梨形環(huán)棱螺11個(gè)地理種群的幾何形態(tài)學(xué)分析

金武，馬學(xué)艷，彭剛，陳琬雯，聞海波

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214128；3江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017；4中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081）

0 引言

梨形環(huán)棱螺(Bellamyapurificata)俗稱螺螄、豆田螺、石螺，隸屬于腹足綱(Gastropoda)，前鰓亞綱(Prosobranchia)，田螺科(Viviparidae)，環(huán)棱螺屬(Bellamya)，是環(huán)棱螺屬個(gè)體最大的種[1]。該種分布廣、產(chǎn)量大，用途多[2]，日益得到研究者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注[3]。梨形環(huán)棱螺作為全國47萬hm2養(yǎng)殖河蟹重要的天然餌料之一，在長江禁漁后每年缺口達(dá)100～150 萬t[4]。此外，石螺包括梨形環(huán)棱螺、方形環(huán)棱螺、銅銹環(huán)棱螺等作為柳州螺螄粉的重要原料之一，在柳州地區(qū)每年缺口近3萬t[5]。但對國內(nèi)梨形環(huán)棱螺種質(zhì)資源、分布狀況以及不同群體之間的進(jìn)化關(guān)系仍需進(jìn)一步系統(tǒng)調(diào)查。

幾何形態(tài)學(xué)測量法是關(guān)于形態(tài)定量比較的科學(xué)計(jì)算工具，使用數(shù)學(xué)方法描述或分析圖像形狀結(jié)構(gòu)的方法，根據(jù)研究方式的不同分為輪廓法和地標(biāo)點(diǎn)法[6-7]，其中地標(biāo)點(diǎn)法在水生動(dòng)物形態(tài)的研究中得到廣泛應(yīng)用，其中以甲殼類和以魚類為代表的脊椎動(dòng)物的研究最為廣泛[8-10]。國內(nèi)對軟體動(dòng)物的報(bào)道限于單齒螺[11]、櫛孔扇貝[12]、菲律賓蛤仔[13]等，本研究通過幾何形態(tài)測量學(xué)(Geometric Morphometric)的方法，統(tǒng)計(jì)和分析不同地理種群的梨形環(huán)棱螺的形態(tài)學(xué)上的差異，以期為梨形環(huán)棱螺開展科學(xué)選育和增養(yǎng)殖工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與圖像采集

梨形環(huán)棱螺樣品采集自11個(gè)地點(diǎn)，具體采集點(diǎn)信息如表1。梨形環(huán)棱螺的鑒別參照文獻(xiàn)[14]。每個(gè)地點(diǎn)的樣品規(guī)格在2～5 g，再挑選殼頂和外殼無損傷的個(gè)體進(jìn)行拍照。樣品采集回實(shí)驗(yàn)室后，暫養(yǎng)于貝類循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，待所有種群采集齊全后統(tǒng)一處理。樣品放置于用白色細(xì)石英砂(Φ=0.2～0.5mm)填滿的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿平面、手機(jī)、翻拍架經(jīng)水平儀校驗(yàn)，以保證手機(jī)透鏡中心軸與拍攝面垂直。鏡頭中心、培養(yǎng)皿中心、樣品成像區(qū)域中心在同一縱軸。鏡頭與成像區(qū)域中的標(biāo)本的距離為30 cm。光圈1.8，曝光時(shí)間1/144 s，拍攝角度為殼口觀[15]。拍照時(shí)每個(gè)樣品拍照3次，然后選擇最佳的圖片用于后續(xù)分析。圖像保存格式為jpg。拍照由同一個(gè)人員完成。

表1 樣品采集信息

1.2 數(shù)據(jù)整理與清洗

將照片中不同角度拍攝的照片統(tǒng)一用GIMP(Version 2.10.24)調(diào)整為殼頂在上，螺口在垂直軸線右側(cè)。使用tpsUtil(Version 1.81)將獲取的照片轉(zhuǎn)換為.tps 格式文件。參照文獻(xiàn)[16]，利用tpsDig2(Version 2.31)在拍攝好的圖片上建立地標(biāo)標(biāo)點(diǎn)，具體如圖1 所示。獲取相應(yīng)地標(biāo)點(diǎn)的x、y坐標(biāo)值并建立數(shù)據(jù)文件。殼頂為第1 個(gè)地標(biāo)點(diǎn)，順時(shí)針編號，第1～24 個(gè)點(diǎn)為地標(biāo)點(diǎn)。為了克服地標(biāo)點(diǎn)不能涵蓋整體的形態(tài)信息的缺點(diǎn)[7,17]，在其中11～12、12～13、13～14、14～15、15～11、15～16地標(biāo)點(diǎn)之間等距設(shè)置15個(gè)半地標(biāo)點(diǎn)。用R[18]軟件中的Geomorph 包的利用plotOutliers 檢查地標(biāo)點(diǎn)的超過上四分位的異常值情況并利用estimate.missing函數(shù)檢查缺失值，缺失值檢查采用薄板樣條曲線(thin plate spline，TPS)法進(jìn)行[19]。

圖1 梨形環(huán)棱螺地標(biāo)點(diǎn)設(shè)置

1.3 數(shù)據(jù)分析

用R[18]軟件(version 4.1.1)中的Geomorph 包[20](version 4.0.0)的read.tps 函數(shù)讀取創(chuàng)建的.tps 格式文件。利用gpagen 函數(shù)經(jīng)獲得地標(biāo)點(diǎn)經(jīng)普氏疊加的分布情況，對每個(gè)樣品的地標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行平移置中，計(jì)算出質(zhì)心距離(Proj=T)，求出平均型。根據(jù)不同地理種群劃分為11 個(gè)組別，并利用geomorph.data.frame 合并坐標(biāo)和群體組別。用gm.prcomp函數(shù)進(jìn)行普氏形狀變量的主成分分析(PCA)，以確定形狀變化的主軸，Geomorph包[20]中的plot.gm.prcomp 函數(shù)繪制前2 個(gè)主成分的散點(diǎn)圖。

不同地理種群的平均外形通過mshape函數(shù)估計(jì)，再利用gpagen 函數(shù)獲取不同地理種群地標(biāo)點(diǎn)的平均值經(jīng)gpagen普氏疊加的分布情況，并利用verbose選項(xiàng)輸出普氏距離矩陣[21]，并利用hclust繪制非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA) 聚 類 樹 。 使 用plotRefToTarget 函數(shù)，生成方格變形圖。用procD.lm函數(shù)檢驗(yàn)不同地理種群對外殼形態(tài)的影響[21]，置換檢驗(yàn)采用殘差隨機(jī)化程序(Residual randomization in permutation procedures，RRPP)選項(xiàng)進(jìn)行[22]。用Morpho包[23]中的relWarps繪制出幾何形態(tài)的扭曲情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨形環(huán)棱螺不同地理群體普氏疊印結(jié)果

排除了不同群體、不同個(gè)體之間的大小差異后，梨形環(huán)棱螺不同地理種群地標(biāo)點(diǎn)普氏疊印的結(jié)果如圖2，總體反映出梨形環(huán)棱螺11 個(gè)地理種群在不同地標(biāo)點(diǎn)位置的差異。結(jié)果顯示，螺殼形態(tài)的主要變異位置是殼頂及螺口上緣。如圖3 所示，原始數(shù)據(jù)中僅將湖北潛江的第10個(gè)個(gè)體列入異常值，說明原始數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

圖2 梨形環(huán)棱螺所有樣本地標(biāo)點(diǎn)疊印

圖3 異常值檢查結(jié)果

2.2 梨形環(huán)棱螺不同地理群體主成分分析

在研究貝殼的形狀多樣性中，可以集中于形狀變異的主要特征值，減少數(shù)據(jù)計(jì)算量[15]。梨形環(huán)棱螺不同地理種群殼口觀的主成分的PC1 占37.53%，PC2 占16.06%，且前4 個(gè)主成分累計(jì)占比僅69.90%，說明梨形環(huán)棱螺的外形變異的集中性較差。第1主成分和第2主成分不能概括不同地理種群之間的形態(tài)學(xué)特征差異。如圖4所示，不同群體不能形成較為集中的區(qū)域，僅有少數(shù)個(gè)別點(diǎn)重疊。

圖4 249個(gè)個(gè)體普氏坐標(biāo)主成分分析散點(diǎn)圖

2.3 梨形環(huán)棱螺不同地理群體普氏距離方差分析

梨形環(huán)棱螺不同地理種群普氏距離的方差分析結(jié)果如表2所示，這11個(gè)地理種群的外形存在顯著差異(p＜0.01)。

表2 梨形環(huán)棱螺不同地理種群普氏距離方差分析

2.4 梨形環(huán)棱螺不同地理群體聚類

不同地理種群的梨形環(huán)棱螺聚類圖如圖5 所示，這11個(gè)群體主要可分為3支。浙江淳安群體和廣東揭陽群體聚為一個(gè)分支，其余9 個(gè)群體被大致劃分為長江流域和長江以南2支。

圖5 梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體聚類圖

3 結(jié)論

梨形環(huán)棱螺11 個(gè)地理種群外部形態(tài)的主要變異位置是殼頂及螺口上緣。不同地理種群形態(tài)特征變異的集中性較差，主成分分析不能顯著區(qū)別區(qū)分不同的群體。這11 個(gè)群體大致可以劃分為長江流域群體和長江以南群體兩大類，且不同群體的外形特征存在顯著差異。這種外形差異可能與當(dāng)?shù)氐纳秤嘘P(guān)。

4 討論

4.1 幾何形態(tài)學(xué)分析的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的形態(tài)計(jì)量學(xué)相比，幾何形態(tài)學(xué)克服了測量標(biāo)準(zhǔn)不一致、不同研究人員和不同研究對象導(dǎo)致的數(shù)據(jù)重復(fù)性差的缺點(diǎn)，同時(shí)將傳統(tǒng)線性測量中大小和形狀2個(gè)因素分開分析，具有顯著的優(yōu)勢[12,24]。對螺類的幾何形態(tài)學(xué)的研究甚至可以為開展交叉學(xué)科提供支持，深入探討螺類對生境中的污染物的反應(yīng)，如生態(tài)毒理學(xué)[25]。隨著三維成像技術(shù)以及高速計(jì)算機(jī)的發(fā)展，對于某些生物類群的幾何形態(tài)學(xué)的分析可能會(huì)比基于DNA 條形碼技術(shù)更加簡單、直觀和高效[26]，為水產(chǎn)動(dòng)物表型組學(xué)研究提供支撐。不同地理種群之間的形態(tài)變異可以檢驗(yàn)亞種分類的有效性，從而對分類上的一些疑難問題進(jìn)行厘清。此外，在種上水平還可以探討不同物種之間的形態(tài)分化及其異速進(jìn)化現(xiàn)象[7]。通過結(jié)合分子標(biāo)記對不同群體進(jìn)行遺傳距離分析并結(jié)合幾何形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果，還可以量化分析物種的生存環(huán)境，揭示這些生態(tài)環(huán)境的變化與形態(tài)變化之間的相關(guān)性，即生態(tài)相關(guān)性(ecological concordance)。

4.2 梨形環(huán)棱螺的幾何形態(tài)學(xué)分析

除浙江淳安群體因樣本量太少可能引起聚類誤差外，本研究中11個(gè)群體可以大致劃分為長江流域和長江以南區(qū)域兩大地理區(qū)域，這與分子生物學(xué)的研究結(jié)果一致[27]。長江水系在很長一段時(shí)間與兩岸湖泊相互連通，湖泊水系連通性好[28]，以及長江流域頻發(fā)的洪水可能促進(jìn)了長江流域梨形環(huán)棱螺的擴(kuò)散和種群之間的交流。梨形環(huán)棱螺11 個(gè)地理種群形態(tài)變異最大處為殼頂及螺口上緣，這與阿根廷瀕危的Aylacostoma屬的3 個(gè)種的幾何形態(tài)學(xué)分析結(jié)果一致[16]。對非洲截頭海蜷Cerithideadecollata的研究表明，貝殼形狀的形態(tài)變化與遺傳分化無關(guān)，與緯度梯度的分布有關(guān)，同時(shí)在地方一級的種群間又受到沿海地區(qū)生態(tài)的共同作用[29]。Aylacostoma屬的3個(gè)種形態(tài)學(xué)差異與生境不同和是否暴露在水流中有關(guān)[30]。 對Littorinasaxatilis[31]、Pyrenaearia屬[31]、Trophongeversianus[32]形態(tài)學(xué)變異的研究都表明與其所在的生境有關(guān)。梨形環(huán)棱螺種群間沒有形成明顯的地理格局分布，外部幾何形態(tài)學(xué)的差異也可能與采樣點(diǎn)所在的地理環(huán)境特點(diǎn)具有較強(qiáng)相關(guān)性，但與環(huán)境中具體哪些因子相關(guān)仍需進(jìn)一步研究。