北京市油松林根際真菌種類(lèi)調(diào)查
——松山自然保護(hù)區(qū)為例

高丙英，王平，王艷春，丁熙，張經(jīng)緯，劉淑英

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，蘭州 730070；2北京市園林綠化科學(xué)研究院土壤與水研究所，北京 100102；3北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，北京 102115）

0 引言

油松(Pinustabuliformis)是中國(guó)北方廣大地區(qū)造林的先鋒樹(shù)種[1]，也是延慶區(qū)的主要造林樹(shù)種[2]，在改善氣候、涵養(yǎng)水源、固碳釋氧及美化環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。北京地區(qū)油松廣泛分布，北京市現(xiàn)有森林面積45.5 萬(wàn)hm2，其中油松人工林占總面積的17.3%，在保護(hù)地區(qū)生態(tài)安全方面起到非常重要的作用[5]。然而，多數(shù)松科植物的根毛較少，依賴(lài)菌根吸收水分和養(yǎng)分。在其長(zhǎng)期的生存進(jìn)化過(guò)程中，樹(shù)木已形成依賴(lài)菌根在自然條件下成活和生長(zhǎng)的特性[6]。在自然條件下沒(méi)有菌根就生長(zhǎng)不良，甚至死亡[7]。因此，為提高油松的造林成活率和加快幼樹(shù)的生長(zhǎng)，使油松幼苗的根系形成更多的菌根，可通過(guò)自然感染和人工接種，以明確油松林根際真菌資源狀況，更好地開(kāi)發(fā)、利用這一資源。

根際(Rhizosphere)一般是指根—土界面不足1 mm到幾毫米范圍的微區(qū)土壤，它是土壤水分和礦質(zhì)養(yǎng)分進(jìn)入根系參與生物循環(huán)的門(mén)戶(hù)，同時(shí)也是根系自身生命活動(dòng)和代謝對(duì)土壤影響最直接、最強(qiáng)烈的區(qū)[8]。根系從土壤環(huán)境中吸收自身所需要的各種養(yǎng)分并與土壤直接接觸，兩者之間不斷地進(jìn)行著物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，從而從根本上影響著養(yǎng)分從土壤進(jìn)入植物體的過(guò)程[9]。近年來(lái)人們非常關(guān)注根際微生態(tài)系統(tǒng)土壤環(huán)境的研究[10-11]，但對(duì)林木根際土壤真菌的研究很少。

本研究主要以北京市松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)人工油松林、天然油松林2種主要群落類(lèi)型為研究對(duì)象，研究不同油松林下根際真菌多樣性，研究結(jié)果對(duì)北京城區(qū)及周邊山區(qū)根際真菌的資源保護(hù)、合理開(kāi)發(fā)和可持續(xù)利用具有重要意義，同時(shí)為松林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)、有效防止植物病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

北京市松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)為研究地區(qū)，位于北京市延慶縣西北部，屬于燕山山脈軍都山，為中山地帶，地勢(shì)西高東低。地理位置介于40°29′—40°33′N(xiāo)，115°43′—115°50′E，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，春季干旱多風(fēng)，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥。年平均降雨量為493 mm，主要集中于6—9月，年均蒸發(fā)量為1772 mm，是降雨量的3 倍多。年平均日照時(shí)數(shù)為2843.7 h，年平均氣溫為8.5℃左右。

松山自然保護(hù)區(qū)有著華北地區(qū)唯一成片的天然次生油松林，是華北地區(qū)最具有代表性的生態(tài)較為完好的落葉闊葉林生態(tài)系統(tǒng)[12]。由海拔變化導(dǎo)致的溫度和水分分布變化使其形成了較為明顯的植被垂直分布帶，土壤垂直變化明顯，主要分為山地褐土、山地棕壤和山地草甸土。保護(hù)區(qū)林分主要包括油松針葉林，以及 由 山 楊 (Populusdavidiana)、 蒙 古 櫟(Quercusmongolica)和核桃楸(Juglansmandshurica)等組成的闊葉林。尤其油松在海拔100～2600 m 地帶均可生長(zhǎng)。

圖1是2020—2022年北京市和延慶區(qū)年均氣候及降雨圖。從中可以看出，5—12月期間，北京市和延慶區(qū)氣溫在7月均達(dá)到最高峰后逐漸降低；北京市降雨量最高峰出現(xiàn)在7月，8月降雨量驟降，而延慶區(qū)降雨量最高峰出現(xiàn)在7月，在8、9月出現(xiàn)小高峰，其余月份降雨量均極少。

圖1 2022年5—12月氣溫及降雨量

1.2 試驗(yàn)材料

于北京市延慶區(qū)(40°47′N(xiāo),116°34′E)松山采集的土樣、子實(shí)體中篩選培養(yǎng)，供試土樣、子實(shí)體采自人工油松林、天然油松林2 類(lèi)林地。不同油松群落基本情況見(jiàn)表1。

表1 2種油松林的基本信息

采樣點(diǎn)距植株主干30 cm，用土鉆按0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm 的深度分別采集3 層土樣，每層采土樣約2.0 kg。帶回試驗(yàn)室自然風(fēng)干，四分法縮取，研磨并通過(guò)孔徑為2 mm的篩，測(cè)定土壤pH值、EC值、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀等相關(guān)指標(biāo)分析。

采集根際土樣時(shí)鏟去表土，沿著根部挖掘至根的末級(jí)（深挖），將采集的帶有根系的土塊，用力抖動(dòng)，使較大土粒脫落，脫落土粒為非根圍土壤，剩余的黏附在根系上的則為根圍土壤[13]，取附著根系0～4 mm左右的土壤為根際土。將土樣裝入無(wú)菌自封袋中并編號(hào)，標(biāo)記好采樣地點(diǎn)、時(shí)間與坡向等，置于便攜式冷藏箱內(nèi)帶回。在實(shí)驗(yàn)室中立即剔除植物殘?bào)w、碎石等雜物，過(guò)2 mm篩備用。4℃冰箱內(nèi)保存，使用時(shí)間不超過(guò)一周。

子實(shí)體采集時(shí)間一般選在雨季初期，6—8月是林地內(nèi)菌根真菌子實(shí)體大量出現(xiàn)的季節(jié)[14]。野外采集過(guò)程中，首先觀察、鑒定，并采取現(xiàn)場(chǎng)拍照記錄，以詳細(xì)準(zhǔn)確記錄新鮮子實(shí)體的形態(tài)特征。每種子實(shí)體采集2～5株，放入帶有編號(hào)的自封袋，置于便攜式冷藏箱內(nèi)帶回。當(dāng)天分離培養(yǎng)（也有采集后2～3 d 的），以防腐爛置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

本試驗(yàn)于2022年6—12月共計(jì)6 個(gè)月，試驗(yàn)在北京市園林綠化科學(xué)研究土壤與水研究所無(wú)菌室內(nèi)篩選培養(yǎng)菌種，采用MMN 固體培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)菌種進(jìn)行平板培養(yǎng)[15-16]。培養(yǎng)基組成成分，見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基組成成分

1.3.1 土樣真菌培養(yǎng)采用稀釋涂布平板法、尖端菌絲挑取法和平板劃線(xiàn)法進(jìn)行真菌分離純化。通過(guò)梯度稀釋?zhuān)箲乙阂来蜗♂屩?0-1～10-6，取0.1 mL不同稀釋梯度的懸液涂布于MMN 固體培養(yǎng)基中（已加入終濃度為200 μg/mL 的青鏈霉素溶液），每個(gè)稀釋梯度做3 個(gè)平行；將涂布完畢的平板置于生化培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)，每日定期觀察真菌長(zhǎng)出情況，待長(zhǎng)出菌絲后，采用尖端菌絲挑取法，把菌絲轉(zhuǎn)移到新的固體MMN 平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3～4次。有雜菌污染則立即剔除并重新純培。

1.3.2 子實(shí)體真菌培養(yǎng)所有分離工作均在超凈工作臺(tái)上完成。將采集的新鮮、健康的完整子實(shí)體測(cè)量其大小后，既不沖洗也不表面消毒，將表面雜物去凈后，分離部位為菌蓋和菌柄。菌蓋用滅菌鑷子將菌蓋表皮剝離，菌柄則徒手沿中軸小心掰開(kāi)，在其不同內(nèi)部挑取豌豆大小組織塊置于固體MMN 培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放入25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d后檢查培養(yǎng)基面是否有污染，有污染則立即剔除并重新培養(yǎng)。根據(jù)菌根真菌菌絲體直接從接種塊上長(zhǎng)出、生長(zhǎng)較慢及同種真菌形成的菌落形態(tài)一致等特點(diǎn)，初步確定所分離是否為菌根真菌純培養(yǎng)物[17]。

1.3.3 菌種的保存經(jīng)3～5次挑選純化培養(yǎng)后的菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接到固體MMN 斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿(mǎn)斜面后在斜面上覆蓋一層滅菌的液體石蠟，完全覆蓋菌種從而隔絕空氣，減少菌種及培養(yǎng)物水分揮發(fā)，密封試管直立置4℃保存。15 d轉(zhuǎn)種1次。

1.4 分析方法

1.4.1 子實(shí)體的鑒定大部分菌根菌子實(shí)體含水率較高，易被破壞和蟲(chóng)蛀，篩菌培養(yǎng)選用健康無(wú)病蟲(chóng)害的子實(shí)體。將采集到的子實(shí)體去其泥土等雜物，編號(hào)、放入9 號(hào)自封袋，然后統(tǒng)一置于裝有冰袋的便攜式冷藏箱中。帶回實(shí)驗(yàn)室后，記錄其數(shù)量和形態(tài)指標(biāo)（包括菌蓋直徑、真菌高度等）。根據(jù)子實(shí)體的解剖學(xué)特性和形態(tài)學(xué)特征，并參考相關(guān)書(shū)籍和文獻(xiàn)資料[18-19]進(jìn)行鑒定。

1.4.2 菌種的鑒定篩選培養(yǎng)的真菌菌落經(jīng)3～4次平板劃線(xiàn)純培，純培一次菌種需要4～7 d。待菌種長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿且無(wú)雜菌污染，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。

1.4.3 菌種檢測(cè)對(duì)比庫(kù)對(duì)比庫(kù)為美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)。

1.4.4 菌種基因組DNA 提取 按SK8255（細(xì)菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）試劑盒操作（表3）。

表3 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒

1.4.5 18s rDNAITS區(qū)段PCR擴(kuò)增利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至0.5 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用ITS1 和ITS4 引物，生工生物工程（上海）股份有限公司的SanTaq Plus Mix PCR 預(yù)混液，含藍(lán)染料，(B532081)進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，其中Sterilized ddH2O 20 μL，2×PCR Master 25 μL，DNA 模板1 μL，上游引物(10 μL mol/L)2 μL，下游引物(10 μL mol/L)2 μL，見(jiàn)表4。其中，rDNA的擴(kuò)增引物選擇真菌ITS1、ITS4 引物序列下：ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS4- TCCTCCGCTT ATTGATATGC。

表4 預(yù)混液（含藍(lán)染料）試劑盒組成

2 結(jié)果與分析

2.1 2種油松林根際真菌資源

調(diào)查共采集4次，12種不同的子實(shí)體，初步鑒定出松山油松林根際真菌有16 個(gè)屬，17 個(gè)種。青霉屬(Penicillium)最多，占總數(shù)的18.60%；其次為鐮孢菌屬(Fusarium)，占總數(shù)的13.95%；接著為小克銀漢霉屬(Cunninghamella)，占總數(shù)的11.63%；然后為傘狀霉屬(Umbelopsis)、毛霉屬(Mucor)，占比均為9.30%；再為木霉屬(Trichoderma)、擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)，占比均為6.98% ；短梗霉屬(Aureobasidium)占比為4.65%；最后為裂褶菌屬(Schizophyllum)、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)、鱗質(zhì)霉屬(Apophysomyces)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、多孔菌屬(Polyporus)、中文名不詳(Lecanicillium)、中文名不詳(Vanrija)和菌寄生屬(Hypomyces)8種菌屬均占總數(shù)的2.33%。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 油松林下的根際真菌及類(lèi)型

2.2 2種油松林根際真菌優(yōu)勢(shì)屬的分析

2022年5—10月，初步從松山自然保護(hù)區(qū)天然油松林和人工油松林中篩選出真菌17種，隸屬于16屬。其中，青霉屬(Penicillium)最多，其次為鐮孢菌屬(Fusarium)，最后為小克銀漢霉屬(Cunninghamella)，分別占總數(shù)的18.60%、13.95%、11.63%，見(jiàn)表5、圖2。

圖2 1%瓊脂糖電泳觀察圖（電泳圖DNA Ladder Mix make）

2.2.1 人工油松林人工油松林中根際真菌有9屬5種，4個(gè)種名尚未能鑒定。其中以傘狀霉屬(Umbelopsis)為最多，占人工油松林篩選出真菌總數(shù)的23.53%；其次為青霉屬(Penicillium)，占比為17.65%；小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、鐮孢菌屬(Fusarium)和短梗霉屬(Aureobasidium)，占比均為11.76% ；鱗質(zhì)霉屬(Apophysomyces)、擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)和中文名不詳(Vanrija)占比最少為5.88%。

2.2.2 天然油松林天然油松林中根際真菌有11 屬11種，3 個(gè)種名尚未能鑒定。其中以青霉屬(Penicillium)為最多，占天然油松林篩選出真菌總數(shù)的19.23%；其次為鐮孢菌屬(Fusarium)和毛霉屬(Mucor)，占比均為15.38%；小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、木霉屬(Trichoderma)和擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)，占比分別為11.54% 、11.54% 和7.69% ；裂褶菌屬(Schizophyllum)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、多孔菌屬(Polyporus)、中文名不詳(Lecanicillium)和菌寄生屬(Hypomyces)占比最少均為3.85%。

青 霉 屬 (Penicillium)、小 克 銀 漢 霉 屬(Cunninghamella)、鐮孢菌屬(Fusarium)和擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)4 屬同時(shí)存在人工油松林和天然油松林中；且天然油松林的根際真菌群落比人工油松林的根際真菌群落豐富。

2.3 影響2種油松林根際真菌分布的因素

由表6和表7可知，天然油松林與人工油松林的土壤養(yǎng)分狀況較相近。僅天然油松林的速效鉀含量低于人工油松林，其他基本養(yǎng)分狀況差異不大。由此可知，2種油松林土壤養(yǎng)分狀況對(duì)根際真菌群落的分布影響較小。

表6 天然油松林土壤的基本養(yǎng)分狀況

表7 人工油松林土壤的基本養(yǎng)分狀況

3 討論

從延慶松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)人工油松林和天然油松林根際土壤中分離出16 個(gè)屬，17 個(gè)種，中文名不詳3 個(gè)，4 個(gè)種名尚未能鑒定，其中天然油松林真菌群落種類(lèi)更豐富。董愛(ài)榮等[20]研究小興安嶺涼水自然保護(hù)區(qū)不同林型的土壤真菌發(fā)現(xiàn)，在林分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、林下植物種類(lèi)多的椴樹(shù)(Tiliatuan)林、紅松(Pinuskoraiensis)林和楓樺(Betulacostata)紅松林中，土壤真菌數(shù)量和種類(lèi)明顯多于其他林分類(lèi)型。趙文靜等[21]對(duì)額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)山楊林、白樺林、黑樺林和落葉松林中土壤真菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明土壤真菌區(qū)系與森林類(lèi)型密切相關(guān)。尚蓓[22]研究表明不同林型、不同土壤性質(zhì)等都會(huì)影響土壤真菌的分布，包括土壤真菌種類(lèi)和數(shù)量。MICHAELA等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，真菌的多樣性指數(shù)與森林類(lèi)型密切相關(guān)。本研究中，天然油松林的真菌群落種類(lèi)比人工油松林的真菌群落種類(lèi)豐富，與其有較好的一致性。研究中測(cè)定天然油松林和人工油松林的基本養(yǎng)分狀況得出，2 種林型的土壤養(yǎng)分狀況差異不大。養(yǎng)分的有效性是由土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，特別是根系主導(dǎo)的根際微生態(tài)系統(tǒng)性狀所決定的[24]。這可能是天然油松林林下灌木層和草本層物種多樣性比人工油松的高[25]。天然林的抗逆性強(qiáng)，森林結(jié)構(gòu)分布穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間的自然演替，生物鏈比較完整，物種的分布較豐富，有較強(qiáng)的自我恢復(fù)能力，物種的多樣性程度極高[26-27]。而人工林構(gòu)成樹(shù)木種類(lèi)單一，年齡和高矮接近，冠層分布密集單一，樹(shù)冠完全遮擋了陽(yáng)光，林下缺乏中間地灌木層和地表植被，因而影響微生物群落多樣性[28-29]。

接合菌門(mén)(Zygomycota) 和子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)是本研究結(jié)果的優(yōu)勢(shì)真菌群落。接合菌門(mén)真菌大多為腐生物，有些接合菌門(mén)真菌與高等植物共生形成菌根[30]。其中青霉屬在2 種林型種均有分布，且天然油松林中數(shù)量豐富于人工油松林。油松林土壤中可能以木質(zhì)素（油松葉凋落物含木質(zhì)素較多）為主，木質(zhì)素較纖維素、半纖維難分解，而真菌對(duì)纖維素分解作用較強(qiáng)，如青霉屬[31]。Ren等[32]通過(guò)ITS序列高通量測(cè)序技術(shù)也揭示油松林在門(mén)水平的優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群為子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和接合菌門(mén)(Zygomycota)。高微微等[33]研究城市森林不同林型下土壤基本理化特性及土壤真菌多樣性，研究表明真菌門(mén)和真菌綱水平的變化最明顯，主要涵蓋了子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺菌門(mén)和接合菌門(mén)等。

根際微生物種類(lèi)越多，數(shù)量越大，土壤微生物的活性則越強(qiáng)，越能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[34-35]而真菌作為土壤微生物的重要組成部分，緊密的將地上部分與地下部分聯(lián)系起來(lái)[21]。所以，研究不同林分下根際真菌多樣性具有重要意義，將為油松林的保護(hù)和人工恢復(fù)提供依據(jù)，為“適樹(shù)適種”菌劑的研究提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)醫(yī)藥工業(yè)和保障人類(lèi)健康具有一定的推動(dòng)作用。如：粉紅粘帚霉是重要的生防真菌，不僅拮抗能力強(qiáng)，而且能抑制病原菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，對(duì)農(nóng)業(yè)上植物抗病的發(fā)展起了重要的推動(dòng)作用[36]；根霉屬、毛霉屬和小克銀漢霉屬是毛霉科下最常見(jiàn)的致病菌屬，毛霉一般好侵犯下呼吸道[37]。但毛霉屬真菌有較強(qiáng)的分解枝葉能力[38]，促進(jìn)落葉等的分解。另外在2 種林型中檢測(cè)出未被鑒定的真菌種類(lèi)，這些種類(lèi)還需要進(jìn)一步的分析鑒定。

4 結(jié)論

本研究主要獲得以下結(jié)論：（1）青霉屬是松山自然保護(hù)林天然油松林的優(yōu)勢(shì)真菌，傘狀霉屬是人工油松林的優(yōu)勢(shì)真菌。（2）天然油松林根際真菌群落比人工油松林根際真菌群落豐富。（3）青霉屬、鐮孢菌屬、小克銀漢霉屬、傘狀霉屬和毛霉屬等是油松林根際土壤占優(yōu)勢(shì)的真菌。（4）青霉屬、小克銀漢霉屬、鐮孢菌屬和擬盾殼霉屬4屬在天然油松林和人工油松林中均有分布。