黃紅林 呂麗麗,2 呂繼濤 饒子漁 耿方蘭 曹 冬 康躍惠 溫 蓓,2
(1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100085;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京,100049)
根際(rhizosphere)是連接植物、土壤和微生物的核心,是土壤形成、碳循環(huán)和地球陸地生態(tài)系統(tǒng)最終生產(chǎn)力的基礎(chǔ),同時(shí)也是微生物在土壤中活動(dòng)的關(guān)鍵場(chǎng)所[1?4].根際的概念是1904年德國科學(xué)家Hilter 首次提出.由此,根際化學(xué)與生物學(xué)過程的相關(guān)研究已經(jīng)經(jīng)歷了一百多年[5].可以確定,根際是植物、土壤和微生物與環(huán)境交互作用的中心,是生物化學(xué)過程耦合最活躍的區(qū)域[6].
植物根系通過根系分泌、呼吸作用、養(yǎng)分吸收等各種形式和途徑將有機(jī)或者無機(jī)化合物釋放到周圍土壤,進(jìn)行著植物與土壤間物質(zhì)交換的重要的界面過程,創(chuàng)造了根際區(qū)獨(dú)特的化學(xué)環(huán)境.并且,這些物質(zhì)在化學(xué)上具有多樣性,從簡單的低分子量的有機(jī)酸、糖、氨基酸,到復(fù)雜的維生素和植物激素;還有大分子的多種碳水化合物、肽和蛋白質(zhì),以及根組織的脫落物等[7](表1).
表1 根際主要化合物的來源、種類及組成Table 1 Source,category and composition of the main compounds in the rhizosphere
隨著植物種屬、發(fā)育進(jìn)程、營養(yǎng)、土壤類型、環(huán)境特征及其他因素的改變,根系分泌物的組成也隨之而變化[8],即根系分泌不是均勻或靜態(tài)的.植物通過根系分泌物這個(gè)重要的媒介與外界進(jìn)行物質(zhì)交流,根系分泌組成從根本上決定了根際的化學(xué)多樣性.其次,根際微生物涵蓋細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物等[9],其在數(shù)量上為根際外土壤的幾至幾十倍,存在著顯著的多樣性和復(fù)雜性.大量微生物聚集于根系周圍,將有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化為植物可以吸收的養(yǎng)分;同時(shí),植物生長過程中的根系分泌物、死根、根脫落物能夠給予微生物必需的營養(yǎng)和能量[10].而且,根際微生物群即使在同一植物的不同品種也可表現(xiàn)出其高度的特異性[11].經(jīng)過長達(dá)數(shù)億年的共同進(jìn)化,根際微域中植物與地下生物,尤其是微生物之間產(chǎn)生了繁雜的動(dòng)態(tài)互作關(guān)系,即為根際效應(yīng)[1,12?13].已證明根系分泌物會(huì)調(diào)控土壤微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和功能[14].這表明,植物根系在不同時(shí)空分泌的物質(zhì)特異性、種類和數(shù)量都可能介導(dǎo)了微生物群落的組裝模式[15].但是,根系分泌物的化學(xué)性質(zhì)和微生物底物的偏好性如何驅(qū)動(dòng)根際微生物群落的構(gòu)成與演替及其機(jī)制還需要深入的探討[8].目前,受研究方法的局限,人們對(duì)根際中植物與微生物復(fù)雜的相互作用的認(rèn)識(shí)還非常欠缺.本文綜述了根際化學(xué)與生物學(xué)方法的最新進(jìn)展,重點(diǎn)闡述了組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)研究中的機(jī)遇與挑戰(zhàn),強(qiáng)調(diào)了其在相關(guān)尺度上揭示根際過程與機(jī)制的必要性.
精確表征和準(zhǔn)確定量根際土壤中的化合物類型是更好明晰根際化學(xué)過程的先決條件.但是,鑒于根際化學(xué)組分的龐雜性以及分離和提取根際土壤與土壤溶液的困難性,使得根-土界面化學(xué)組分的分析具有挑戰(zhàn)性.一直以來,根際化學(xué)組分的測(cè)定主要聚焦于根系分泌物中的小分子如:低分子量有機(jī)酸的定性和定量測(cè)定[9?11],卻對(duì)一些大分子化合物尤其是蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)的分析有所忽略,造成對(duì)根際化學(xué)多樣性認(rèn)識(shí)的偏差[16].檢測(cè)根際化學(xué)組分的方法從最初的化學(xué)分析,逐漸發(fā)展到后來的光譜分析、色譜分析、質(zhì)譜分析和色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等.
經(jīng)典的根際化學(xué)分析方法包括滴定法和比色法,主要針對(duì)根際中的小分子化合物,如采用Folin-Ciocalteu 試劑比色法測(cè)定根際中酚酸類物質(zhì)[9?10]、鉬藍(lán)法測(cè)定糖類物質(zhì)[17].由于樣品前處理簡單、分析快捷、反映信息量大等特點(diǎn),光譜法曾成為根際化學(xué)組分表征中應(yīng)用最廣泛的手段之一.光譜分析技術(shù)包括紫外、紅外、熒光光譜和核磁共振譜(NMR)等,用于識(shí)別根際中化學(xué)組分的芳香性、官能團(tuán)、疏水性和物質(zhì)構(gòu)成.比如,利用紫外光譜測(cè)定根際組分的特征參數(shù)A253/A203,這個(gè)參數(shù)的值大就說明芳香環(huán)上取代基類型以羧基、酯類、羰基、羥基等極性官能團(tuán)為多,值小則表明主要為非極性的脂肪鏈官能團(tuán)組成[18?19];根際組分的芳香性可以通過紅外光譜的芳香性特征峰來判定[20];根際化學(xué)組分中類蛋白物質(zhì)、類腐殖酸物質(zhì)和類富里酸物質(zhì)等可采用三維熒光光譜的不同激發(fā)波長、發(fā)射波長下的特征熒光峰進(jìn)行指示[21];核磁共振譜能利用化合物在碳譜、氫譜上的化學(xué)位移等參數(shù)獲得根際化合物的碳組分、氫組分信息[22?23].
色譜及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也是根際化學(xué)組分識(shí)別和鑒定的常用方法[24].利用得到的色譜和質(zhì)譜信息,與相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫匹配就可獲取有關(guān)物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的大量信息.色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS).GC-MS 用于分離分析根際中揮發(fā)性和半揮發(fā)性的有機(jī)物,通過酯化、甲硅烷化、乙酰化和烷基化等衍生化反應(yīng)后也可用來測(cè)定非揮發(fā)性和極性有機(jī)化合物[25?28].目前,GC-MS 已被廣泛用于根系分泌物中低分子量有機(jī)酸的鑒定和定量研究[29],也有將其用于作物,如玉米、羽扇豆和小麥根系黏液中的脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸酰胺的檢測(cè)[30?33].然而,這些分析方法大多只是對(duì)根系分泌物進(jìn)行了定性研究,并沒有提供基于濃度的數(shù)據(jù).HPLC 是檢測(cè)分離非揮發(fā)性和極性根系分泌物最常用的方法[34],但靈敏度和選擇性比GC-MS 低.作為替代技術(shù),采用液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(LC-ESI-MS),在正、負(fù)電離模式下對(duì)各種極性和中等極性化合物進(jìn)行軟電離,并提供高質(zhì)量的選擇性和靈敏度,從而使LC-ESI-MS 成為根際科學(xué)研究中一種有吸引力的技術(shù)[35?37].然而,ESI 與HPLC 流動(dòng)相的兼容性方面存在一些缺陷,結(jié)合電化學(xué)抑制器的發(fā)展為LCMS 給根際研究的應(yīng)用帶來了更大的靈活性[38].總而言之,色譜及色譜串聯(lián)低分辨質(zhì)譜法適用于有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)物的測(cè)定,能夠檢測(cè)的化合物非常受限.因此,根系分泌物的相關(guān)分析在過去幾十年僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)諸如低分子量有機(jī)酸、部分糖、脂肪酸和氨基酸等少量化合物的識(shí)別.根際化學(xué)組成異常復(fù)雜,借助光譜手段、色譜分離技術(shù)及傳統(tǒng)的低分辨質(zhì)譜方法遠(yuǎn)不能解析根際化學(xué)分子的多樣性.
根際微生物通常采用培養(yǎng)和分離技術(shù)進(jìn)行研究.微生物平板培養(yǎng)技術(shù)是一種傳統(tǒng)的根際微生物研究方法[39].該法能大概估計(jì)土壤微生物的種類、數(shù)量和分布,但是,不能夠?qū)?yōu)勢(shì)物種做進(jìn)一步的鑒定,難以開展系統(tǒng)發(fā)育的分析.此外,培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的改變會(huì)對(duì)微生物形成選擇性,且約99%以上的根際微生物不可培養(yǎng)[40].Biolog 氧化還原技術(shù)是以群落水平的碳源利用類型為基礎(chǔ),為研究根際土壤微生物功能多樣性提供了一種簡單而快速的方法[41?42].然而,源于不同微生物對(duì)同一碳源的利用不同,碳源的代謝指紋差異不能單純地歸因微生物群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的差異,即代謝多樣性不一定真實(shí)地反映整個(gè)根際微生物群落功能的多樣性[43].而將微生物群落結(jié)構(gòu)與其環(huán)境活性相關(guān)聯(lián)的磷脂脂肪酸-穩(wěn)定同位素探測(cè)(PLFA-SIP)的方法,可以獲取根際微生物多樣性更全面的信息[44?46].雖然這些方法克服了微生物培養(yǎng)技術(shù)的一些局限性,但是它們實(shí)現(xiàn)不了對(duì)根際微生物多樣性更為精細(xì)的解析.
隨后,分子生物學(xué)技術(shù)在根際微生物研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用.1979年,F(xiàn)ischer 和Lerman 最先提出了變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù),用于測(cè)定DNA 突變[47],并于1993年用于首次研究微生物群落結(jié)構(gòu)[48].與DGGE 具有相似原理的溫度梯度凝膠電泳(TGGE),利用溫度梯度替代化學(xué)變性劑,也在微生物領(lǐng)域逐漸被應(yīng)用.DGGE/TGGE 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可重現(xiàn)性高、操作簡單等,但對(duì)無熒光標(biāo)記的DNA 不敏感,且只能分析微生物群落中數(shù)量超過1%的優(yōu)勢(shì)種群.末端限制性片段長度多態(tài)性(TRFLP)方法用來確定所選DNA 片段的長度多態(tài)性,并分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[49],在根際微生態(tài)研究方面的應(yīng)用越來越普遍.但是,T-RFLP 法也存在很多潛在的缺陷,例如:單個(gè)峰包羅多個(gè)物種、單個(gè)物種分布在多個(gè)峰、物種和峰的隨機(jī)錯(cuò)誤匹配等等.DAN 測(cè)序Sanger 技術(shù),具有讀長長和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn),也曾是根際微生物較為有效的鑒定方法[50].盡管根際中觀察到的微生物差異和數(shù)量是巨大的,但尚缺乏有關(guān)其結(jié)構(gòu)與功能多樣性的詳細(xì)信息.傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)方法逐漸被高速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)取代.
鑒于根際的異質(zhì)性和復(fù)雜性,根際化學(xué)與生物多樣性及其耦合關(guān)聯(lián)性的研究要求采用先進(jìn)的技術(shù).新興的技術(shù)需要同時(shí)滿足靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好,高時(shí)空分辨率、大動(dòng)態(tài)范圍和高通量等要求[51].最近,代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)以及幾者整合的多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展拓展了根際科學(xué)研究的新方向,全方位、多層次提供植物根系分泌的動(dòng)態(tài)變化特征和根際微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的詳細(xì)信息,能夠深入研究復(fù)雜的根際化學(xué)和微生物多樣性,有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關(guān)鍵過程與機(jī)制[52?55].根際科學(xué)中組學(xué)的研究方法、主要技術(shù)與平臺(tái)、研究內(nèi)容等匯總見表2.
表2 組學(xué)方法在根際科學(xué)研究中的匯總Table 2 Summary of the omics analysis in the study of rhizosphere science
代謝組學(xué)研究策略中最實(shí)用的方法之一是代謝全譜的分析.它以組學(xué)的視角無偏向性地大規(guī)模檢測(cè)分析所有的小分子代謝物,并采用生物信息學(xué)手段旨在發(fā)現(xiàn)整體代謝網(wǎng)絡(luò)特征和涉及的代謝物變化特征,提升對(duì)基因、蛋白質(zhì)和植物代謝之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)[56?57].代謝組學(xué)分析往往需要多個(gè)生物學(xué)重復(fù),代謝物的提取、富集和去除雜質(zhì)等樣品前處理是關(guān)鍵.樣本的前處理方法包括液-液萃取、固相萃取、加速溶劑萃取、超臨界流體萃取、微波輔助萃取等[29].根和根際群落成員之間的相互作用主要是通過化學(xué)通訊來實(shí)現(xiàn)的,根際代謝組學(xué)有助于更好地理解這種化學(xué)對(duì)話[58].根際代謝組學(xué)聚焦于分析根-土壤界面的整個(gè)代謝組[24],即側(cè)重于研究參與化學(xué)信號(hào)傳遞的初級(jí)代謝產(chǎn)物和植物天然產(chǎn)物以及與根系相關(guān)的微生物類群的分泌物.
GC-MS、LC-MS 以及NMR 是分析根際代謝組最為常用的技術(shù),且GC-MS 和LC-MS 比NMR 更為靈敏[59?61].當(dāng)前代謝組學(xué)研究對(duì)象面向微量化、復(fù)雜化及規(guī)?;虼素酱l(fā)展更為高端的分析技術(shù).相比于低分辨質(zhì)譜,高分辨質(zhì)譜因具有高靈敏度、高分辨率和精度、寬動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì)逐漸成為組學(xué)研究不可或缺的工具[24].高分辨質(zhì)譜提供化合物精確的質(zhì)量數(shù),能夠區(qū)分復(fù)雜背景中的雜質(zhì)及共流出物,降低了對(duì)樣品前處理的要求.此外,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)可以推測(cè)未知化合物的元素組成,為高通量篩選提供了線索.通過氣相/液相色譜與高分辨質(zhì)譜的聯(lián)用的技術(shù)平臺(tái)靶向和非靶向可以鑒定根際盡可能多的代謝物[62].氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)可用于快速,高靈敏度地檢測(cè)植物根系大量代謝物小分子[63?64].應(yīng)用GC-TOF-MS,Luo 等[56]分析了生態(tài)型東南景天根系分泌物的代謝譜,共檢測(cè)出15 種潛在的生物標(biāo)志物,具體包括有機(jī)酸、氨基酸、醇類、脂肪酸、酚類等組分.Zhao 等[65]通過氫核磁共振譜1H-NMR 結(jié)合GC-MS 的非靶向代謝組學(xué)分析,研究了水培體系中黃瓜幼苗植株對(duì)納米銅的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)納米銅引發(fā)了黃瓜葉片和根系分泌物的代謝變化,成功地識(shí)別了納米粒子誘導(dǎo)的生理反應(yīng).植物提取物中大部分代謝物都難揮發(fā)[66],不能采用GC 進(jìn)行直接分析,而是需要將其轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性較小,揮發(fā)性更高的衍生物[62].而LC/MS 無需衍生,可以直接對(duì)代謝物進(jìn)行代謝譜檢測(cè),是分析代謝物變異和生物代謝途徑的理想平臺(tái)[67].為了探索模式植物擬南芥根系分泌物的化學(xué)組分,Strehmel 等[68]開發(fā)了一種根系分泌代謝物的非靶向分析流程,以UPLC-ESI-QTOF/MS 為分析手段,共檢測(cè)到100 多種代謝物,分類表征了90 種化合物的結(jié)構(gòu),其中42 種通過了已知化合物標(biāo)準(zhǔn)品的印證.Marti 等[69]基于UPLC-TOF-MS 的代謝組學(xué)方法評(píng)估了斜紋夜蛾侵染的玉米幼苗葉片、汁液、根系和根系分泌物的變化,鑒定出32 種差異代謝物,并通過微流核磁共振(CapNMR)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,通過高通量直接納米注入串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)方法對(duì)9 種化合物進(jìn)行了量化,研究表明食草動(dòng)物的攻擊會(huì)導(dǎo)致植物代謝物的誘導(dǎo),這些代謝物對(duì)葉和根中的食草動(dòng)物抗性具有不同的影響.采用HPLC、離子色譜結(jié)合GCTOF-MS,Carvalhais 等[70]分析了玉米根系分泌物中的氨基酸、有機(jī)酸和糖類,發(fā)現(xiàn)缺乏某些養(yǎng)分時(shí)根際代謝物的形態(tài)發(fā)生了定性和定量的變化,并且代謝物的分泌模式與土壤中養(yǎng)分的擴(kuò)散特性存在聯(lián)系.類似地,當(dāng)植物葉片暴露于納米二氧化硅(SiO2NPs)時(shí),Tian 等[71]觀察到根際代謝產(chǎn)物譜發(fā)生了顯著變化,幾種代謝物糖和糖醇、脂肪酸、少量有機(jī)酸包括的相對(duì)豐度顯著增加;且氨基酸水平顯著下降,表明根際碳氮庫發(fā)生了變化.結(jié)合其他學(xué)者的多個(gè)研究[72?75]證實(shí)根際代謝組可以深入揭示生物體中污染物解毒的分子響應(yīng)機(jī)制.
傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)擁有超高的準(zhǔn)確度、分辨率和超低的樣品處理要求[76].能夠進(jìn)行非靶標(biāo)代謝分析.FT-ICR-MS 可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的單個(gè)化學(xué)組分,通過內(nèi)部校準(zhǔn)來達(dá)成相對(duì)定量,它還可以根據(jù)精確的質(zhì)量數(shù)確定根際代謝物所屬的類別,是鑒定根際化學(xué)分子組成最有前途的分析技術(shù)之一[77].結(jié)合正、負(fù)離子模式,Miao 等[16]首次利用FT-ICR-MS 表征了植物根系分泌物的分子組成,共檢測(cè)出8000 余種分子,研究發(fā)現(xiàn)與土壤DOM 相比,根系分泌物含有更多的蛋白質(zhì)類、脂肪類和碳水類化合物,而木質(zhì)素類化合物含量較少.Kaplan 等人[78]采用FT-ICR-MS 比較了濕地中植物根際土壤和本體土壤可溶性有機(jī)質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)根際含有一些在非根際土壤中未鑒定的有機(jī)分子,且根際有機(jī)質(zhì)分子通常具有更大的分子量,更少的芳香性,更多的羧酸鹽和含氮COO 官能團(tuán)以及更大的親水性,表明不僅根際有機(jī)質(zhì)的數(shù)量,而且其分子特征可能在一定程度上導(dǎo)致濕地中污染物的固定化增強(qiáng),為污染濕地長期管理提供了啟示.目前,F(xiàn)T-ICR-MS 易實(shí)現(xiàn)幾十萬甚至上百萬的分辨率,以及亞ppm 級(jí)的質(zhì)量準(zhǔn)確度[79],提供可靠的元素組成和分子式信息,已成為研究根際中復(fù)雜化學(xué)組分的優(yōu)選方法[80].然而,沒有任何單一的分析方法或儀器組合能夠覆蓋給定樣本的整個(gè)代謝組組成[60].在未來,擴(kuò)展代謝組覆蓋范圍的新分析技術(shù)將非常重要.最近,靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)質(zhì)譜技術(shù)與LC 或GC 相結(jié)合,為植物分泌物和微生物的非靶向代謝組學(xué)提供了當(dāng)前最佳選擇.然而,在不久的將來,離子遷移光譜質(zhì)譜法(IMS-MS)可能會(huì)成為非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的拐點(diǎn).其允許在一次運(yùn)行中檢測(cè)和表征數(shù)百種代謝物[81?82].因此,IMS-MS 代謝組學(xué)將在以前從未實(shí)現(xiàn)的時(shí)間范圍內(nèi),從非常復(fù)雜的根際中快速準(zhǔn)確地獲得代謝組學(xué)圖譜.此外,不同技術(shù)如:高分辨LC-MS 與GC-MS 和/或超高分辨FT-ICRMS 耦合起來,將有助于從復(fù)雜混合物中發(fā)現(xiàn)濃度極低的新化合物,獲取廣泛的代謝組學(xué)指紋.由此,基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的高通量的組學(xué)技術(shù)有助于更加全面地分析根際化學(xué)分子多樣性分布特征,逐漸成為根際科學(xué)的研究趨勢(shì).
盡管如此,根際代謝組學(xué)目前仍然是一個(gè)新興領(lǐng)域,在理解根際復(fù)雜系統(tǒng)方面仍有很大的發(fā)展空間.一方面,由于根系分泌物取樣的限制、組學(xué)分析平臺(tái)的靈敏性以及相關(guān)尺度上實(shí)時(shí)追蹤分泌物的時(shí)空動(dòng)態(tài)的困難性[58],導(dǎo)致根際的代表性顯示出明顯不足.另一方面,為了準(zhǔn)確理解代謝過程中植物和微生物兩者復(fù)雜的相互作用,必須從微生物和植物以及它們相互作用的最終產(chǎn)物中獲得單獨(dú)的數(shù)據(jù).研究者們通過不同的方法對(duì)植物滲出液收集進(jìn)行了多次嘗試[83],但根際代謝組學(xué)面臨的最大挑戰(zhàn)是區(qū)分微生物和植物各自的代謝產(chǎn)物,以及它們相互作用的最終產(chǎn)物.因此,有必要對(duì)根際不同部分進(jìn)行精確取樣和優(yōu)化分析方案,以便更為精準(zhǔn)表征根際和陸生生態(tài)系統(tǒng)中植物和微生物代謝過程的綜合性質(zhì).
大多數(shù)棲息在根際區(qū)域的微生物是無法培養(yǎng)的,無從對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析.宏基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)因突破了有些微生物不可培養(yǎng)的瓶頸而顯示其優(yōu)勢(shì).它們能夠快速高效地獲取植物根際專屬微生物群落的詳細(xì)信息[84?85].隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展[86],宏基因組和轉(zhuǎn)錄組逐漸應(yīng)用于研究根際微生物群落結(jié)構(gòu)[87];推斷根際核心微生物群落[88]及其代謝潛力[89];闡釋植物-微生物相互作用[90];探討外源有毒污染物處理下的根際微生物群落表達(dá)[91].利用宏基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)對(duì)根際的研究主要集中于模式植物擬南芥[87?88]、豆類和谷物[89?91].這些研究提供了大量關(guān)于擾動(dòng)響應(yīng)以及根際群落的豐度、結(jié)構(gòu)、多樣性、空間分布和核心成員的信息,也為破譯環(huán)境中有機(jī)和無機(jī)污染物解毒、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的分子機(jī)制提供新的機(jī)遇[92].
宏基因組也稱微生物環(huán)境基因組或元基因組,其以某一特定環(huán)境中微生物的基因組為研究對(duì)象,采用生物信息學(xué)的分析方法,研究微生物的多樣性、微生物的群落結(jié)構(gòu),探索微生物的潛在功能以及與環(huán)境之間的互作關(guān)系.利用16SrDNA 測(cè)序的宏基因組學(xué)領(lǐng)域的第一項(xiàng)重大研究表明本體土壤和根際土壤的微生物群落顯著不同,根際存在著多種特異的微生物種群[88].通過特定基因的擴(kuò)增子靶向或鳥槍測(cè)序?qū)χ参锔H、葉際或內(nèi)生圈進(jìn)行宏基因組分析,研究者們總結(jié)出寄主-微生物和微生物-微生物聯(lián)合作用共同推動(dòng)了根-土壤界面微生物的分化[87].Alzubaidy 等[93]運(yùn)用宏基因組學(xué)方法研究了紅海中紅樹林微生物群,結(jié)合454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)探討了與白骨壤相關(guān)的根際微生物群.這項(xiàng)研究首次深入了解了灰紅樹林根際土壤微生物的功能范圍和多樣性.Bhattacharyya 等[94]在他們的研究中描述了低地水稻的全基因組宏基因組測(cè)序分析,該結(jié)果篩選出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落為扁平菌、變形菌和厚壁菌.Pascual 等[95]同時(shí)利用可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的策略來探索生長在西班牙內(nèi)華達(dá)山脈國家公園的百里香根際的細(xì)菌群落,宏基因組學(xué)研究證明了居住在根際的一個(gè)小型“核心”微生物群落以及叢枝菌根真菌和其他有益微生物可以用作生物接種劑.下一代測(cè)序技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)方法的發(fā)展使科學(xué)家能夠設(shè)計(jì)策略和操作流程,以更好地了解亞基因組.Bell 等[86]進(jìn)行了一項(xiàng)針對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn),重金屬對(duì)植物的脅迫決定微生物修復(fù)的強(qiáng)度,根際叢枝菌根真菌數(shù)量取決于重金屬濃度水平[85].事實(shí)上,宏基因組學(xué)既可以通過靶向保守區(qū)域來確定群落結(jié)構(gòu),也可以使用重組DNA 的經(jīng)典技術(shù)來確定任何環(huán)境中功能基因的可用性[92].因此,它有助于量化微生物群落內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率.在植物修復(fù)過程中,一些功能未知的微生物菌株可能棲息在根際,并可能獲取新污染物降解途徑,為根際土壤中污染物去除的植物-微生物相互作用提供了見解.
轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)注整個(gè)微生物群落中的基因表達(dá),并解釋特定環(huán)境中微生物種群的動(dòng)態(tài)功能,是研究復(fù)雜的微生物生理學(xué)、功能分析和未知的微生物群落結(jié)構(gòu)的一種有力的技術(shù).轉(zhuǎn)錄組還可以表征環(huán)境樣本的實(shí)時(shí)mRNA 表達(dá)[96],通過闡明特定轉(zhuǎn)錄基因并對(duì)植物相關(guān)微生物群落進(jìn)行功能分析,支持宏基因組學(xué)獲得的數(shù)據(jù).利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,研究人員比較了3 種不同作物:燕麥、豌豆和小麥的根際微生物群,發(fā)現(xiàn)豌豆根際比非根際中含有更多的微生物,并且微生物組表現(xiàn)出顯著不同的根際特異性[5].此外,轉(zhuǎn)錄組法能夠精確地表示復(fù)雜微生物群落中活躍表達(dá)的基因,從而剖析微生物組在特定污染環(huán)境下功能的改變,為土壤污染物轉(zhuǎn)化或降解機(jī)制提供新見解.例如:de Menezes 等[97]研究暴露于菲的土壤微生物轉(zhuǎn)錄組,觀測(cè)到雙加氧酶及與解毒和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因豐度增加.對(duì)田間生長的柳樹根際和根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序時(shí),Yergeau 等[98]發(fā)現(xiàn)與降解關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄物在污染土壤和柳樹根際中明顯富集,隨后其消減與放線菌目、紅螺旋菌目、伯克霍爾德菌目等相關(guān)[99].研究施加農(nóng)藥后玉米和大豆轉(zhuǎn)錄組時(shí),發(fā)現(xiàn)草甘膦會(huì)影響作物細(xì)胞氨基酸代謝和碳水化合物的含量[91],mRNA 豐度與阿特拉津降解活性之間存在著密切的聯(lián)系[100].轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,許多參與碳?xì)浠衔锷锝到獾幕蛟诜N植園污染土壤中表達(dá)最為豐富,說明物種間的相互作用在污染物修復(fù)中具有越來越重要的意義.宏基因組學(xué)分析代表根際中微小數(shù)量的真核生物,而轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示超過25%的真核生物能夠被讀取,這可能對(duì)受污染土壤根際的微生物功能起到重要指導(dǎo)作用[90].由此,宏基因組-轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的結(jié)合可能會(huì)解釋根際微生物群在污染場(chǎng)地根際修復(fù)中的相對(duì)有效性.
蛋白組學(xué)對(duì)給定時(shí)間直接從環(huán)境樣本中回收的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分析[101],在土壤研究方面有一定的優(yōu)勢(shì).首先,由于mRNA 和蛋白質(zhì)豐度之間的弱相關(guān)性,以及mRNA 轉(zhuǎn)錄后處理和修飾的復(fù)雜性,即使是基于核酸的方法也受到很大限制[102].其次,根際土壤中的生物過程也很復(fù)雜,不僅受到微生物的驅(qū)動(dòng),還受到生態(tài)系統(tǒng)中動(dòng)植物的驅(qū)動(dòng),擴(kuò)展土壤蛋白質(zhì)鑒定對(duì)于理解土壤生態(tài)過程和影響根際土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的環(huán)境因素至關(guān)重要[103].根際土壤蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白水平上為土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物過程提供了直接證據(jù).因此,蛋白質(zhì)組學(xué)可以作為研究根際土壤生物學(xué)的重要工具.
蛋白組學(xué)在根際中研究中的應(yīng)用非常有限.Wang 等[104]建立了一種適用于不同土壤蛋白質(zhì)的提取方法,利用雙向凝膠電泳(2-DE)鑒定出接近1000 個(gè)具有高重現(xiàn)性的單獨(dú)斑點(diǎn),通過MALDI-TOF/TOFMS 成功識(shí)別了水稻土壤中122 種蛋白質(zhì)的189 個(gè)斑點(diǎn).對(duì)蛋白質(zhì)組解析,發(fā)現(xiàn)根際大約三分之一的蛋白質(zhì)點(diǎn)無法鑒定,且來自植物的保守蛋白構(gòu)成了根際蛋白質(zhì)組的特征分布;蛋白的功能揭示了土壤生物群落中涉及的各種代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),證實(shí)作物根際土壤中植物和微生物之間復(fù)雜的相互作用,為土壤生物學(xué)的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個(gè)范式.隨后,Wu 等[105]發(fā)展了根際土壤的比較元蛋白質(zhì)組學(xué),闡釋了糯稻連作障礙的潛在機(jī)制.根際土壤蛋白組學(xué)分析表明來源于植物和微生物的蛋白質(zhì)在根際土壤生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用.進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)根際土壤與非根際土壤中有33 個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn).Hultman 等[106]在多年凍土中鑒定出7000 種蛋白質(zhì),無論是本體土壤還是根際土壤,其微生物多樣性都遠(yuǎn)高于永久凍土;與低生長凍土相比,由于這些土壤類型中微生物的生長速率更高,散裝土壤和根際土壤中獨(dú)特蛋白質(zhì)的數(shù)量可能比永久凍土多1 個(gè)數(shù)量級(jí)[107].迄今,蛋白質(zhì)組學(xué)還被用于表征與凋落物分解相關(guān)的根際[108]、水稻根際/根組織中的甲烷諾菌[109]、作物根際[104,110]和黑塊菌[111].水稻葉際、植物地上部和根際宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析識(shí)別了約4600 種蛋白質(zhì),主要功能涉及產(chǎn)甲烷和甲烷氧化.
同樣,根際蛋白組學(xué)也是一種相對(duì)較新的方法,它面臨著許多需要解決的經(jīng)驗(yàn)、技術(shù)、計(jì)算和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等挑戰(zhàn).根際存在高度的生物多樣性、蛋白質(zhì)冗余以及蛋白提取困難等普遍問題[112].由于生物體含有與其他許多蛋白質(zhì)相似的冗余肽,通過將蛋白質(zhì)消化成肽,其特異性喪失.這一挑戰(zhàn)將基于自下而上的蛋白組學(xué)方法簡化為一種主要用于評(píng)估相關(guān)生物群中蛋白質(zhì)變化的技術(shù).另一個(gè)值得注意的點(diǎn)是,自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)方法傾向于檢測(cè)來自高度翻譯蛋白質(zhì)的肽,如核糖體蛋白、伴侶蛋白和其他參與細(xì)胞維持的蛋白.該方法測(cè)量完整的蛋白質(zhì),可以緩解冗余問題.因此,自上而下的蛋白組學(xué)為根際研究提供了另一個(gè)直接的機(jī)遇.即可以通過更佳的蛋白質(zhì)組提取方法和分餾,降低肽的復(fù)雜性,提高蛋白質(zhì)組的覆蓋率.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)與下游代謝組學(xué)分析不兼容.一種從根際土壤中同時(shí)提取代謝物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的新方法提供了改進(jìn)的可能[113].進(jìn)一步,在線2D 分離,包括直接電噴霧到質(zhì)譜儀中的強(qiáng)陽離子交換,或高/低pH 反相的二維分離,也可以提高蛋白覆蓋率[114?115].這些附加的分離技術(shù)降低了質(zhì)量分析儀的復(fù)雜性,允許對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)的覆蓋范圍進(jìn)行更多檢測(cè).使用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)以及串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)等標(biāo)準(zhǔn)肽標(biāo)記方法不可能實(shí)現(xiàn)在一次分析中運(yùn)行多個(gè)樣本[116?117].此外,根際土壤樣品的基質(zhì)中含有豐富的腐殖酸,這阻礙了有效標(biāo)記.而無標(biāo)記樣本無法多路復(fù)用,復(fù)接超蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的首選方法是向微生物群落提供同位素標(biāo)記的底物(例如13C、15N、18O 和2H),直接為根際和/或土壤樣品中的定量蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記蛋白質(zhì)[118].
單一組學(xué)分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)僅僅提供了單一層次的理解,而生物數(shù)據(jù)集是異構(gòu)的,因此需要多層網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)來理解交互式作用,以概述生物學(xué)機(jī)制.多組學(xué)的整合使用整體而不是簡化的生物學(xué)研究方法,在單個(gè)生物體和多生物體群落中,利用來自基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等,集成多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)集信息[119].目前,根際復(fù)雜的相互作用的研究局限于嘗試通過單一組學(xué)的方法來闡釋[120],對(duì)根際科學(xué)中多組學(xué)方法的潛力僅僅進(jìn)行了初步探討.例如:聯(lián)合DNA、mRNA 和蛋白組的多組學(xué)方法,Hultman 等[106]全面探索了永久凍土的微生物組,該研究是通過單獨(dú)處理每個(gè)組,然后整合使用比率、基因組可視化和雙標(biāo)圖來揭示所有組學(xué)的多重益處.多組學(xué)研究往往使用各種儀器直接收集和測(cè)量數(shù)據(jù),至少分子生物學(xué)的“中心法則”:即遺傳信息從DNA 到RNA 到蛋白質(zhì)的流動(dòng)仍適用,同時(shí)需要考慮多變量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量、分析和整合各組學(xué).Larsen 等[121]的研究從基因組、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、DNA 結(jié)合基序和蛋白質(zhì)組的先驗(yàn)知識(shí)與基于實(shí)驗(yàn)室的共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合,以獲得多組學(xué)關(guān)聯(lián)結(jié)果,為植物-菌根相互作用提供了一個(gè)極好的框架,用于以綜合的整體方法對(duì)各種組學(xué)進(jìn)行建模.同時(shí),基于網(wǎng)絡(luò)分析和基于聚類方法是整合多個(gè)組學(xué)研究結(jié)果最流行的方法.Bersanelli 等[122]和de Keersmaecker 等[123]分別從數(shù)學(xué)和單一微生物基因組的角度對(duì)此進(jìn)行了綜述.此外,多組學(xué)將所獲得的不同組學(xué)的信息關(guān)聯(lián),從整體研究生物系統(tǒng)對(duì)基因或環(huán)境變化的響應(yīng)網(wǎng)絡(luò),有助于對(duì)機(jī)理的全面揭示.Haas 等[124]推薦了多組學(xué)方法,詳細(xì)闡述了基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組學(xué)作為戰(zhàn)略構(gòu)建技術(shù),以了解和豐富植物的根際,利用植物細(xì)菌相互作用來改善多環(huán)芳烴(PAHs)降解,在機(jī)理闡釋的基礎(chǔ)上作者提出并描述了使用組學(xué)方法對(duì)PAHs 降解的根際微生物組進(jìn)行工程改造的前景.
雖然,多組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中應(yīng)用前景廣闊,但新技術(shù)也面臨一些困難和需要挑戰(zhàn)的方面.首先,根際存在的大量微生物組,它們相互連接形成的微生物網(wǎng)絡(luò)不僅與植物直接相互作用,也受根系分泌組分的驅(qū)動(dòng)[125].由此,根際組學(xué)的數(shù)據(jù)體量大,數(shù)據(jù)整合異常復(fù)雜.其次,組學(xué)數(shù)據(jù)分布不規(guī)則,具有稀疏性,為確保統(tǒng)計(jì)學(xué)的有效性和可靠性,分析根際組學(xué)需要每個(gè)樣本有更多的重復(fù)[126],這給根際組學(xué)的數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)管理帶來新挑戰(zhàn).再者,組學(xué)中軟件的大批數(shù)據(jù)是可用的,但不能充分分析和挖掘,即軟件本身存在系統(tǒng)性問題,阻止了數(shù)據(jù)的有效利用.并且,傳統(tǒng)的信息數(shù)據(jù)處理算法已不能滿足大數(shù)據(jù)的處理要求.因此,多組學(xué)的大數(shù)據(jù)整合分析需要不斷地更新軟件、開發(fā)新算法和優(yōu)化新方法[120,127].總之,多組學(xué)方法還存在著前期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集與制備,中期的數(shù)據(jù)文庫系統(tǒng)的完善,后期生物學(xué)意義的闡釋等多方面的挑戰(zhàn)[128].
根土界面的化學(xué)反應(yīng)與生物過程復(fù)雜.根際滲出物的化學(xué)表征和量化在很大程度上是一個(gè)分析挑戰(zhàn).根際科學(xué)正在迅速向跨學(xué)科方法過渡,需要多學(xué)科領(lǐng)域的交叉合作,包括化學(xué)、生物學(xué)、生物信息學(xué)、土壤學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等.針對(duì)土壤“黑箱”,傳統(tǒng)的研究方法大大低估了根際化學(xué)和生物的多樣性及其關(guān)聯(lián).近年,組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)將會(huì)推進(jìn)根際科學(xué)的快速進(jìn)展.本文綜述了根際傳統(tǒng)的化學(xué)與微生物分析方法,并重點(diǎn)討論了新型組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中應(yīng)用進(jìn)展與挑戰(zhàn).針對(duì)目前國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀以及存在的問題,對(duì)本文作出如下總結(jié)和展望:
(1)全面了解根際化學(xué)多樣性才能更好地理解根際界面過程.依靠光譜技術(shù)、色譜的分離手段以及傳統(tǒng)的低分辨質(zhì)譜分析方法,過去關(guān)于根系分泌物的檢測(cè)只實(shí)現(xiàn)了對(duì)有限化合物的識(shí)別與鑒定.傳統(tǒng)的研究方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法解析根際分子組成的多樣性.亟需開發(fā)和應(yīng)用先進(jìn)的采樣程序,結(jié)合高選擇性和高靈敏度的分析技術(shù),準(zhǔn)確量化根釋放的多種化合物,開發(fā)研究自然條件下根際生態(tài)的新方法,完整理解根際動(dòng)態(tài)過程.
(2)由于微生物的數(shù)量多樣性,根際土壤代表了一個(gè)異常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng).傳統(tǒng)的根際微生物培養(yǎng)法尚不能提供有關(guān)微生物種群結(jié)構(gòu)和功能多樣性的詳細(xì)信息.典型的聚合酶鏈反應(yīng)方法,逐漸被高速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)所替代.
(3)組學(xué)技術(shù)為根際科學(xué)的研究提供了良好的契機(jī).基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的組學(xué)方法已成為代謝物鑒定的重要手段,有助于深入揭示根際化學(xué)多樣性過程.而基于宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等組學(xué)手段是研究根際微生物多樣性的有力手段.它們能夠識(shí)別基因、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì),提供根際微生物組成及微生物組基因和蛋白的表達(dá)、功能特性等更詳細(xì)的信息,全面揭示根際微生物的多樣性.
(4)盡管單一組學(xué)技術(shù)可以表征根際化學(xué)和生物多樣性豐富的信息,但是多組學(xué)的整合更是一種強(qiáng)有力的工具.多組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒏H微域群落結(jié)構(gòu)的不同數(shù)據(jù)集與微生物功能、表達(dá)、翻譯及最終的代謝物關(guān)聯(lián)起來,有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關(guān)鍵過程與機(jī)制.
(5)目前多組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中的研究面臨數(shù)據(jù)規(guī)模龐大、平行樣品和大數(shù)據(jù)管理復(fù)雜、軟件開發(fā)、模型構(gòu)建、算法更新等直接的挑戰(zhàn).但總得說來,根際科學(xué)為多組學(xué)方法的應(yīng)用提供了巨大的潛力.因此,應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是,未來需要開發(fā)和應(yīng)用先進(jìn)的取樣程序,發(fā)展更多的模型、框架和計(jì)算基礎(chǔ)來實(shí)現(xiàn)根際多組學(xué)的全面整合.