十精丸對光老化大鼠皮膚LCs及炎癥因子水平影響的研究

孫在崢 曹惠妍 馬偉 陳麗娟

[摘要]目的：探討十精丸對于光老化大鼠皮膚朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cell，LCs）及體內(nèi)炎癥因子水平的影響。方法：SD大鼠，雌性50只，隨機(jī)分為模型組、陽性對照組、十精丸低劑量組、十精丸中劑量組、十精丸高劑量組，每組10只。建立皮膚光老化模型，同時給予十精丸干預(yù)治療。實驗結(jié)束后，通過免疫組化法對大鼠皮膚LCs數(shù)量及形態(tài)進(jìn)行觀察，病理切片觀察皮膚炎性浸潤程度，ELISA方法檢測皮膚組織和血清中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，十精丸各劑量組表皮LCs細(xì)胞數(shù)目均有所增加，胞體形態(tài)改善，樹突結(jié)構(gòu)形成增多，細(xì)胞間連接緊密。其中十精丸高劑量組改善效果較為顯著。病理切片結(jié)果顯示，十精丸各劑量組大鼠皮膚炎性細(xì)胞浸潤程度有所改善，十精丸高劑量組改善程度較為明顯。ELISA檢測結(jié)果顯示，十精丸各劑量組皮膚組織勻漿及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α含量均有所下降。其中十精丸中、高劑量組下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：十精丸能增加光老化大鼠皮膚組織中LCs細(xì)胞數(shù)量，改善LCs細(xì)胞異常形態(tài)，減輕大鼠皮膚組織的炎性細(xì)胞浸潤程度，降低大鼠皮膚組織及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的含量，表明十精丸能提高皮膚免疫功能，抑制炎癥因子，從而修復(fù)皮膚功能，改善皮膚衰老狀態(tài)。

[關(guān)鍵詞]十精丸；皮膚免疫；光老化；朗格漢斯細(xì)胞；炎癥因子

[中圖分類號]R285.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）02-0051-05

Study on the Effect of Shijingwan on LCs and Inflammatory Factors

in Photoaging Rats

SUN Zaizheng1，CAO Huiyan2，MA Wei2，CHEN Lijuan3

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150006，Heilongjiang，China; 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China; 3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154000，Heilongjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the effects of Shijingwan on the levels of skin Langerhans cells （LCs） and inflammatory cytokines in photoaged rats. Methods? 50 female SD rats were randomly divided into model group， positive control group， Shijingwan low-dose group， Shijingwan medium-dose group and Shijingwan high-dose group， with 10 rats in each group. The skin photoaging model was established， and Shijingwan were given for intervention. After the experiment， the amount and morphology of LCs in the skin of rats were observed by immunohistochemistry， the degree of inflammatory infiltration was observed by pathological sections， and the contents of Interleukin-6 （IL-6） and Tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the skin tissue and serum were detected by ELISA. Results? Immunohistochemical results showed that， compared with model group， the number of epidermal LCs cells in each dose group of Shijingwan increased， the morphology of cell bodies improved， the formation of dendritic structure increased， and the connections between cells were tight. The improvement effect of Shijingwan high dose group was more significant. Pathological section results showed that the degree of skin inflammatory cell infiltration was improved in each dose group of Shijingwan， and the degree of improvement was more obvious in the high dose group of Shijingwan. ELISA results showed that the contents of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in skin homogenate and serum of Shijingwan were decreased in each dose group. There was significant decrease in the medium and high dose groups of Shijingwan， with statistical significance （P＜0.01）， but no significant difference compared with positive control group （P＞0.05）. Conclusion? Shijingwan can increase the number of LCs cells in the skin tissue of photoaging rats， improve the abnormal morphology of LCs cells， reduce the degree of inflammatory cell infiltration in the skin tissue of rats， and reduce the contents of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in the skin tissue and serum of rats， indicating that Shijingwan can improve the skin immune function， inhibit inflammatory factors， and repair the skin function. Improve skin aging.

Key words： Shijingwan; skin immunity; photoaging; langerhans cells; inflammatory cytokines

皮膚是人體防御疾病的第一道屏障，也是人體美的重要載體。皮膚的老化不但影響外貌的美觀，而且會增加皮膚疾病產(chǎn)生的概率。皮膚老化一般可分為內(nèi)源性老化和外源性老化兩種。皮膚光老化是外源性老化中最常見的類型，主要由紫外線過多照射引起，表現(xiàn)為皮膚干燥、松弛、皺紋、色素增加或脫失以及毛細(xì)血管擴(kuò)張等，嚴(yán)重者導(dǎo)致皮膚表面隆起、開放性粉刺、光化性紫癜及表皮真皮增厚等表現(xiàn)[1]。因此尋找有效防治皮膚光老化的方法與手段，也是該領(lǐng)域研究的重點與難點。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，中藥用于抗光老化的研究取得了一定進(jìn)展。近年來，有關(guān)中醫(yī)藥通過清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)膠原等方面防治皮膚光老化的研究越來越多，但其深入機(jī)制和復(fù)方成分的研究仍然尚少?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)理論相結(jié)合，發(fā)揮中藥的獨特作用是未來研究的重要方向[2]。

十精丸出自明代《普濟(jì)方》，為駐顏防衰、延年益壽的經(jīng)典方，由枸杞、熟地、山茱萸、肉蓯蓉、菟絲子等十味藥物組成。從組方上看，有陰陽并補、補而不膩的特點，從功用上看，有滋腎填精，補氣養(yǎng)元，駐顏防衰之功。前期實驗結(jié)果表明十精丸具有提高超氧化歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平，增加皮膚羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量以改善皮膚光老化的效果。本實驗基于光老化的免疫抑制與炎癥反應(yīng)機(jī)制，探討十精丸對大鼠光老化皮膚細(xì)胞免疫功能及炎癥因子水平的影響，進(jìn)一步豐富十精丸延衰駐顏理論的論證體系，對皮膚美容醫(yī)學(xué)理論研究以及促進(jìn)《普濟(jì)方》中補虛延衰類中藥復(fù)方的研發(fā)都具有積極的意義。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：雌性SD大鼠50只，月齡14～16個月，體重（450±100）g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，許可證號：SCXK（黑）2019-001。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃～26℃，濕度20%～30%，保持飼料及飲水潔凈充沛。所有實驗程序和實驗動物使用均符合黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理規(guī)定。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥物：十精丸各劑量組包括枸杞、熟地、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉等十味中藥飲片，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院附屬醫(yī)院中藥局。陽性對照組包括維生素E軟膠囊（大連水產(chǎn)藥業(yè)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H21021557）。

1.2.2 試劑：大鼠白介素6（IL-6）、大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號20230323）、大鼠CD1a多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號20230320），蘇木素伊紅染色液、乙醚、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、二甲苯、4%中性甲醛、生理鹽水、PBS緩釋液、酸性乙醇分化液、檸檬酸鹽溶液、去離子H2O2溶液、DAB顯色劑、脫毛膏均為市售試劑。

1.3 主要實驗儀器：SS-03AB型紫外線光療儀（上海Sigma公司）；紫外線輻照計（北京師范大學(xué)光電儀器廠）；TGL-16G-C高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；酶標(biāo)儀Thermo Fisher Scientific Oy（美國賽默飛）；DY89-I電動玻璃勻漿機(jī)（上海民儀電子有限公司）；Resecarch UVUF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模

1.4.1.1 分組：實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組、陽性對照組、十精丸低劑量組、十精丸中劑量組、十精丸高劑量組。

1.4.1.2 造模：以老齡大鼠結(jié)合紫外線照射誘導(dǎo)皮膚光老化模型，造模方式參考文獻(xiàn)[3]。各組大鼠背部進(jìn)行脫毛處理，剃毛區(qū)域面積大約為5 cm×5 cm。以自制固定器固定于光療儀（UVA+UVB）下約40 cm處。每次照射劑量UVA約為29 J/cm2，UVB約為64 mJ/cm2，每次照射時間2 h，時間持續(xù)4周。造模過程中若出現(xiàn)皮膚水皰、潰爛情況，立即停止照射，待2～3 d皮損癥狀緩解后，再繼續(xù)進(jìn)行照射。照射后，大鼠出現(xiàn)皮膚進(jìn)行性彈性喪失、皺紋增粗加深，伴有脫屑等光老化表現(xiàn)，病理檢查示表皮結(jié)構(gòu)不完整，真皮組織排列紊亂、分布不均勻為造模成功。

1.4.2 藥物制備及用藥：按十精丸原方藥物組成及藥量（十味各等分，共200 g），精選道地藥材，去除雜質(zhì)，制備水煎液。經(jīng)過濃縮后，分別得到所含生藥濃度為1.0 g/ml的十精丸低劑量組藥液，生藥濃度為2.0 g/ml的中劑量組藥液，生藥濃度為4.0 g/ml的高劑量組藥液。置于4℃冰箱保存，使用前水浴加熱至30℃。每日光照結(jié)束后，根據(jù)人與大鼠用藥劑量換算，十精丸各劑量組灌胃給藥，時間為4周。同時陽性對照組及模型組分別給予同等容積的維生素E溶液及0.9%生理鹽水灌胃。

1.4.3 標(biāo)本采集與制備

1.4.3.1 血清樣本制備：最后一次灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚吸入麻醉后，腹主動脈采血4～5 ml，靜置1 h，于4℃離心機(jī)內(nèi)，3 500 r/min，離心15 min，取上清液，于-80℃保存待檢。

1.4.3.2 皮膚組織勻漿制備：于大鼠背部區(qū)域剪取1 cm×1 cm面積皮膚組織，預(yù)冷生理鹽水中漂洗3次，以濾紙拭干水分后，用眼科剪剪碎組織，置于勻漿管中，以樣本質(zhì)量︰稀釋液體積為1∶9的比例加入預(yù)冷PBS緩釋液。放入勻漿機(jī)中經(jīng)充分勻漿后，將勻漿液以2 000 r/min的速率，低溫離心15 min，取上清液待檢。

1.4.3.3 皮膚病理切片制備：背部脫毛區(qū)域剪取約1 cm×1 cm大小的皮膚組織，去除脂肪與結(jié)締組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗3次，以4%中性甲醛溶液固定保存。經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片（5μm）。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 LCs數(shù)量及形態(tài)觀察：將大鼠皮膚組織切片經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片、二甲苯和乙醇脫蠟至水，蒸餾水、PBS各漂洗3次（3 min/次），滴加去離子H2O2，室溫孵育20 min，PBS漂洗后進(jìn)行微波修復(fù)，PBS漂洗，滴加大鼠CD1a多克隆抗體，室溫孵育2 h，PBS漂洗，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS漂洗，滴加DAB顯色劑顯色，蒸餾水徹底沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，乙醇和二甲苯脫水并透明，中性樹膠封片后，光鏡下觀察并采集分析圖片，觀察LCs數(shù)量及形態(tài)變化。

1.5.2 皮膚組織炎性浸潤程度觀察：將大鼠皮膚組織切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察炎細(xì)胞增殖及浸潤程度。

1.5.3 IL-6、TNF-α含量檢測：根據(jù)ELISA試劑盒說明書，按照指示在酶標(biāo)儀上進(jìn)行操作，分別對大鼠皮膚組織勻漿及血清IL-6、TNF-α含量進(jìn)行檢測。

1.6 細(xì)胞計數(shù)：光鏡下對CD1a陽性LCs進(jìn)行計數(shù)，陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①細(xì)胞位于表皮層。②細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿有棕黃色顆粒著色。在高倍顯微鏡10×20下隨機(jī)選取5～10個不連續(xù)的視野，人工計數(shù)每個視野內(nèi)陽性細(xì)胞的數(shù)量，每個標(biāo)本陽性細(xì)胞數(shù)=（視野1陽性細(xì)胞數(shù)+視野2陽性細(xì)胞數(shù)+……+視野N陽性細(xì)胞數(shù)）/N，其中N為所選取的視野數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以（xˉ±s）的形式表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 LCs數(shù)量及形態(tài)觀察：結(jié)果顯示，模型組LCs在表皮及真皮中呈散在性分布，表皮LCs數(shù)量少，胞體形態(tài)不規(guī)則，可見部分胞體萎縮，缺乏樹突結(jié)構(gòu)形成，與角質(zhì)細(xì)胞之間的連接松散。與模型組相比，十精丸各劑量組表皮LCs數(shù)量均有所增加，胞體異常形態(tài)有改善。其中，十精丸高劑量組表皮LCs數(shù)量顯著增加，胞體形態(tài)較為規(guī)則，樹突結(jié)構(gòu)形成增加，細(xì)胞之間連接較為緊密。十精丸高劑量組LCs數(shù)量高于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2 大鼠皮膚組織病理學(xué)觀察：結(jié)果顯示，模型組皮膚組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤，皮膚組織表皮厚薄不均，腺體增生較明顯。十精丸各劑量組表皮厚薄較為均勻，腺體增生及炎性細(xì)胞浸潤程度較模型組相比有所減輕；其中十精丸高劑量組與模型組相比，浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，炎性浸潤程度有顯著改善，腺體增生不明顯，差異明顯。與陽性對照組無明顯差異。見圖2。

2.3 IL-6、TNF-α含量的影響

2.3.1 大鼠皮膚組織勻漿中IL-6、TNF-α含量的影響：結(jié)果顯示，與模型組相比，十精丸各劑量組皮膚組織勻漿中炎性因子IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高劑量組下降明顯；有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。十精丸中、高劑量組與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3.2 大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影響：結(jié)果顯示，與模型組相比，十精丸各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高劑量組下降程度明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。十精丸中、高劑量組與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3? 討論

免疫抑制與炎癥反應(yīng)是紫外線致使皮膚光老化產(chǎn)生的機(jī)制之一。根據(jù)文獻(xiàn)報道，紫外線通過抑制朗格漢斯細(xì)胞（LCs）、樹突狀細(xì)胞的免疫功能，改變體液免疫細(xì)胞因子的水平，從而對皮膚免疫系統(tǒng)造成抑制，引起皮膚組織中金屬基質(zhì)蛋白酶（Metallomatrix proteinase，MMP）的表達(dá)增加，抑制膠原的合成，進(jìn)而造成光老化的特征性改變[4]。LCs是皮膚免疫系統(tǒng)的重要組成部分，位于與外界環(huán)境接觸的表皮層。LCs可以通過變形蟲樣運動在角質(zhì)形成細(xì)胞中穿行，具有遷徙至淋巴結(jié)并啟動免疫反應(yīng)的能力。文獻(xiàn)表明，LCs會隨著皮膚老化出現(xiàn)數(shù)量水平的減少，并且其向淋巴結(jié)遷徙的能力也會下降[5]。另外，研究認(rèn)為不同波長的紫外線均可對LCs的數(shù)量及形態(tài)狀況造成影響，中波紫外線（UVB）對LCs的影響表現(xiàn)在表皮LCs數(shù)量減少或消失、LCs抗原呈遞功能以及活化T細(xì)胞作用受到影響等方面。長波紫外線（UVA）可以導(dǎo)致表皮LCs數(shù)量減少，降低其抗原抗原呈遞功能，引起胞膜免疫共刺激分子表達(dá)水平降低等[6]。在形態(tài)上，光老化皮膚中的LCs常呈現(xiàn)出胞體較小、樹突結(jié)構(gòu)短且分支少的表現(xiàn)[7]。綜上，表皮中LCs的細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)狀況可以看做是表征皮膚免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[8]。

炎癥因子在皮膚光老化的炎癥機(jī)制中起著重要作用。在受到紫外線刺激時，角質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子水平上升，從而引起炎性細(xì)胞浸潤、促進(jìn)皮膚炎癥反應(yīng)產(chǎn)生。IL-6能誘導(dǎo)MMP合成增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。TNF-α是炎癥反應(yīng)中最重要的炎癥因子，具有激活免疫細(xì)胞，并促進(jìn)其他炎癥因子釋放的作用[9]。受到紫外線照射以及機(jī)體的免疫功能水平下降時，皮膚中IL-1、IL-6、IL-7、TNF-α等促炎因子的水平出現(xiàn)升高現(xiàn)象[10]。炎癥因子水平的增加對皮膚免疫系統(tǒng)也有一定的影響[11]。研究認(rèn)為，TNF-α、IL-1β等炎癥因子的過度釋放，一定程度上促進(jìn)了表皮LCs的遷移，減少了表皮LCs數(shù)量，是影響皮膚免疫功能的重要因素[12]。由此，皮膚免疫抑制與炎癥反應(yīng)之間存在著機(jī)制上的聯(lián)系。因此，改善皮膚免疫細(xì)胞功能、抑制炎癥因子的分泌可以看作是防治皮膚光老化的重要手段。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為一身之本，腎中精氣的盛衰主宰人體的生命活動過程?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈吩唬骸芭悠邭q，腎氣盛，齒更發(fā)長……五七，陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮”，提示腎中精氣是機(jī)體生長發(fā)育的基礎(chǔ)。隨著年齡增長，腎中精氣逐漸衰少，皮膚就會表現(xiàn)出面容憔悴、皺紋叢生的老化現(xiàn)象[13]。衛(wèi)氣是人體中行于脈外，具有防御保護(hù)作用的氣?！秲?nèi)經(jīng)·靈樞·本臟》中指出：“衛(wèi)氣者，所以溫分肉，充肌膚，肥腠理，司開闔者也”。衛(wèi)氣能充養(yǎng)肌膚、防御外邪，與西醫(yī)學(xué)中免疫系統(tǒng)的作用相一致。衛(wèi)氣的生成受到腎氣的調(diào)控，《靈樞·邪客》有“地有泉脈，人有衛(wèi)氣”，取類比象，用泉脈以喻水出地下，衛(wèi)出下焦腎，也是對衛(wèi)氣的生成和腎關(guān)系密切的理論佐證。因此，腎的活動與機(jī)體的免疫功能的盛衰聯(lián)系密切。所以，通過補腎來調(diào)節(jié)皮膚免疫功能、延緩皮膚衰老具有一定的理論依據(jù)。

十精丸方中以補腎藥居多，其中熟地黃、枸杞子補肝益腎、滋陰養(yǎng)血，山茱萸、肉蓯蓉和菟絲子補益肝腎、溫中壯陽、收澀固脫，有陰陽并補兼以收澀之功。全方合用，可共奏補腎養(yǎng)心、駐顏防衰之效[14]?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，地黃的藥理作用全面，有止血、抗感染、抗高血壓、免疫增強(qiáng)、抗炎的作用[15]。枸杞多糖能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫功能[16]。山茱萸多糖有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化和清除自由基的作用[17]。菟絲子能調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化及衰老[18]。肉蓯蓉多糖有調(diào)節(jié)免疫活性、抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶障礙的功能[19]。前期實驗結(jié)果表明，十精丸可以增強(qiáng)老齡大鼠SOD活力、降低機(jī)體MDA含量，提高機(jī)體抗氧化能力、加速自由基清除，對皮膚光老化有一定改善作用[20]。十精丸的含藥血清可以降低MMP-1并提高基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的表達(dá)，拮抗紫外線對成纖維細(xì)胞的損傷[21]。

綜述所述，十精丸可以提高光老化皮膚中的LCs數(shù)量水平，并改善LCs細(xì)胞異常形態(tài)。并且十精丸對于皮膚組織及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的含量水平也具有一定的降低作用。表明十精丸能夠調(diào)節(jié)皮膚免疫功能，減少炎癥因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)，改善皮膚衰老狀態(tài)。此結(jié)論為進(jìn)一步論證十精丸補腎益氣、延衰駐顏的功效提供了實驗依據(jù)。

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[收稿日期]2023-05-23

本文引用格式：孫在崢，曹惠妍，馬偉，等.十精丸對光老化大鼠皮膚LCs及炎癥因子水平影響的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（2）：51-55.