外周血EETs水平與咳嗽變異性哮喘患兒Th1和Th2及其細(xì)胞因子、小氣道功能的相關(guān)性分析

蔣萍影,唐國英

(重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院兒科,重慶 405400)

小兒咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一種特殊類型的哮喘,以咳嗽為唯一或主要臨床表現(xiàn),對支氣管擴張劑治療有反應(yīng),具有氣道高反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和氣道重塑等經(jīng)典哮喘特征,CVA患兒往往反復(fù)咳嗽發(fā)作,部分患兒最終進(jìn)展為典型哮喘[1]。嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)參與感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答,參與免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)過程,EOS氣道炎癥可增加CVA小氣道功能障礙[2]。嗜酸性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(eosinophil extracellular traps,EETs)是EOS以彈射器形式釋放的線粒體、細(xì)胞核內(nèi)DNA、組蛋白及游離顆粒組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有免疫調(diào)節(jié)和促炎作用,可促進(jìn)氣道高分泌和炎癥反應(yīng),在哮喘、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[3]。EETs與CVA相關(guān)性的報道十分少見,其臨床意義尚不清楚。本研究擬探討EETs與CVA的免疫功能、炎癥因子及小氣道功能的關(guān)系,以期為臨床CVA的診治提供參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年10月至2022年10月重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院收治的95例CVA患兒為CVA組,其中男51例(53.68%),女44例(46.32%);年齡為5～12歲,平均(9.12±2.09)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《咳嗽的診斷與治療指南(2015)》[4];②近期無呼吸道感染史及激素、免疫抑制劑應(yīng)用史;③年齡在5歲以上,能配合小氣道功能檢測;④患兒家屬或監(jiān)護(hù)人均知情同意,并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并支氣管炎、支氣管擴張、肺癌、囊性纖維化或肺炎等其它肺部疾病;②合并上氣道咳嗽綜合征、嗜酸性支氣管炎和胃食管反流相關(guān)咳嗽;③合并心、肝、腎等重要器官功能障礙;④合并惡性腫瘤。

另選取同期于本院兒科保健門診體檢的67例健康兒童為對照組,均排除近2周內(nèi)感染、免疫缺陷及系統(tǒng)性疾病,其中男39例(58.21%),女28例(41.79%);年齡為5～12歲,平均(9.37±2.21)歲。

CVA組與對照組的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.732、t=0.326,P>0.05)。

本研究已經(jīng)獲得重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號:2019Z210)。

1.2 方法

1.2.1 CVA的診斷標(biāo)準(zhǔn)

①刺激性干咳,清晨或夜間發(fā)作;②支氣管激發(fā)試驗(bronchial provocation test,BPT)陽性或最大呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)平均變異率>10%或支氣管舒張試驗陽性;③抗哮喘治療有效[4]。

1.2.2 EETs的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當(dāng)日),均于次日晨采集外周靜脈血5mL,注入含檸檬酸-葡萄糖溶液的Vacutainer?真空采血管(美國BD公司)中,以密度梯度離心法(挪威Axis-Shield公司生產(chǎn)的LymphoprepTM密度梯度離心液,20℃,879×g離心25min)分離外周血單個核細(xì)胞,再采用EOS分離試劑盒和免疫磁珠細(xì)胞分選(magnetic activated cell sorting,MACS)(美國Miltenyi Biotec公司),從中分離EOS。取外周血EOS(1×106)樣本,將EOS維持在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific)中,用1mg地塞米松(美國Sigma-Aldrich公司)、10mg羥氯喹(美國Sigma-Aldrich公司)或1μg/mL的n-乙酰-l-半胱氨酸(美國Sigma-Aldrich公司)預(yù)處理15min。采用25ng/mL的人重組白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-5(美國Sigma-Aldrich公司)引發(fā)20min,并用0.3μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma-Aldrich公司)刺激3h,以誘導(dǎo)EET。使用Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA試劑盒(美國Invitrogen公司)測量DNA濃度,以QuantiPro BCA Assay Ki(美國Sigma-Aldrich公司)評估蛋白質(zhì)濃度,以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚和抗促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)抗體(美國Cell Signaling公司)對細(xì)胞進(jìn)行染色,用Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss AG公司)觀察形成EETs的EOS,計算形成EETs的EOS百分比,并以%表示。

1.2.3輔助性T淋巴細(xì)胞1和輔助性T淋巴細(xì)胞2的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當(dāng)日),均于次日晨采集外周靜脈血2mL,以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌2次,將細(xì)胞懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Sigma-Aldrich)中,37℃孵育4h,加入50μL乙二胺四乙酸渦旋,室溫下孵育15min,加入5mL FACS Permeabilizing Solution(美國BD Biosciences),去離子水以1∶10比例稀釋,渦旋并孵育10min,250×g離心10min,加入7mL Cell Wash洗滌棄上清,再次洗滌棄上清,平均注入2個流式管中,分別加入20μL干擾素(interferon,IFN)-γ PE(美國Biolegend)、5μL IL-10 PE-Cy7(美國Biolegend),4℃避光孵育30min,PermWash緩沖液重復(fù)洗滌2次,加入450μL的PBS重懸細(xì)胞,用Attune NxT流式細(xì)胞儀(美國賽默飛公司)檢測輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1和Th2細(xì)胞百分比,計算Th1/Th2比值。

1.2.4 Th1和Th2細(xì)胞因子的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當(dāng)日),均于次日晨采集外周靜脈血2mL,注入干燥試管,待血液自然凝固后取上層液離心(37℃,650×g離心5min)分離血清,采用WX-SY96A酶標(biāo)儀(山東萬象環(huán)境科技有限公司),應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測Th1(血清IL-2、IFN-γ)和Th2(血清IL-4、IL-6)細(xì)胞因子水平,試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司。

1.2.5小氣道功能的評估

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當(dāng)日),采用FGY-200便攜式肺功能檢測儀(濟南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司)測定小氣道功能,檢測過程中指導(dǎo)患兒用力吸氣后盡力呼出最大量氣體,記錄25%、50%、75%肺活量的最大呼氣量(FEF25%、FEF50%、FEF75%),以及最大中期呼氣流速(FEF25%～FEF75%),測量3次,取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血形成EETs的EOS百分比水平比較

CVA組外周血形成EETs的EOS百分比為(20.35±6.09)%,對照組為(6.32±1.28)%,CVA組外周血形成EETs的EOS百分比明顯高于對照組,經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.554,P<0.05)。

2.2 兩組Th1和Th2細(xì)胞占比及比值比較

CVA組Th2細(xì)胞占比明顯高于對照組(P<0.05),Th1細(xì)胞占比、Th1/Th2比值均明顯低于對照組,經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組Th1、Th2細(xì)胞占比及Th1/Th2比值的比較

2.3 兩組Th1和Th2細(xì)胞因子水平比較

CVA組血清IL-4、IL-6水平均明顯高于對照組,血清IL-2、IFN-γ水平均明顯低于對照組,經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組Th1和Th2細(xì)胞因子水平的比較

2.4 兩組小氣道功能比較

CVA組FEF25%、FEF50%、FEF75%,以及FEF25%～FEF75%均明顯低于對照組,經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組小氣道功能各指標(biāo)的比較

2.5 外周血形成EETs的EOS百分比與Th1和Th2及其細(xì)胞因子和小氣道功能的相關(guān)性分析

CVA組外周血形成EETs的EOS百分比與Th2細(xì)胞占比及血清IL-4水平和血清IL-6水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.532、0.421、0.395,P<0.05),與Th1細(xì)胞占比、Th1/Th2比值、血清IL-2水平、血清IFN-γ水平、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.253、-0.605、-0.321、-0.385、-0.421、-0.377、 -0.485、 -0.568,P<0.05)。

2.6 外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的價值分析

經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示,外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的臨界值為15.42%,曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.760(95%CI:0.687～0.824),靈敏度為78.95%(75/95),特異度為77.61%(52/67),約登指數(shù)為0.566,見圖1。

3 討論

3.1 EETs與CVA發(fā)病有關(guān)

CVA是導(dǎo)致慢性咳嗽的最主要原因,好發(fā)于學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童,由于缺乏典型的喘息、氣促等哮喘癥狀或體征,臨床上難以與支氣管炎或呼吸道感染鑒別,該病主要臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性夜間咳嗽,不伴喘鳴,通過激素治療可緩解咳嗽癥狀[5-6]。EOS來自骨髓造血干細(xì)胞,含有大量細(xì)胞內(nèi)顆粒,這些顆?？苫罨行粤＜?xì)胞和肥大細(xì)胞,增強Th2免疫應(yīng)答,在氣道高反應(yīng)性和組織重塑中起重要作用[7]。已知EOS可通過胞吐、脫顆粒、細(xì)胞溶解方式釋放次級顆粒。近年來研究發(fā)現(xiàn),除上述方式外,EOS還可以彈出載有特定EOS顆粒蛋白的線粒體DNA,或釋放富含染色質(zhì)的細(xì)胞外誘捕網(wǎng),這一過程稱為EOS誘捕網(wǎng)的形成(eosinophil extracellular trap cell death,EETosis),這一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被稱為EETs[8]。EETs是一種DNA纖維和細(xì)胞毒性顆粒蛋白組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),內(nèi)包含分泌性嗜酸性粒細(xì)胞顆粒,在EOS死亡后可繼續(xù)提供免疫調(diào)節(jié)、促炎和其他免疫致病刺激,DNA纖維則可吞噬體型較大寄生蟲,增加氣道分泌物黏性,DNA骨架上聚集大量分泌型顆粒,不易被巨噬細(xì)胞清除,EETs外層包裹組蛋白分子,不易被內(nèi)源性蛋白酶消化,可穩(wěn)定存活7d[9]。自2008年Yousefi等[10]首次發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者腸黏膜中存在EETs以來,已有多數(shù)研究證實EETs與哮喘[11]、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病[12]、慢性阻塞性肺疾病[13]等多種慢性氣道疾病也存在密切關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn),CVA組患兒外周血形成EETs的EOS百分比明顯高于對照組,說明EETs可能也參與了CVA的發(fā)病過程。

3.2 EETs與CVA患兒Th1/Th2比值失衡有關(guān)

本研究顯示,外周血形成EETs的EOS百分比與Th2細(xì)胞占比及血清IL-4、IL-6水平均呈正相關(guān),與Th1細(xì)胞占比、Th1/Th2比值、IL-2、IFN-γ均呈負(fù)相關(guān),表明外周血EETs的形成與CVA患兒Th1/Th2比值失衡、Th2過度活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。免疫失調(diào)與炎癥反應(yīng)是CVA發(fā)病的主要基礎(chǔ),Th反應(yīng)失衡,使以Th2為主的免疫反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌增多,啟動了免疫級聯(lián)激活反應(yīng),導(dǎo)致IgE產(chǎn)生的增加,促進(jìn)了EOS生長分化,氣道黏液分泌物增加,誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng),進(jìn)而促使CVA發(fā)生和進(jìn)展[14]。EETs可通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域25-整合素連接激酶-蛋白激酶Cα-CRTC1通路激活肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞通過神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)放大過敏性免疫反應(yīng),增加杯狀細(xì)胞增生、黏液產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞浸潤和Th2型細(xì)胞因子表達(dá)[11]。EETs還可引發(fā)不受控制的中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)形成,間接促使呼吸道炎癥性損傷[13]。

3.3 EETs與CVA患兒小氣道功能下降有關(guān)

本研究顯示,形成EETs的EOS百分比與FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈負(fù)相關(guān),表明外周血EETs的形成與CVA患兒小氣道受損有關(guān)。EETs會誘導(dǎo)有毒顆粒蛋白釋放和與損傷相關(guān)的分子模式激活,促使氣道上皮損傷,降低黏液清除率[12]。EETs的DNA骨架可增加氣道局部分泌物黏稠度,導(dǎo)致支氣管阻塞和小氣道功能障礙[15]。EETs參與CVA小氣道損傷也可能通過介導(dǎo)Th1/Th2比值失衡,引起Th2過度活化和炎癥反應(yīng)。推測可能的機制為:首先,EETs游離顆粒內(nèi)含有陽離子蛋白,可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞脫落,破壞氣道上皮完整性和防御功能,并調(diào)節(jié)氣道上皮免疫應(yīng)答,促使炎癥反應(yīng)[16];其次,EETs可直接刺激氣道上皮細(xì)胞釋放IL-33、IL-1α、IL-1β、IL-5等眾多細(xì)胞因子,加劇氣道炎癥損傷,同時IL-5可活化EOS,促使EETs釋放,形成相互促進(jìn)的正反饋通路,加劇氣道炎癥反應(yīng)[17];再次,EOS含有大量細(xì)胞質(zhì)夏科-萊登晶體(charcot-leyden crystals,CLCs),在EETosis過程中伴隨EETs釋放到外周血中[18],而CLCs可促使Th2細(xì)胞分化,誘導(dǎo)Th2型氣道炎癥[19]。由此可見,EETs可能引起Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致小氣道損傷和功能障礙。

3.4 EETs鑒別診斷CVA的價值分析

本研究中經(jīng)ROC曲線分析結(jié)果顯示,外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的AUC為0.760,靈敏度為78.95%,特異度為77.61%,表明EETs在CVA診斷中具有較高的價值,可作為CVA的潛在標(biāo)志物,對臨床診斷和治療有著積極的意義。

綜上,CVA患者外周血形成EETs的EOS百分比顯著增高,高外周血形成EETs的EOS百分比與CVA患兒Th1/Th2比值失衡、以Th2免疫反應(yīng)為主的炎癥反應(yīng)及小氣道損傷有關(guān)。EETs有望成為CVA的新標(biāo)志物,通過抑制EETs的形成可能是治療CVA的一種新方法。