基于高通量測序的昭通核心煙區(qū)植煙土壤真菌多樣性分析

倪霞，龔林，陳華，宋明健，周玉忠，陳敏，付業(yè)明，龔浩瀚，盤文政，張孟升，羅啟鵬，李建云，鮑宏明，李德文，張海鹍

（1云南省煙草公司昭通市公司，云南昭通 657000；2昭通市植保植檢站，云南昭通 657000；3云南云葉化肥股份有限公司，昆明 650217）

0 引言

煙草作為云南的支柱產(chǎn)業(yè)之一，多年來由于化肥的大量施用及不合理的耕作方式，使得植煙土壤板結(jié)、酸化等現(xiàn)象日突出，制約了煙葉品質(zhì)的提升[1]。要提升煙葉品質(zhì)，首先就得改良土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤肥力，增加土壤微生物多樣性，以促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[2-4]。真菌作為土壤微生物的重要組成部分，其能分解有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)植株生長[5]。因此，研究植煙土壤真菌多樣性對(duì)提升煙葉品質(zhì)具有重要意義。研究表明，長期馬鈴薯連作地塊土壤中的真菌數(shù)顯著高于其他種植模式，真菌病害易多發(fā)、高發(fā)[6]。張藝潔等[7]利用高通量測序技術(shù)，測試施肥對(duì)連作植煙土壤微生物多樣性的影響，結(jié)果表明，有機(jī)質(zhì)是影響土壤真菌群落多樣性的主要因素。陳丹梅等[8]利用454高通量測序技術(shù)，探究輪作對(duì)植煙土壤真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)長期輪作可極大的改變土壤中真菌的組成及類型。楊靈朋等[9]采用Biolog-ECO 微平板技術(shù)測定煙草根腐病發(fā)生的土壤微生物功能多樣性，無病土壤的土壤微生物的豐富度和均勻度高于發(fā)病土壤，且無病土壤中的微生物對(duì)碳源的利用能力更強(qiáng)。近年來，微生物多樣性的研究方法層出不窮出不窮，包括平板培養(yǎng)法、BIOLOG生態(tài)平板法、PCR-DGGE法以及高通量測序技術(shù)等[10-15]，其中高通量測序較其它方法能快速、客觀的反應(yīng)微生物的數(shù)量及多樣性[16]。本研究采用高通量測序技術(shù)，定量、定向的分析研究昭通植煙土壤真菌組成、指示物種、多樣性，并對(duì)真菌群落的功能進(jìn)行預(yù)測。以期全面深入了解昭通核心煙區(qū)土壤真菌的多樣性，針對(duì)其表征特點(diǎn)進(jìn)行合理施肥耕作規(guī)劃，提升煙葉品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤樣品

供試土壤樣品采集于昭通市昭陽區(qū)、魯?shù)?、巧家、?zhèn)雄、彝良、威信、大關(guān)和永善8 個(gè)縣的388 個(gè)土壤樣品。具體情況如表1所示。

表1 供試土壤樣品

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

不同植煙土壤按新煙區(qū)（A組）、連作區(qū)（B組）、輪作區(qū)（E組）分類進(jìn)行組間比較。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取微生物DNA 的提取使用HiPure Soil DNA提取試劑盒(Magen,Guangzhou,China)按照操作指南進(jìn)行。

1.3.2 真菌ITS rDNA 測序提取基因組DNA，用帶有barcode（測序接頭）的特異引物擴(kuò)增rDNA 的保守區(qū)，引物序列信息如表2。擴(kuò)增體系：50 μL 混合物，包含10 μL 5 × Q5@ Reaction Buffer,10 μL 5 × Q5@ High GCEnhancer，1.5 μL 2.5 mM dNTPs，1.5 μL上下游引物(10 μM),0.2 μL Q5@ High-Fidelity DNAPolymerase,50 ng 模板DNA。擴(kuò)增條件：95℃5 min，然后95℃1 min，60℃1 min，72℃1 min 進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72℃7 min。從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴(kuò)增子，使用凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化，并使用ABI StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(Life Technologies,Foster City,USA)進(jìn)行定量，將純化后的擴(kuò)增子在Illumina 平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序(PE250)。

表2 引物序列信息

1.4 生物信息分析

1.4.1 質(zhì)控統(tǒng)計(jì)用FASTP[17]對(duì)Illumina 平臺(tái)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得的clean reads 用于組裝分析。使用FLASH[18]將clean reads 按最小重疊為10 bp，錯(cuò)配率最高2%的閾值合并為tag。依據(jù)Bokulich 等[19]的過濾條件，對(duì)低質(zhì)量tag 進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的clean tag。使用UPARSE[20]流程將clean tag 按≥97%相似度聚類為OTUs（operational taxonomic units，操作分類單元）。

1.4.2 物種組成分析使用Krona[21]顯示每個(gè)物種分類的豐度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。物種豐度堆疊圖使用R 語言ggplot2包[22]展示。

1.4.3 指示物種分析使用R 語言VennDiagram 包[23]進(jìn)行Venn 分析和R 語言UpSetR 包[24]分析組間共有特有物種/OTU。兩組間物種豐度差異分析使用R 語言Vegan 包[25]進(jìn)行Welch’st 檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)計(jì)算。使用LEfSe 軟件[26]對(duì)各分組的Biomarker 物種進(jìn)行篩選。

1.4.4 Alpha 多樣性分析 Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Good’s coverage多樣性指數(shù)在QIIME[27]中計(jì)算。使用R 語言ggplot2 包[22]繪制多樣性指數(shù)稀釋曲線。多組間的Alpha 指數(shù)比較使用R 語言Vegan 包[25]（版本2.5.3）進(jìn)行Tukey’s HSD 檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。

1.4.5 功能預(yù)測使用FUNGuild[28]推斷真菌的功能組(guild)。使用PICRUSt 進(jìn)行樣本真菌MetaCyc 數(shù)據(jù)庫(MetaCycMetabolic Pathway Database)pathway 功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌群落組成分析

結(jié)合OTUs 分類關(guān)系，核心煙區(qū)土壤真菌群落涵蓋30個(gè)門、79個(gè)綱、202個(gè)目、443個(gè)科和976個(gè)屬。

由圖1和表3可以看出，真菌群落門水平相對(duì)豐度在0.05%以上的門分別為子囊菌門(73.95%～81.36%)、被孢霉門(9.48%～16.05%)、擔(dān)子菌門(6.68%～7.72%)、壺菌門(0.48%～0.86%)、毛霉門(0.23%～0.45%)和球囊菌門(0.06%～0.11%)。子囊菌門為昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的絕對(duì)優(yōu)勢門，相對(duì)豐度占比73.95%～81.26%。三類土壤真菌群落相對(duì)豐度前3 的門均為：子囊菌門、被孢霉門和擔(dān)子菌門。

圖1 不同真菌類群在門水平的相對(duì)豐度

表3 不同真菌類群在門水平的相對(duì)豐度物種相對(duì)豐度表

由表4 和圖2 可知，屬水平相對(duì)豐度前10 的分別為被孢霉屬(9.48%～16.05%)、青霉菌屬(7.98%～9.21%)、擬青霉菌屬(1.55%～6.72%)、曲霉菌屬(1.80%～4.00%)、假裸囊菌屬(1.33%～4.11%)、鑲刀菌屬(1.75%～3.65%)、腐質(zhì)霉屬(1.89%～2.56%)、殼二胞菌屬(1.29%～2.55%)、籃狀菌屬(0.81%～1.89%)和柱孢屬(0.51%～2.15%)。腐質(zhì)霉屬和殼二胞菌屬新煙區(qū)的土壤中相對(duì)豐度較高，青霉菌屬、擬青霉菌屬、假裸囊菌屬和籃狀菌屬在連作區(qū)相對(duì)豐度較高，被孢霉屬、曲霉菌屬、鑲刀菌屬和柱孢屬在輪作區(qū)相對(duì)豐度較高。被孢霉屬和青霉菌屬為昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的優(yōu)勢屬，相對(duì)豐度占比分別為9.48%～16.05%和7.98%～9.21%。三類土壤真菌群落相對(duì)豐度前2的屬均為被孢霉屬和青霉菌屬，新煙區(qū)土壤真菌群落相對(duì)豐度第3的為腐質(zhì)霉屬，連作區(qū)的為擬青霉菌屬，輪作區(qū)的為鑲刀菌屬。

圖2 不同真菌類群在屬水平的相對(duì)豐度

表4 不同真菌類群在屬水平的相對(duì)豐度物種相對(duì)豐度表

2.2 真菌群落指示物種分析

2.2.1 不同類型土壤真菌群落中優(yōu)勢物種差異性分析由圖3可知，在門水平新煙區(qū)土壤真菌群落被孢霉門、擔(dān)子菌門、球囊菌門的相對(duì)豐度顯著高于連作區(qū)，毛霉門的相對(duì)豐度顯著高于輪作區(qū)；子囊菌門連作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)，子囊菌門和毛霉門的連作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于輪作區(qū)；壺菌門的輪作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)，被孢霉門和壺菌門輪作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于連作區(qū)。由圖4 可知，在屬水平殼二胞菌屬的相對(duì)豐度新煙區(qū)顯著高于連作區(qū)和輪作區(qū)，擬青霉菌屬、假裸囊菌屬和籃狀菌連作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)和輪作區(qū)，輪作區(qū)鑲刀菌屬的相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)、被孢霉屬的相對(duì)豐度顯著高于連作區(qū)。

圖3 真菌群落門水平相對(duì)豐度Wilcoxon秩和檢驗(yàn)

圖4 真菌群落屬水平相對(duì)豐度Wilcoxon秩和檢驗(yàn)

2.2.2 不同類型土壤真菌群落中特有物種分析由表5、圖5可知，新煙區(qū)土壤真菌群落特有物種主要涵蓋：1個(gè)門、4個(gè)綱、5個(gè)目、24個(gè)科和67個(gè)屬；連作區(qū)特有物種涵蓋：2個(gè)目、13個(gè)科和30個(gè)屬；輪作區(qū)特有物種涵蓋1個(gè)門、3個(gè)綱、5個(gè)目、13個(gè)科和32個(gè)屬。整體來看，新煙區(qū)土壤真菌群落特有物種多于連作區(qū)和輪作區(qū)。

圖5 物種VENN圖

表5 昭通核心煙區(qū)不同類型土壤真菌群落特有物種列表

2.2.3 不同類型土壤真菌群落中差異指示物種分析由圖6可以看出，新煙區(qū)、連作區(qū)和輪作區(qū)土壤樣本群落組成大部分重疊，利用LEfSe軟件對(duì)新煙區(qū)、連作區(qū)和輪作區(qū)土壤進(jìn)行線性判別分析(LDA)，未探尋到引起不同類型植煙土壤產(chǎn)生顯著性差異的指示物種，進(jìn)一步表明新煙區(qū)、連作區(qū)和輪作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異不顯著。

圖6 昭通核心煙區(qū)不同類型土壤真菌群落組間比較分析

2.3 真菌群落多樣性特征分析

從表6中可知，新煙區(qū)土壤真菌群落的Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)最高，輪作區(qū)次之，連作區(qū)最低；新煙區(qū)香濃指數(shù)最高，連作區(qū)次之，輪作區(qū)最低；連作區(qū)辛普森指數(shù)最高，新煙區(qū)次之，輪作區(qū)最低。由圖7可以看出，新煙區(qū)的Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)與連作區(qū)和輪作區(qū)均有極顯著差異，香農(nóng)指數(shù)與輪作區(qū)有極顯著差異、連作區(qū)有顯著差異，辛普森指數(shù)與連作區(qū)和輪作區(qū)差異均不顯著；連作區(qū)的Sobs指數(shù)和香濃指數(shù)與輪作區(qū)有顯著差異，Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)和辛普森指數(shù)與輪作區(qū)有極顯著差異。由此可見新煙區(qū)土壤真菌群落的生物多樣性最高，物種豐富度顯著高于連作區(qū)和輪作區(qū)；輪作區(qū)土壤真菌群落的物種豐富度顯著高于連作區(qū)，物種均勻度顯著低于連作區(qū)，真菌群落生物多樣性略高于連作區(qū)。

圖7 昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的生物多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

表6 昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的生物多樣性指數(shù)

由圖8可知A、B、E 3個(gè)分組的稀釋曲線均趨于平緩，說明包括的稀有物種在內(nèi)的土壤真菌均得到較好分析，比較真實(shí)地反映了該研究區(qū)的真菌群落組成。

圖8 昭通核心煙區(qū)土壤真菌的稀釋曲線

2.4 真菌群落的FUNGuild功能預(yù)測

采用FUNGuild 對(duì)昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的營養(yǎng)型和功能群進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果見表7 和圖9。從表和圖中可以看出，昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落可被區(qū)分為6個(gè)不同的營養(yǎng)型，分別為病理營養(yǎng)型、病理—腐生營養(yǎng)型、病理—腐生—共生營養(yǎng)型、病理—共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、腐生—共生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型，其中病理營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型和腐生—共生營養(yǎng)型的真菌群落為主要組成，占比分別為7.50%～14.17%、10.28%～15.02%和10.55%～17.61%。不同營養(yǎng)型的真菌群落，在不同類型的土壤中豐度值有差異。如圖10所示，病理營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型的真菌群落以連作區(qū)的最高，病理—腐生營養(yǎng)型、病理—共生營養(yǎng)型和腐生—共生營養(yǎng)型以新煙區(qū)和輪作區(qū)的較高，病理—腐生—共生營養(yǎng)型以輪作區(qū)的最高，共生營養(yǎng)型以新煙區(qū)的最高。整體來看，新煙區(qū)真菌群落占比前1至前3的營養(yǎng)型分別為腐生—共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型，連作區(qū)分別為腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型和腐生—共生營養(yǎng)型，輪作區(qū)分別為腐生—共生營養(yǎng)型、病理—腐生—共生營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型，說明輪作有利于降低病理營養(yǎng)型的真菌群落，能減少真菌性病害發(fā)生的幾率。

圖9 昭通核心煙區(qū)真菌群落功能分布圖

圖10 真菌群落功能豐度熱圖

表7 昭通核心煙區(qū)真菌群落功能分布總覽表

3 結(jié)論與討論

3.1 昭通核心煙區(qū)土壤微真菌生物群落組成

昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落涵蓋30 個(gè)門、79 個(gè)綱、202 個(gè)目、443 個(gè)科和976 個(gè)屬，其中子囊菌門、被孢霉門、擔(dān)子菌門、壺菌門、毛霉門和球囊菌門真菌群落門水平相對(duì)豐度均在0.05%以上。昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的絕對(duì)優(yōu)勢門為子囊菌門，相對(duì)豐度占比73.95%～81.26%。三類土壤真菌群落相對(duì)豐度前3 的門均為：子囊菌門、被孢霉門和擔(dān)子菌門。屬水平相對(duì)豐度前10 的分別為被孢霉屬、青霉菌屬、擬青霉菌屬、曲霉菌屬、假裸囊菌屬、鑲刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、殼二胞菌屬、籃狀菌屬和柱孢屬。被孢霉屬和青霉菌屬為昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的優(yōu)勢屬，相對(duì)豐度占比分別為9.48%～16.05%和7.98%～9.21%。三類土壤真菌群落相對(duì)豐度前2的屬均為被孢霉屬和青霉菌屬，新煙區(qū)土壤真菌群落相對(duì)豐度第3的為腐質(zhì)霉屬，連作區(qū)的為擬青霉菌屬，輪作區(qū)的為鑲刀菌屬。

3.2 昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落指示物種

土壤真菌群落殼二胞菌屬的相對(duì)豐度新煙區(qū)顯著高于連作區(qū)和輪作區(qū)，擬青霉菌屬、假裸囊菌屬和籃狀菌屬連作區(qū)相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)和輪作區(qū)，輪作區(qū)鑲刀菌屬的相對(duì)豐度顯著高于新煙區(qū)、被孢霉屬的相對(duì)豐度顯著高于連作區(qū)。新煙區(qū)土壤真菌群落特有物種多于連作區(qū)和輪作區(qū)，新煙區(qū)、連作區(qū)和輪作區(qū)土壤樣本真菌群落組成大部分重疊，不同類型土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異不顯著。

3.3 昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落生物多樣性特征

新煙區(qū)土壤真菌群落的生物多樣性最高，物種豐富度顯著高于連作區(qū)和輪作區(qū)；土壤真菌群落的物種豐富度輪作區(qū)顯著高于連作區(qū)，物種均勻度輪作區(qū)顯著低于連作區(qū)，真菌群落生物多樣性輪作區(qū)略高于連作區(qū)。

3.4 昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落的功能

昭通核心煙區(qū)土壤真菌群落可被區(qū)分為6個(gè)不同的營養(yǎng)型，分別為病理營養(yǎng)型、病理—腐生營養(yǎng)型、病理—腐生—共生營養(yǎng)型、病理—共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、腐生—共生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型，其中病理營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型和腐生—共生營養(yǎng)型的真菌群落為主要組成，占比分別為7.50%～14.17%、10.28%～15.02%和10.55%～17.61%。不同營養(yǎng)型的真菌群落，在不同類型的土壤中豐度值有差異。整體來看，新煙區(qū)真菌群落占比前1至前3的營養(yǎng)型分別為腐生—共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型，連作區(qū)分別為腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型和腐生—共生營養(yǎng)型，輪作區(qū)分別為腐生—共生營養(yǎng)型、病理—腐生—共生營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型，說明輪作有利于降低病理營養(yǎng)型的真菌群落，能減少真菌性病害發(fā)生的幾率。