LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

魏曉環(huán) 單前前 朱軍

[摘要]?目的?研究脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。方法?將Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。Renca細(xì)胞皮下建模，待腫瘤體積生長(zhǎng)至50mm3時(shí)瘤旁注射生理鹽水（100μl/只，????1次/2d）或LPS（100μg/只，1次/2d），采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M1型極化水平。將小鼠腫瘤細(xì)胞系（ML-1、MC38、Renca）分成三組：空白組（完全培養(yǎng)基加入50%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、對(duì)照組（完全培養(yǎng)基加入50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清液）和實(shí)驗(yàn)組（完全培養(yǎng)基加入50%LPS預(yù)處理的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清液）。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（cell?counting?kit-8，CCK-8）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期及凋亡情況。?????結(jié)果?經(jīng)LPS處理后腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M1型比例增多（P<0.001），從而增強(qiáng)其抗腫瘤功能；LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖（Renca：P=0.023；ML-1：P=0.045）；LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化可引起腫瘤細(xì)胞周期G0/G1（MC38：P=0.011；ML-1：P=0.022）或S期（Renca：P=0.022）阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂；LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化可引起腫瘤細(xì)胞凋亡（Renca：P=0.04；ML-1：P=0.007）。結(jié)論?LPS可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化發(fā)揮抗腫瘤功能。

[關(guān)鍵詞]?巨噬細(xì)胞；M1型極化；脂多糖；抗腫瘤

[中圖分類號(hào)]?R735????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.012

Effect?of?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?on?tumor?growth

WEI?Xiaohuan1，?SHAN?Qianqian2，?ZHU?Jun3

1.Department?of?Science?and?Education，?Xuzhou?Central?Hospital，?Xuzhou?221004，?Jiangsu，?China;?2.Department?of?Pain，?General?Hospital?of?Xuzhou?Mining?Group，?Xuzhou?221006，?Jiangsu，?China;?3.Department?of?Emergency，?Xuzhou?Central?Hospital，?Xuzhou?221004，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?study?the?effect?of?lipopolysaccharide?（LPS）-induced?M1?polarization?of?macrophages?on?tumor?growth.?Methods?Female?Balb/c?mice?were?randomly?divided?into?control?group?and?experimental?group.?Renca?cells?were?used?to?establish?subcutaneous?tumor?model.?NaCl?（100μl/mice，?once?every?two?days）?or?LPS?（100μg/mice，?once?every?two?days）?was?injected?to?the?tumor?side?when?the?tumor?grew?to?50mm3.?The?M1?polarization?level?of?tumor-associated?macrophages?was?detected?by?flow?cytometry.?Mouse?tumor?cell?lines?（ML-1，?MC38，?Renca）?were?divided?into?three?groups：?blank?group?（complete?medium?with?50%?DMEM?basal?medium），?control?group?（complete?medium?with?50%?medium?supernatant?of?cultured?macrophages）?and?experimental?group?（complete?medium?with?50%?medium?supernatant?of?LPS?pretreated?cultured?macrophages）.?The?proliferation?of?tumor?cells?was?detected?by?cell?counting?kit-8?（CCK-8）.?The?cell?cycle?and?apoptosis?of?tumor?cells?were?detected?by?flow?cytometry.?Results?The?proportion?of?tumor-associated?macrophages?M1?increased?after?LPS?treatment?（P<0.001），?thus?enhancing?its?anti-tumor?function.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?can?significantly?inhibit?the?proliferation?of?tumor?cells?（Renca：?P=0.023，?ML-1：?P=0.045）.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?blocked?G0/G1?phase?（MC38：?P=0.011，?ML-1：?P=0.022）?or?S?phase?（Renca：?P=0.022）?of?tumor?cell?cycle，?and?then?cell?division?was?inhibited.?LPS-induced?M1?polarization?of?macrophages?significantly?induced?apoptosis?of?tumor?cells?（Renca：?P=0.04，?ML-1：?P=0.007）.?Conclusion?LPS?can?play?an?anti-tumor?role?by?inducing?M1?polarization?of?macrophages.

[Key?words]?Macrophage;?M1?polarization;?Lipopolysaccharide;?Anti-tumor

巨噬細(xì)胞（macrophages，M）是一種位于組織內(nèi)的白細(xì)胞，由血液中的單核細(xì)胞穿出血管進(jìn)入組織后分化形成，具有體積增大、溶酶體增多及吞噬功能增強(qiáng)的特點(diǎn)[1]。M在免疫系統(tǒng)中可被分為經(jīng)典活化的M1型和選擇性活化的M2型，分別執(zhí)行促炎和抗炎功能，M的極性對(duì)惡性腫瘤的進(jìn)展非常重要[2]。M2是引起腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療抗性的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，而M1具有抑制和殺傷腫瘤的作用[3-4]。因此誘導(dǎo)M向M1型極化在抗腫瘤過(guò)程中具有重要意義。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外膜的主要成分，由脂類A、核心多糖和O-特異性多糖三部分組成[5]。研究表明LPS可直接誘導(dǎo)M向M1型極化；此外，LPS持續(xù)刺激可下調(diào)M半乳糖凝集素-9（galectin-9，GAL-9）的表達(dá)和分泌，減弱T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3（T?cell?immunoglobulin?and?mucin?domain，TIM-3）與GAL-9之間的作用，間接誘導(dǎo)M向M1型極化[6-9]。本研究旨在探討LPS誘導(dǎo)M向M1型極化后對(duì)腫瘤抑制作用的影響。

1??材料與方法

1.1??材料與試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。生理鹽水購(gòu)自Sigma?Aldrich公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（cell?counting?kit-8，CCK-8）購(gòu)自徐州微科曼生物工程有限公司。PI周期試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。流式抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、小鼠肝癌細(xì)胞ML-1、小鼠腎癌細(xì)胞Renca、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。6～8周齡的Balb/c雌性小鼠（SPF級(jí)別）購(gòu)于北京維通利華生物科技有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究經(jīng)徐州礦務(wù)集團(tuán)總醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：[2022]072804）。

1.2??細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠RAW264.7、MC38、Renca、ML-1細(xì)胞均使用DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3??CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集腫瘤細(xì)胞離心后計(jì)數(shù)，按細(xì)胞密度為3×?103個(gè)/孔接種至96孔板中，并設(shè)空白組（使用完全培養(yǎng)基加入50%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、對(duì)照組（完全培養(yǎng)基加入50%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)M?24h后收集的培養(yǎng)基上清液）、實(shí)驗(yàn)組（完全培養(yǎng)基加入50%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h經(jīng)LPS預(yù)處理后的M培養(yǎng)基上清液），總體積為100μl/孔。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞3d后每孔加入10μl體系的CCK-8試劑，輕拍使其分散均勻，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，2h后酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處吸光度值（A值）。

1.4??流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

接種1×106個(gè)/孔腫瘤細(xì)胞于6孔板中，分組同上述CCK-8實(shí)驗(yàn)。48h后收集細(xì)胞，離心棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate?buffered?saline，PBS）清洗兩遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。取1ml單細(xì)胞懸液，離心棄上清液，在細(xì)胞中加入70%的冷乙醇1ml，4℃固定過(guò)夜。用PBS洗去固定液，加入提前配制好的400μl體系PI/RNaseA染色工作液，室溫避光30～60min內(nèi)流式檢測(cè)。

1.5??流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

接種3×105個(gè)/孔腫瘤細(xì)胞于6孔板中，分組同上述CCK-8實(shí)驗(yàn)。48h后收集細(xì)胞，離心棄上清液，PBS清洗兩遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml。取1ml單細(xì)胞懸液，2000轉(zhuǎn)/min離心3min，棄上清液；加入500μl體系Binding?Buffer重懸細(xì)胞，并加入5μl體系A(chǔ)nnexin?V-FITC和5μl體系PI染色液充分混勻后，室溫避光孵育15min后流式檢測(cè)。

1.6??動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，使用小鼠腎癌Renca細(xì)胞系建立皮下移植瘤模型，待腫瘤體積生長(zhǎng)至50mm3時(shí)瘤旁注射生理鹽水（100μl/只，???1次/2d）或LPS（100μg/只，1次/2d）。3周后處死小鼠，剝離腫瘤，測(cè)量腫瘤重量和體積，將腫瘤組織研磨制備成單細(xì)胞懸液，使用PE?anti-mouse-iNOS等抗體染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1型極化情況。

1.7??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way?ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad?Prism?5軟件繪制。

2??結(jié)果

2.1??檢測(cè)LPS對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積明顯縮小、體質(zhì)量減輕（瘤旁注射LPS使腫瘤體積由對(duì)照組的1.691cm3下降至0.076cm3，P<0.001；腫瘤質(zhì)量由對(duì)照組的0.671g降低至0.103g，P<0.001）。這說(shuō)明瘤旁注射LPS可抑制腫瘤生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

2.2??檢測(cè)LPS對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化的影響

為探究LPS抑制腫瘤生長(zhǎng)的原因，本研究對(duì)腫瘤相關(guān)M1型極化進(jìn)行檢測(cè)。剝離小鼠腫瘤組織并經(jīng)研磨制備成單細(xì)胞懸液，流式分析在F4/80（+）、CD11b（+）M中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible?nitric?oxide?synthase，iNOS）的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤相關(guān)M中iNOS表達(dá)比例增多（16.2%∶52.55%，P<0.001）。這說(shuō)明LPS可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)M1型極化而增強(qiáng)其抗腫瘤功能，見(jiàn)圖2。

2.3??檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

為檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，本研究收集M培養(yǎng)基上清液與Renca、ML-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究M經(jīng)LPS預(yù)處理后培養(yǎng)基上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)（Renca細(xì)胞空白組A值為2.390；對(duì)照組A值為2.300；實(shí)驗(yàn)組A值為1.235；P=0.023。ML-1細(xì)胞空白組A值為1.865；對(duì)照組A值為1.865；實(shí)驗(yàn)組A值為1.280；P=0.045）。結(jié)果證明，LPS誘導(dǎo)M1型極化后可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖3。

2.4??檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響

為檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化抑制腫瘤細(xì)胞增殖的原因，本研究利用流式檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液顯著誘導(dǎo)小鼠腫瘤細(xì)胞發(fā)生S或G0/G1期阻A.三組Renca腫瘤細(xì)胞增殖指標(biāo)比較：CCK-8檢測(cè)Renca細(xì)胞增殖（空白組：含50%DMEM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；對(duì)照組：培養(yǎng)基中添加50%未經(jīng)處理M的培養(yǎng)基上清液；實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)基中添加50%經(jīng)LPS預(yù)處理M的培養(yǎng)基上清液）；B.三組ML-1腫瘤細(xì)胞增殖指標(biāo)比較：CCK-8檢測(cè)ML-1細(xì)胞增殖（空白組：含50%DMEM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；對(duì)照組：培養(yǎng)基中添加50%未經(jīng)處理M的培養(yǎng)基上清液；實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)基中添加50%經(jīng)LPS預(yù)處理M的培養(yǎng)基上清液）滯，其中Renca細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液處理，S期比例與空白組（13.36%）或?qū)φ战M（12.32%）相比增加至25.6%（P=0.022）；MC38細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)組的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清液處理，G0/G1期比例與空白組（49.96%）或?qū)φ战M（49.68%）相比增加至66.35%（P=0.011）；ML-1細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液處理，G0/G1期比例與空白組（54.69%）或?qū)φ战M（55.33%）相比增加至64.8%（P=0.022）。表明LPS誘導(dǎo)M1型極化后可通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展而抑制細(xì)胞分裂，見(jiàn)圖4。

2.5??檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

為檢測(cè)LPS誘導(dǎo)M1型極化對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，本研究利用流式檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中Renca細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液處理，凋亡細(xì)胞比例與空白組（6.57%）和對(duì)照組（6.80%）相比增加至13.87%（P=0.040）；ML-1細(xì)胞接受實(shí)驗(yàn)組的M培養(yǎng)基上清液處理，凋亡細(xì)胞比例與空白組（2.80%）和對(duì)照組（4.12%）相比增加至17.42%（P=0.007）。結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)M1型極化后可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖5。

3&nbsp;?討論

LPS結(jié)構(gòu)復(fù)雜性暗示該分子在細(xì)菌細(xì)胞中執(zhí)行多種功能，作為細(xì)菌內(nèi)毒素，其脂質(zhì)A成分是免疫細(xì)胞識(shí)別的病原相關(guān)分子，可有效激活機(jī)體的先天免疫反應(yīng)[10]。因此，LPS是一種重要的免疫激活劑，當(dāng)LPS進(jìn)入機(jī)體后首先激活M，誘導(dǎo)M1型極化，引起炎癥反應(yīng)；而M1型具有直接抗腫瘤功能[11-13]。盡管對(duì)于LPS功能的研究已有很多，但LPS對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞功能的影響仍有較多的爭(zhēng)論。

鑒于適應(yīng)性免疫應(yīng)答是機(jī)體殺傷腫瘤的直接途徑，研究調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答的手段已成為當(dāng)前腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)[14]；但適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活依賴于先天性免疫應(yīng)答[15]。在腫瘤發(fā)生的初始階段，腫瘤細(xì)胞首先逃避機(jī)體先天性免疫應(yīng)答，因此先天性免疫應(yīng)答對(duì)腫瘤進(jìn)展具有重要作用。M作為先天性免疫細(xì)胞中最重要的細(xì)胞群之一，其功能具有重要的可塑性，而這種可塑性基于M的兩種亞型，即經(jīng)典活化的M1型和選擇性活化的M2型。眾多研究者也利用該特性對(duì)M進(jìn)行極化調(diào)控，因此在已發(fā)表的文章中并不缺乏利用各種途徑調(diào)控M免疫功能的研究，如通過(guò)使用一些益生菌菌株（如大腸桿菌、糞腸球菌共生菌群-1）或微生物感染和相關(guān)的副產(chǎn)物（如LPS和干擾素-γ）可激活M至M1表型以清除病原體，而另一些益生菌（如金黃色葡萄球菌、土拉弗朗西斯菌）可誘導(dǎo)M2發(fā)揮抗炎作用[16-21]。由于M是機(jī)體抵抗腫瘤的第一道防線，聯(lián)合其功能的可塑性，該領(lǐng)域研究有望給腫瘤的臨床治療帶來(lái)更多的希望。本研究發(fā)現(xiàn)，瘤旁注射誘導(dǎo)M1型極化的經(jīng)典刺激物L(fēng)PS可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，流式分析發(fā)現(xiàn)LPS刺激誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)M1型極化，說(shuō)明LPS可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)M1型極化發(fā)揮抗腫瘤效果。

研究表明，LPS可通過(guò)誘導(dǎo)M分泌多種細(xì)胞因子，如惡病質(zhì)素或腫瘤壞死因子從而達(dá)到殺傷腫瘤的作用[22-23]。因此本研究探究M經(jīng)LPS預(yù)處理后的培養(yǎng)基上清液對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，結(jié)果顯示LPS預(yù)處理的M培養(yǎng)基上清液可直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞周期阻滯，并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。該結(jié)果證實(shí)LPS可誘導(dǎo)M分泌抑制腫瘤增殖和存活的細(xì)胞因子。

綜上所述，本研究證明在抗腫瘤的復(fù)雜過(guò)程中，LPS誘導(dǎo)M1型極化后，使腫瘤細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1或S期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到有效的抗腫瘤功能。該研究為L(zhǎng)PS通過(guò)干預(yù)M1型極化發(fā)揮抗腫瘤功能提供部分細(xì)胞和動(dòng)物水平的直接證據(jù)；LPS對(duì)于M調(diào)控其他免疫細(xì)胞抗腫瘤功能的影響及其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–02–16）

（修回日期：2023–12–12）

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