一年。海水經(jīng)砂濾過濾，鹽度約為30，以流水模式進(jìn)行養(yǎng)殖。仿刺參幼苗每天投喂飼料一次，每次喂足人工海參飼料(金派生物，中國威海)，并定期對池塘吸污。同時(shí)，每天記錄水溫情況，每月測定仿刺參幼苗的生長情況。2017年冬季，分別將青島市即墨養(yǎng)殖場和漳州市東山養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的仿刺參運(yùn)至廈門市進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此時(shí)仿刺參均為20月齡(600日齡)。為了方便后續(xù)區(qū)分，將兩地運(yùn)回的仿刺參分別簡易命名為青島本地群體(Qingdao local sea cucumber populations，Qls)和南方養(yǎng)殖群體(South aquaculture sea cucumbers populations，Sas)。實(shí)驗(yàn)開始前，將兩地運(yùn)來的仿刺參分別移入溫度為16 °C的養(yǎng)殖水槽中，暫養(yǎng)14 d，每天換掉1/3～1/2的等溫海水，其他飼養(yǎng)條件均相同。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 仿刺參溫度耐受范圍實(shí)驗(yàn)

為研究給定處理時(shí)間的仿刺參溫度耐受范圍，急性溫度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的刺激溫度超過仿刺參養(yǎng)殖過程中海水的自然溫度。將不同仿刺參群體分別放入預(yù)先調(diào)好海水溫度的40 L透明塑料桶，每個(gè)塑料桶放入10頭仿刺參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將兩個(gè)群體的仿刺參分別同時(shí)放入水溫為28、29、30、31、32、33、34 °C的塑料桶中，經(jīng)過2 h的溫度刺激后，轉(zhuǎn)移至16 °C養(yǎng)殖水槽中暫養(yǎng)7 d，觀察記錄其存活情況，以確定兩個(gè)仿刺參群體的亞致死溫度、致死溫度和半致死溫度。實(shí)驗(yàn)水溫由溫控器控制調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)期間每2 min用精度為±0.2 °C的水銀溫度計(jì)監(jiān)測水溫情況。在實(shí)驗(yàn)期間，仿刺參的飼養(yǎng)條件與馴化期間相似。

1.2.2 仿刺參溫度耐受性相關(guān)基因的差異表達(dá)實(shí)驗(yàn)

不同刺參幼苗群體在高溫?zé)岽碳ず蟮膒roeintl(2)efl基因的表達(dá)變化差異如圖6所示。青島本地群體經(jīng)過30、31 ℃的高溫刺激后，proeintl(2)efl基因的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在3 h處，分別為(67.230±13.512)、(88.897±8.242)；在32、34 ℃高溫刺激下，proeintl(2)efl基因的表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在1 h處，表達(dá)量的最高值出現(xiàn)在34 ℃刺激1 h處(234.167±22.130)；而在33 ℃高溫刺激下，proeintl(2)efl基因的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在高溫刺激2 h處。南方養(yǎng)殖群體經(jīng)過30、31、32℃高溫刺激后，proeintl(2)efl基因的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在1 h處；而33、34 ℃高溫刺激下，proeintl(2)efl基因的表達(dá)量峰值則分別出現(xiàn)在3、2 h處，表達(dá)量的最高值出現(xiàn)在34 ℃刺激2 h處(13.948±5.740)。青島本地群體在高溫刺激1、2、3 h后，proeintl(2)efl基因的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在34、33、31 ℃；而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在31、34、31℃。

1.3 RNA提取和cDNA的合成

將整頭仿刺參置于裝有液氮的研缽中碾碎。取約80 mg樣品，放入1 mL Trizol試劑(Qiagen)中進(jìn)行勻漿，再使用 Invitrogen 公司的 Trizol 試劑盒，按照說明書提取樣本組織的總RNA。利用QuantScript RT Kit，按照說明書合成cDNA，提取的樣品保存在-80 ℃冰箱中，備用待測。

1.4 引物設(shè)計(jì)和熒光定量實(shí)驗(yàn)

根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)網(wǎng)站上已公布的HSP90a、HSP26、HSP70、gp96和proeintl(2)efl基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)。采用熒光定量 PCR的方法，檢測5個(gè)溫度耐受性相關(guān)基因在溫度刺激后的不同仿刺參幼苗群體中的表達(dá)情況。以β-actin的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值，將對照組和實(shí)驗(yàn)組個(gè)體在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行校正，以消除不同個(gè)體對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[26-27]。再將這些校正后的表達(dá)量與對照組(16 °C)進(jìn)行比較，分析各基因在對照組和實(shí)驗(yàn)組中的倍數(shù)變化，從而發(fā)現(xiàn)基因在高溫刺激后的表達(dá)規(guī)律。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 s、40個(gè)循環(huán)中95 ℃變性5 s、60 ℃退火34 s。

繪畫審美上，中國畫追求詩意的傳達(dá)。蘇軾認(rèn)為王維“詩中有畫，畫中有詩”，這從本質(zhì)上體現(xiàn)出詩意精神是中國畫的內(nèi)在特質(zhì)之一。清代畫家惲南田追求簡淡清遠(yuǎn)的審美意趣，體現(xiàn)在繪畫上就是“畫以簡貴為尚，簡之入微，則洗盡塵滓，獨(dú)存孤迥，煙鬟翠黛斂容而退矣?！盵12]畫家的審美意趣會(huì)在繪畫中有充分的展現(xiàn)。所以，在中國畫教學(xué)上，應(yīng)注重培養(yǎng)學(xué)生的審美境界，提升其繪畫的追求品味。

表1 本研究中所使用的引物Tab.1 The primer used in the study

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小顯著極差法(LSD)比較數(shù)據(jù)間的顯著性[28-29]。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。半致死溫度通過SPSS 21.0軟件中的概率單位 (Probit)回歸法[30-32]計(jì)算得出。

青島本地群體和南方養(yǎng)殖群體在高溫刺激后的存活率如圖1所示。青島本地群體在28～30 ℃高溫刺激2 h后均沒有出現(xiàn)死亡，而南方養(yǎng)殖群體在28～32 ℃高溫刺激2 h后沒有出現(xiàn)死亡，但兩個(gè)群體在經(jīng)過34 ℃高溫刺激2 h后均全部死亡。在31～33 ℃高溫刺激組中，南方養(yǎng)殖群體的存活率均高于青島本地群體，其中青島本地群體在31、32、33 ℃溫度下刺激2 h后的存活率分別為76.7%±5.8%、50.0%±0.0%、13.3%±5.8%，而南方養(yǎng)殖群體分別為100.0%±0.0%、100.0%±0.0%、56.7%±5.8%，兩個(gè)群體的存活率差異顯著(P<0.05)。因此，高溫刺激2 h后，青島本地群體和南方養(yǎng)殖群體的亞致死溫度分別為30、32 ℃，半致死溫度(ULTs50)分別為31.9 ℃ (31.4～32.4 ℃)和33.1 ℃ (32.6～33.5 ℃)，兩個(gè)群體的致死溫度均為34 ℃(圖1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同仿刺參幼苗群體的溫度耐受性

因此，雖然中國專利法的第69條(一)條款在文義解釋上能夠支持這種區(qū)別適用者的理論，但這種解釋會(huì)導(dǎo)致該條的目的落空，不應(yīng)該固執(zhí)地堅(jiān)持。

不同仿刺參幼苗群體在高溫?zé)岽碳ず蟮腍SP26基因的表達(dá)變化差異如圖5所示。青島本地群體經(jīng)過30 ℃高溫刺激，HSP26基因的表達(dá)量在1 h處出現(xiàn)明顯的降低，然后在2 h處繼續(xù)降低，但在3 h處達(dá)到峰值(34.787±4.978)；在31 ℃高溫刺激下，HSP26基因的表達(dá)量在1 h處出現(xiàn)顯著上升，之后隨著刺激時(shí)間的延長而繼續(xù)上調(diào)；在32 ℃高溫刺激下，HSP26基因的表達(dá)量在1 h處達(dá)到高峰，在2 h處降低到正常水平，之后在3 h處又出現(xiàn)升高；在33 ℃高溫刺激下，HSP26基因的表達(dá)量在1 h處出現(xiàn)顯著下調(diào)，之后在2 h處出現(xiàn)大幅增加并達(dá)到峰值，之后在3 h處出現(xiàn)迅速降低；在34 ℃高溫刺激下，HSP26基因的表達(dá)量在1 h處迅速上調(diào)并達(dá)到該群體表達(dá)量的最高值(65.127±4.054)，之后逐漸降低到正常水平。南方養(yǎng)殖群體的HSP26基因的表達(dá)量在30、31 ℃高溫刺激下出現(xiàn)顯著的上調(diào)，但是表達(dá)量峰值不同，最高值出現(xiàn)在30 ℃刺激1 h處，為(93.710±5.674)；在33 ℃高溫刺激下，HSP26基因的表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的延長而增加，在3 h處出現(xiàn)表達(dá)量峰值；HSP26基因的表達(dá)在32、34 ℃高溫刺激下的表達(dá)模式相近，即高溫刺激1 h處的表達(dá)沒有顯著差異，而在2 h處的表達(dá)量出現(xiàn)快速上調(diào)并達(dá)到最高峰，之后恢復(fù)正常水平。青島本地群體在高溫刺激1、2、3 h后，HSP26基因的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在34、33、30 ℃；而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在30、34、31 ℃。

2.2 HSP90a基因的表達(dá)情況

不同仿刺參幼苗群體在高溫?zé)岽碳ず蟮腍SP90a基因的表達(dá)變化差異如圖2所示。青島本地群體經(jīng)30、31、32、33 ℃高溫刺激后，HSP90a基因的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在溫度刺激3 h處，分別為(9.801±1.303)、(24.133±2.232)、(21.683±3.082)、(25.473±3.402)；而在34 ℃高溫刺激后，HSP90a基因的表達(dá)量高峰發(fā)生在1 h處，此時(shí)達(dá)到青島本地群體表達(dá)量的最高值(43.367±3.137)，隨后表達(dá)量隨著溫度刺激時(shí)間的延遲而出現(xiàn)降低。南方養(yǎng)殖群體經(jīng)30 ℃高溫刺激1 h后，HSP90a基因的表達(dá)量已達(dá)到(42.000±8.798)；在30、31、33 ℃高溫刺激下，HSP90a基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在溫度刺激3 h處，而32 ℃高溫刺激的最高表達(dá)值出現(xiàn)在2 h，此時(shí)達(dá)到南方養(yǎng)殖群體表達(dá)量的最高值(222.150±4.980)。在34 ℃的高溫刺激下，南方養(yǎng)殖群體和青島本地群體的表達(dá)模式相近，HSP90a基因的表達(dá)高峰均發(fā)生在1 h處。青島本地群體在高溫刺激1、2、3 h后，HSP90a基因的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在34、34、33 ℃；而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在32、32、30 ℃。

注：標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。以下同此。Notes：Different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05)，while the same lowercase letter meant no significant difference (P>0.05).The same as below.

2.3 gp96基因的表達(dá)情況

不同仿刺參幼苗群體在高溫?zé)岽碳ず蟮膅p96基因的表達(dá)變化差異如圖3所示。青島本地群體在30 ℃高溫刺激下1、2 h處，gp96基因的表達(dá)量顯著低于對照組(16 ℃)，而在刺激3 h后，表達(dá)量才上調(diào)并達(dá)到峰值(2.508±0.910)；在31 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量在1、2、3 h處均出現(xiàn)顯著上調(diào)，并在3 h處出現(xiàn)表達(dá)量峰值；在32 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量在溫度刺激1 h后出現(xiàn)大幅增加，并達(dá)到峰值，隨后在2、3 h處表達(dá)量分別出現(xiàn)明顯的下調(diào)和上調(diào)；在33 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量隨著高溫刺激時(shí)間的延長而增加，在3 h處表達(dá)量達(dá)到青島本地群體的最高值(353.833±21.586)；在34 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量隨著溫度刺激時(shí)間的延長而降低。

青島本地群體在高溫刺激1、2、3 h后，gp96基因的表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在32、31、33 ℃；而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在30、30、33 ℃。

南方養(yǎng)殖群體在30 ℃高溫刺激1 h后，gp96基因的表達(dá)量已達(dá)到(20.019±6.224)，并在2 h處達(dá)到峰值，此時(shí)也是南方養(yǎng)殖群體表達(dá)量的最高值(21.467±5.131)，最后在3 h處出現(xiàn)下降；在31 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)模式與30 ℃高溫刺激下的相同，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；在32 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量在1 h處出現(xiàn)上調(diào)，但在2～3 h間出現(xiàn)上下浮動(dòng)；在33 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量在1～3 h間來回波動(dòng)，最高和最低表達(dá)值分別出現(xiàn)在2、3 h處；在34 ℃高溫刺激下，gp96基因的表達(dá)量在1 h處達(dá)到最高，之后表達(dá)量隨著高溫刺激時(shí)間的延長而逐漸降低。

綜上所述，老年衰弱患者進(jìn)行手術(shù)存在發(fā)生短期和長期不良結(jié)局的高風(fēng)險(xiǎn)，術(shù)后不良事件發(fā)生率較非衰弱患者顯著增加。有必要將衰弱納入老年患者的術(shù)前評估中，以明確是否存在衰弱及老年衰弱患者術(shù)中可能出現(xiàn)的問題，并以此為據(jù)進(jìn)行個(gè)體化圍手術(shù)期管理。全過程需要跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)協(xié)作。目標(biāo)是手術(shù)可以使老年衰弱患者獲益，減少術(shù)后不良并發(fā)癥和失能，最終能夠回歸社區(qū)生活，改善生活質(zhì)量。

2.4 HSP70基因的表達(dá)情況

不同仿刺參幼苗群體在高溫?zé)岽碳ず蟮腍SP70基因的表達(dá)變化差異如圖4所示，在相同的溫度刺激下，不同刺激時(shí)間的HSP70基因的表達(dá)存在差異。青島本地群體在30、31、32 ℃高溫刺激下，HSP70基因的表達(dá)量均在3 h處達(dá)到峰值，分別為(8.649±1.936)、(12.350±1.076)、(17.680±1.532)；而在33、34 ℃高溫刺激下，HSP70基因的表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在2 h處；表達(dá)量的最高值出現(xiàn)在34 ℃刺激2 h處，為(21.610±5.208)。南方養(yǎng)殖群體在30 ℃高溫刺激下，HSP70基因的表達(dá)量在1 h處達(dá)到峰值，也是該群體表達(dá)量的最高值，為(218.750±78.701)；而在31、33 ℃高溫刺激下，HSP70基因的表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在3 h處；在32、34 ℃高溫刺激下，HSP70基因的表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在2 h處。青島本地群體在高溫刺激1、2、3 h后，HSP70基因的表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在32、34、32 ℃；而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在30、34、33 ℃。

2.5 HSP26基因的表達(dá)情況

控制變量。經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平用剔除價(jià)格因素的實(shí)際人均GDP衡量，地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平越高越有利于該地集聚資源，有利于提升企業(yè)的創(chuàng)新水平，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級［16］；人力資本水平用各地區(qū)平均受教育年限來測量，計(jì)算公式為：（小學(xué)受教育人數(shù)×6＋初中受教育人數(shù)×9＋高中受教育人數(shù)×12＋大學(xué)受教育人數(shù)×16）／總受教育人數(shù)［17］， 人力資本是影響環(huán)境規(guī)制和技術(shù)進(jìn)步的重要因素；產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的計(jì)算公式是工業(yè)增加值／GDP，產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的變動(dòng)直接推動(dòng)產(chǎn)業(yè)升級變化；技術(shù)創(chuàng)新用各年各省的專利授權(quán)量表示［18］，新技術(shù)的發(fā)明能夠促使企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營向高新技術(shù)方向轉(zhuǎn)變，從而使產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)向更高端的方向調(diào)整，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)升級。

2.6 proeintl(2)efl基因的表達(dá)情況

為了解不同誘導(dǎo)溫度和處理時(shí)間下兩個(gè)仿刺參群體HSPs、sHSPs和proeintl(2)efl基因的表達(dá)模式差異，將兩個(gè)群體分別轉(zhuǎn)入選定的溫度中進(jìn)行熱刺激，溫度設(shè)置為16 (對照組)、30、31、32、33、34 °C，刺激時(shí)間分別為1、2、3 h。每個(gè)刺激溫度和刺激時(shí)間均有10頭仿刺參，在刺激1、2、3 h后，分別隨機(jī)采集不同實(shí)驗(yàn)組別中的3頭仿刺參，然后立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室并保存在-80 °C冰箱中，備用待測。

3 討論

3.1 高溫馴化提高仿刺參的耐熱性

仿刺參是典型的溫帶物種，對外界環(huán)境變化具有強(qiáng)敏感性。Meng X等[27]和王青林[32]對北方仿刺參進(jìn)行高溫馴化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫馴化后仿刺參的半致死溫度為31.8 ℃。本研究將北方仿刺參轉(zhuǎn)移至南方，在自然水溫下進(jìn)行為期一年的養(yǎng)殖，然后與在北方養(yǎng)殖的同批次仿刺參進(jìn)行耐熱性比較，分析了兩個(gè)群體間的耐熱性差異，其中溫度耐受性實(shí)驗(yàn)得出兩個(gè)群體的致死溫度均為34 ℃；南方養(yǎng)殖群體的亞致死溫度和半致死溫度分別為32、33.1 ℃，青島本地群體分別為30、31.9 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)的青島本地群體半數(shù)致死溫度與Meng X等和王青林的結(jié)論基本一致。李曉英等[33]比較了北方5個(gè)不同地理群體仿刺參的高溫耐受力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠南群體的半致死溫度最高(31.9 ℃)，而昌黎群體半致死溫度最低(31.5 ℃)，分析認(rèn)為膠南群體分布靠南、緯度最低，經(jīng)過長時(shí)間較高溫度的馴化與適應(yīng)，使其對于高溫的耐受力最強(qiáng)，而昌黎群體分布位于較北端、緯度較高，長期處于略微低溫馴化中，導(dǎo)致其對高溫的耐受能力較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，南方養(yǎng)殖群體的亞致死溫度和半致死溫度顯著高于青島本地群體，這與李曉英等[33]的研究一致，說明生長環(huán)境中水溫的高低能夠影響仿刺參的溫度耐受性，而受到長期高溫馴化的仿刺參具有更強(qiáng)的高溫耐受性。養(yǎng)殖在南方自然水溫中的仿刺參幼苗比北方苗種經(jīng)歷更強(qiáng)的高溫脅迫，因此其相較于北方苗種具有更高的耐熱性。今后在仿刺參品種選育工作中可以通過在南方累代定向選育，不斷提高其耐熱性能，從而迭代選育出耐高溫品系。

那個(gè)時(shí)候，我們的縣里，早就有了洋學(xué)堂了。小學(xué)好幾個(gè)，大學(xué)沒有。只有一個(gè)男子中學(xué)，往往成為談?wù)摰哪繕?biāo)。談?wù)撨@個(gè)，不單是翠姨，外祖母、姑姑、姐姐之類，都愿意講究這當(dāng)?shù)刂袑W(xué)的學(xué)生。因?yàn)樗麄円磺醒蠡?，穿著褲子，把褲腿卷起來一寸，一張口，格得毛寧外國話，他們彼此一說話就“答答答”，聽說這是什么俄國話。而更奇怪的就是他們見了女人不怕羞。這一點(diǎn)，大家都批評說是不如從前了，從前的書生，一見了女人臉就紅。

3.2 南北不同養(yǎng)殖仿刺參群體的熱休克蛋白基因的表達(dá)差異

當(dāng)生物體受到外界環(huán)境刺激時(shí)，包括熱休克蛋白在內(nèi)的一些基因的表達(dá)可能被誘導(dǎo)。根據(jù)平均分子質(zhì)量大小，熱休克蛋白可分為HSP110、HSP100、HSP90a、HSP70、HSP60和sHSP[15，34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過高溫?zé)岽碳ず螅戏金B(yǎng)殖群體和青島本地群體的HSP90a、gp96、HSP70、HSP26和proeintl(2)efl基因的表達(dá)存在差異。經(jīng)過30 ℃高溫刺激的青島本地群體的HSP90a、gp96、HSP70、HSP26基因的表達(dá)量在1、2 h處沒有出現(xiàn)顯著增加，在3 h處才出現(xiàn)明顯上調(diào)，而南方養(yǎng)殖群體的基因表達(dá)量在30 ℃高溫刺激1 h處均出現(xiàn)顯著上調(diào)。結(jié)果表明經(jīng)過高溫?zé)岽碳ず?，南方養(yǎng)殖群體的溫度耐受性相關(guān)基因的上調(diào)時(shí)間明顯早于青島本地群體，說明南方養(yǎng)殖群體對高溫?zé)岽碳さ倪m應(yīng)能力強(qiáng)于青島本地群體。

在不同的刺激溫度下，青島本地群體和南方養(yǎng)殖群體的HSP90a、gp96、HSP70、HSP26和proeintl(2)efl基因的表達(dá)量峰值發(fā)生在不同的高溫?zé)岽碳r(shí)間點(diǎn)，青島本地群體的表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在34 °C 1 h處、33 °C 3 h處、34 °C 2 h處、34 °C 1 h處和34 °C 1 h處，而南方養(yǎng)殖群體則分別出現(xiàn)在32 °C 2 h處、30 °C 2 h處、30 °C 1 h處、30 °C 1 h處和34 °C 2 h處。隨著熱刺激溫度的升高或時(shí)間的延長，基因表達(dá)并非一直上調(diào)，這種下降與高溫下生物體整體蛋白質(zhì)合成的減少有關(guān)[36]。當(dāng)外界溫度達(dá)到生物體的耐受極限，隨著溫度的進(jìn)一步升高，機(jī)體熱損傷蛋白質(zhì)會(huì)不斷增加，總蛋白質(zhì)合成遭到破壞，因此熱休克蛋白的表達(dá)受到抑制。

對比南方養(yǎng)殖群體和青島本地群體，HSP90a基因在南方養(yǎng)殖群體的表達(dá)量最高值(為對照組的222倍)是青島本地群體(為對照組的43倍)的5倍，HSP70基因在南方養(yǎng)殖群體的表達(dá)量最高值(為對照組的218倍)是青島本地群體(為對照組的21倍)的10倍，這與王青林[32]研究發(fā)現(xiàn)的仿刺參高溫馴化組HSP70基因在熱刺激誘導(dǎo)溫度下的最高表達(dá)量明顯高于低溫馴化組的結(jié)果一致，說明經(jīng)過高溫馴化的仿刺參能保持較高水平的HSP70表達(dá)，以防止蛋白質(zhì)變性和聚集。 此外，HSP90a、gp96、HSP70、HSP26和proeintl(2)efl這5個(gè)基因在兩個(gè)仿刺參群體的34 ℃高溫刺激3 h處的表達(dá)量均下調(diào)至對照組水平，說明此時(shí)仿刺參HSPs基因的表達(dá)已達(dá)到上限并開始迅速回落，其已無法通過繼續(xù)提高HSPs基因的表達(dá)水平來抵抗外界的熱脅迫，這與本研究兩個(gè)群體的致死溫度均為34 ℃的結(jié)果一致。

（1）基于 OMI的汾渭平原 SO2柱濃度值季節(jié)變化特征比較明顯，由高到低依次為冬季、秋季、春季和夏季。太原、渭南和西安逐月濃度變化總體呈現(xiàn)下降趨勢，臨汾表現(xiàn)出了弱上升趨勢。這4個(gè)城市的SO2柱濃度值與地面監(jiān)測站的SO2濃度值具有較好的相關(guān)性，說明基于 OMI的 SO2柱濃度變化一定程度上可反映大氣SO2濃度變化。

4 結(jié)論

經(jīng)過高溫馴化，仿刺參能夠更早地對外界高溫做出反應(yīng)，同時(shí)其具有更強(qiáng)的合成熱休克蛋白的能力，以避免溫度驟升引起的蛋白質(zhì)變性和聚集，從而提高它們在夏季高溫下的耐熱能力和存活率。因此，通過將仿刺參幼苗進(jìn)行“北參南養(yǎng)”，經(jīng)過幾代的高溫選育，能夠?yàn)榉麓虆⒛透邷仄废档倪x育提供良好的實(shí)驗(yàn)材料。