• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    根際化學(xué)與生物多樣性的表征方法:組學(xué)技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)*

    2024-03-01 10:44:58黃紅林呂麗麗呂繼濤饒子漁耿方蘭康躍惠
    環(huán)境化學(xué) 2024年1期
    關(guān)鍵詞:植物方法研究

    黃紅林 呂麗麗,2 呂繼濤 饒子漁 耿方蘭 曹 冬 康躍惠 溫 蓓,2

    (1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100085;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京,100049)

    根際(rhizosphere)是連接植物、土壤和微生物的核心,是土壤形成、碳循環(huán)和地球陸地生態(tài)系統(tǒng)最終生產(chǎn)力的基礎(chǔ),同時(shí)也是微生物在土壤中活動(dòng)的關(guān)鍵場(chǎng)所[1?4].根際的概念是1904年德國科學(xué)家Hilter 首次提出.由此,根際化學(xué)與生物學(xué)過程的相關(guān)研究已經(jīng)經(jīng)歷了一百多年[5].可以確定,根際是植物、土壤和微生物與環(huán)境交互作用的中心,是生物化學(xué)過程耦合最活躍的區(qū)域[6].

    植物根系通過根系分泌、呼吸作用、養(yǎng)分吸收等各種形式和途徑將有機(jī)或者無機(jī)化合物釋放到周圍土壤,進(jìn)行著植物與土壤間物質(zhì)交換的重要的界面過程,創(chuàng)造了根際區(qū)獨(dú)特的化學(xué)環(huán)境.并且,這些物質(zhì)在化學(xué)上具有多樣性,從簡單的低分子量的有機(jī)酸、糖、氨基酸,到復(fù)雜的維生素和植物激素;還有大分子的多種碳水化合物、肽和蛋白質(zhì),以及根組織的脫落物等[7](表1).

    表1 根際主要化合物的來源、種類及組成Table 1 Source,category and composition of the main compounds in the rhizosphere

    隨著植物種屬、發(fā)育進(jìn)程、營養(yǎng)、土壤類型、環(huán)境特征及其他因素的改變,根系分泌物的組成也隨之而變化[8],即根系分泌不是均勻或靜態(tài)的.植物通過根系分泌物這個(gè)重要的媒介與外界進(jìn)行物質(zhì)交流,根系分泌組成從根本上決定了根際的化學(xué)多樣性.其次,根際微生物涵蓋細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物等[9],其在數(shù)量上為根際外土壤的幾至幾十倍,存在著顯著的多樣性和復(fù)雜性.大量微生物聚集于根系周圍,將有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化為植物可以吸收的養(yǎng)分;同時(shí),植物生長過程中的根系分泌物、死根、根脫落物能夠給予微生物必需的營養(yǎng)和能量[10].而且,根際微生物群即使在同一植物的不同品種也可表現(xiàn)出其高度的特異性[11].經(jīng)過長達(dá)數(shù)億年的共同進(jìn)化,根際微域中植物與地下生物,尤其是微生物之間產(chǎn)生了繁雜的動(dòng)態(tài)互作關(guān)系,即為根際效應(yīng)[1,12?13].已證明根系分泌物會(huì)調(diào)控土壤微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和功能[14].這表明,植物根系在不同時(shí)空分泌的物質(zhì)特異性、種類和數(shù)量都可能介導(dǎo)了微生物群落的組裝模式[15].但是,根系分泌物的化學(xué)性質(zhì)和微生物底物的偏好性如何驅(qū)動(dòng)根際微生物群落的構(gòu)成與演替及其機(jī)制還需要深入的探討[8].目前,受研究方法的局限,人們對(duì)根際中植物與微生物復(fù)雜的相互作用的認(rèn)識(shí)還非常欠缺.本文綜述了根際化學(xué)與生物學(xué)方法的最新進(jìn)展,重點(diǎn)闡述了組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)研究中的機(jī)遇與挑戰(zhàn),強(qiáng)調(diào)了其在相關(guān)尺度上揭示根際過程與機(jī)制的必要性.

    1 傳統(tǒng)的根際化學(xué)與生物研究方法(Traditional analytical methods of chemicals and microorganisms in the rhizosphere)

    1.1 根際化學(xué)組分的經(jīng)典的研究方法

    精確表征和準(zhǔn)確定量根際土壤中的化合物類型是更好明晰根際化學(xué)過程的先決條件.但是,鑒于根際化學(xué)組分的龐雜性以及分離和提取根際土壤與土壤溶液的困難性,使得根-土界面化學(xué)組分的分析具有挑戰(zhàn)性.一直以來,根際化學(xué)組分的測(cè)定主要聚焦于根系分泌物中的小分子如:低分子量有機(jī)酸的定性和定量測(cè)定[9?11],卻對(duì)一些大分子化合物尤其是蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)的分析有所忽略,造成對(duì)根際化學(xué)多樣性認(rèn)識(shí)的偏差[16].檢測(cè)根際化學(xué)組分的方法從最初的化學(xué)分析,逐漸發(fā)展到后來的光譜分析、色譜分析、質(zhì)譜分析和色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等.

    經(jīng)典的根際化學(xué)分析方法包括滴定法和比色法,主要針對(duì)根際中的小分子化合物,如采用Folin-Ciocalteu 試劑比色法測(cè)定根際中酚酸類物質(zhì)[9?10]、鉬藍(lán)法測(cè)定糖類物質(zhì)[17].由于樣品前處理簡單、分析快捷、反映信息量大等特點(diǎn),光譜法曾成為根際化學(xué)組分表征中應(yīng)用最廣泛的手段之一.光譜分析技術(shù)包括紫外、紅外、熒光光譜和核磁共振譜(NMR)等,用于識(shí)別根際中化學(xué)組分的芳香性、官能團(tuán)、疏水性和物質(zhì)構(gòu)成.比如,利用紫外光譜測(cè)定根際組分的特征參數(shù)A253/A203,這個(gè)參數(shù)的值大就說明芳香環(huán)上取代基類型以羧基、酯類、羰基、羥基等極性官能團(tuán)為多,值小則表明主要為非極性的脂肪鏈官能團(tuán)組成[18?19];根際組分的芳香性可以通過紅外光譜的芳香性特征峰來判定[20];根際化學(xué)組分中類蛋白物質(zhì)、類腐殖酸物質(zhì)和類富里酸物質(zhì)等可采用三維熒光光譜的不同激發(fā)波長、發(fā)射波長下的特征熒光峰進(jìn)行指示[21];核磁共振譜能利用化合物在碳譜、氫譜上的化學(xué)位移等參數(shù)獲得根際化合物的碳組分、氫組分信息[22?23].

    色譜及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也是根際化學(xué)組分識(shí)別和鑒定的常用方法[24].利用得到的色譜和質(zhì)譜信息,與相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫匹配就可獲取有關(guān)物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的大量信息.色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS).GC-MS 用于分離分析根際中揮發(fā)性和半揮發(fā)性的有機(jī)物,通過酯化、甲硅烷化、乙酰化和烷基化等衍生化反應(yīng)后也可用來測(cè)定非揮發(fā)性和極性有機(jī)化合物[25?28].目前,GC-MS 已被廣泛用于根系分泌物中低分子量有機(jī)酸的鑒定和定量研究[29],也有將其用于作物,如玉米、羽扇豆和小麥根系黏液中的脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸酰胺的檢測(cè)[30?33].然而,這些分析方法大多只是對(duì)根系分泌物進(jìn)行了定性研究,并沒有提供基于濃度的數(shù)據(jù).HPLC 是檢測(cè)分離非揮發(fā)性和極性根系分泌物最常用的方法[34],但靈敏度和選擇性比GC-MS 低.作為替代技術(shù),采用液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法(LC-ESI-MS),在正、負(fù)電離模式下對(duì)各種極性和中等極性化合物進(jìn)行軟電離,并提供高質(zhì)量的選擇性和靈敏度,從而使LC-ESI-MS 成為根際科學(xué)研究中一種有吸引力的技術(shù)[35?37].然而,ESI 與HPLC 流動(dòng)相的兼容性方面存在一些缺陷,結(jié)合電化學(xué)抑制器的發(fā)展為LCMS 給根際研究的應(yīng)用帶來了更大的靈活性[38].總而言之,色譜及色譜串聯(lián)低分辨質(zhì)譜法適用于有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)物的測(cè)定,能夠檢測(cè)的化合物非常受限.因此,根系分泌物的相關(guān)分析在過去幾十年僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)諸如低分子量有機(jī)酸、部分糖、脂肪酸和氨基酸等少量化合物的識(shí)別.根際化學(xué)組成異常復(fù)雜,借助光譜手段、色譜分離技術(shù)及傳統(tǒng)的低分辨質(zhì)譜方法遠(yuǎn)不能解析根際化學(xué)分子的多樣性.

    1.2 根際微生物的傳統(tǒng)研究方法

    根際微生物通常采用培養(yǎng)和分離技術(shù)進(jìn)行研究.微生物平板培養(yǎng)技術(shù)是一種傳統(tǒng)的根際微生物研究方法[39].該法能大概估計(jì)土壤微生物的種類、數(shù)量和分布,但是,不能夠?qū)?yōu)勢(shì)物種做進(jìn)一步的鑒定,難以開展系統(tǒng)發(fā)育的分析.此外,培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的改變會(huì)對(duì)微生物形成選擇性,且約99%以上的根際微生物不可培養(yǎng)[40].Biolog 氧化還原技術(shù)是以群落水平的碳源利用類型為基礎(chǔ),為研究根際土壤微生物功能多樣性提供了一種簡單而快速的方法[41?42].然而,源于不同微生物對(duì)同一碳源的利用不同,碳源的代謝指紋差異不能單純地歸因微生物群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的差異,即代謝多樣性不一定真實(shí)地反映整個(gè)根際微生物群落功能的多樣性[43].而將微生物群落結(jié)構(gòu)與其環(huán)境活性相關(guān)聯(lián)的磷脂脂肪酸-穩(wěn)定同位素探測(cè)(PLFA-SIP)的方法,可以獲取根際微生物多樣性更全面的信息[44?46].雖然這些方法克服了微生物培養(yǎng)技術(shù)的一些局限性,但是它們實(shí)現(xiàn)不了對(duì)根際微生物多樣性更為精細(xì)的解析.

    隨后,分子生物學(xué)技術(shù)在根際微生物研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用.1979年,F(xiàn)ischer 和Lerman 最先提出了變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù),用于測(cè)定DNA 突變[47],并于1993年用于首次研究微生物群落結(jié)構(gòu)[48].與DGGE 具有相似原理的溫度梯度凝膠電泳(TGGE),利用溫度梯度替代化學(xué)變性劑,也在微生物領(lǐng)域逐漸被應(yīng)用.DGGE/TGGE 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可重現(xiàn)性高、操作簡單等,但對(duì)無熒光標(biāo)記的DNA 不敏感,且只能分析微生物群落中數(shù)量超過1%的優(yōu)勢(shì)種群.末端限制性片段長度多態(tài)性(TRFLP)方法用來確定所選DNA 片段的長度多態(tài)性,并分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[49],在根際微生態(tài)研究方面的應(yīng)用越來越普遍.但是,T-RFLP 法也存在很多潛在的缺陷,例如:單個(gè)峰包羅多個(gè)物種、單個(gè)物種分布在多個(gè)峰、物種和峰的隨機(jī)錯(cuò)誤匹配等等.DAN 測(cè)序Sanger 技術(shù),具有讀長長和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn),也曾是根際微生物較為有效的鑒定方法[50].盡管根際中觀察到的微生物差異和數(shù)量是巨大的,但尚缺乏有關(guān)其結(jié)構(gòu)與功能多樣性的詳細(xì)信息.傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)方法逐漸被高速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)取代.

    2 根際科學(xué)研究中組學(xué)方法的機(jī)遇與挑戰(zhàn)(Opportunities and challenges of omics technology in rhizosphere science)

    鑒于根際的異質(zhì)性和復(fù)雜性,根際化學(xué)與生物多樣性及其耦合關(guān)聯(lián)性的研究要求采用先進(jìn)的技術(shù).新興的技術(shù)需要同時(shí)滿足靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好,高時(shí)空分辨率、大動(dòng)態(tài)范圍和高通量等要求[51].最近,代謝組學(xué)、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)以及幾者整合的多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展拓展了根際科學(xué)研究的新方向,全方位、多層次提供植物根系分泌的動(dòng)態(tài)變化特征和根際微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的詳細(xì)信息,能夠深入研究復(fù)雜的根際化學(xué)和微生物多樣性,有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關(guān)鍵過程與機(jī)制[52?55].根際科學(xué)中組學(xué)的研究方法、主要技術(shù)與平臺(tái)、研究內(nèi)容等匯總見表2.

    表2 組學(xué)方法在根際科學(xué)研究中的匯總Table 2 Summary of the omics analysis in the study of rhizosphere science

    2.1 根際科學(xué)中代謝組學(xué)研究

    代謝組學(xué)研究策略中最實(shí)用的方法之一是代謝全譜的分析.它以組學(xué)的視角無偏向性地大規(guī)模檢測(cè)分析所有的小分子代謝物,并采用生物信息學(xué)手段旨在發(fā)現(xiàn)整體代謝網(wǎng)絡(luò)特征和涉及的代謝物變化特征,提升對(duì)基因、蛋白質(zhì)和植物代謝之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)[56?57].代謝組學(xué)分析往往需要多個(gè)生物學(xué)重復(fù),代謝物的提取、富集和去除雜質(zhì)等樣品前處理是關(guān)鍵.樣本的前處理方法包括液-液萃取、固相萃取、加速溶劑萃取、超臨界流體萃取、微波輔助萃取等[29].根和根際群落成員之間的相互作用主要是通過化學(xué)通訊來實(shí)現(xiàn)的,根際代謝組學(xué)有助于更好地理解這種化學(xué)對(duì)話[58].根際代謝組學(xué)聚焦于分析根-土壤界面的整個(gè)代謝組[24],即側(cè)重于研究參與化學(xué)信號(hào)傳遞的初級(jí)代謝產(chǎn)物和植物天然產(chǎn)物以及與根系相關(guān)的微生物類群的分泌物.

    GC-MS、LC-MS 以及NMR 是分析根際代謝組最為常用的技術(shù),且GC-MS 和LC-MS 比NMR 更為靈敏[59?61].當(dāng)前代謝組學(xué)研究對(duì)象面向微量化、復(fù)雜化及規(guī)?;虼素酱l(fā)展更為高端的分析技術(shù).相比于低分辨質(zhì)譜,高分辨質(zhì)譜因具有高靈敏度、高分辨率和精度、寬動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì)逐漸成為組學(xué)研究不可或缺的工具[24].高分辨質(zhì)譜提供化合物精確的質(zhì)量數(shù),能夠區(qū)分復(fù)雜背景中的雜質(zhì)及共流出物,降低了對(duì)樣品前處理的要求.此外,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)可以推測(cè)未知化合物的元素組成,為高通量篩選提供了線索.通過氣相/液相色譜與高分辨質(zhì)譜的聯(lián)用的技術(shù)平臺(tái)靶向和非靶向可以鑒定根際盡可能多的代謝物[62].氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)可用于快速,高靈敏度地檢測(cè)植物根系大量代謝物小分子[63?64].應(yīng)用GC-TOF-MS,Luo 等[56]分析了生態(tài)型東南景天根系分泌物的代謝譜,共檢測(cè)出15 種潛在的生物標(biāo)志物,具體包括有機(jī)酸、氨基酸、醇類、脂肪酸、酚類等組分.Zhao 等[65]通過氫核磁共振譜1H-NMR 結(jié)合GC-MS 的非靶向代謝組學(xué)分析,研究了水培體系中黃瓜幼苗植株對(duì)納米銅的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)納米銅引發(fā)了黃瓜葉片和根系分泌物的代謝變化,成功地識(shí)別了納米粒子誘導(dǎo)的生理反應(yīng).植物提取物中大部分代謝物都難揮發(fā)[66],不能采用GC 進(jìn)行直接分析,而是需要將其轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性較小,揮發(fā)性更高的衍生物[62].而LC/MS 無需衍生,可以直接對(duì)代謝物進(jìn)行代謝譜檢測(cè),是分析代謝物變異和生物代謝途徑的理想平臺(tái)[67].為了探索模式植物擬南芥根系分泌物的化學(xué)組分,Strehmel 等[68]開發(fā)了一種根系分泌代謝物的非靶向分析流程,以UPLC-ESI-QTOF/MS 為分析手段,共檢測(cè)到100 多種代謝物,分類表征了90 種化合物的結(jié)構(gòu),其中42 種通過了已知化合物標(biāo)準(zhǔn)品的印證.Marti 等[69]基于UPLC-TOF-MS 的代謝組學(xué)方法評(píng)估了斜紋夜蛾侵染的玉米幼苗葉片、汁液、根系和根系分泌物的變化,鑒定出32 種差異代謝物,并通過微流核磁共振(CapNMR)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,通過高通量直接納米注入串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)方法對(duì)9 種化合物進(jìn)行了量化,研究表明食草動(dòng)物的攻擊會(huì)導(dǎo)致植物代謝物的誘導(dǎo),這些代謝物對(duì)葉和根中的食草動(dòng)物抗性具有不同的影響.采用HPLC、離子色譜結(jié)合GCTOF-MS,Carvalhais 等[70]分析了玉米根系分泌物中的氨基酸、有機(jī)酸和糖類,發(fā)現(xiàn)缺乏某些養(yǎng)分時(shí)根際代謝物的形態(tài)發(fā)生了定性和定量的變化,并且代謝物的分泌模式與土壤中養(yǎng)分的擴(kuò)散特性存在聯(lián)系.類似地,當(dāng)植物葉片暴露于納米二氧化硅(SiO2NPs)時(shí),Tian 等[71]觀察到根際代謝產(chǎn)物譜發(fā)生了顯著變化,幾種代謝物糖和糖醇、脂肪酸、少量有機(jī)酸包括的相對(duì)豐度顯著增加;且氨基酸水平顯著下降,表明根際碳氮庫發(fā)生了變化.結(jié)合其他學(xué)者的多個(gè)研究[72?75]證實(shí)根際代謝組可以深入揭示生物體中污染物解毒的分子響應(yīng)機(jī)制.

    傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)擁有超高的準(zhǔn)確度、分辨率和超低的樣品處理要求[76].能夠進(jìn)行非靶標(biāo)代謝分析.FT-ICR-MS 可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的單個(gè)化學(xué)組分,通過內(nèi)部校準(zhǔn)來達(dá)成相對(duì)定量,它還可以根據(jù)精確的質(zhì)量數(shù)確定根際代謝物所屬的類別,是鑒定根際化學(xué)分子組成最有前途的分析技術(shù)之一[77].結(jié)合正、負(fù)離子模式,Miao 等[16]首次利用FT-ICR-MS 表征了植物根系分泌物的分子組成,共檢測(cè)出8000 余種分子,研究發(fā)現(xiàn)與土壤DOM 相比,根系分泌物含有更多的蛋白質(zhì)類、脂肪類和碳水類化合物,而木質(zhì)素類化合物含量較少.Kaplan 等人[78]采用FT-ICR-MS 比較了濕地中植物根際土壤和本體土壤可溶性有機(jī)質(zhì)組成,發(fā)現(xiàn)根際含有一些在非根際土壤中未鑒定的有機(jī)分子,且根際有機(jī)質(zhì)分子通常具有更大的分子量,更少的芳香性,更多的羧酸鹽和含氮COO 官能團(tuán)以及更大的親水性,表明不僅根際有機(jī)質(zhì)的數(shù)量,而且其分子特征可能在一定程度上導(dǎo)致濕地中污染物的固定化增強(qiáng),為污染濕地長期管理提供了啟示.目前,F(xiàn)T-ICR-MS 易實(shí)現(xiàn)幾十萬甚至上百萬的分辨率,以及亞ppm 級(jí)的質(zhì)量準(zhǔn)確度[79],提供可靠的元素組成和分子式信息,已成為研究根際中復(fù)雜化學(xué)組分的優(yōu)選方法[80].然而,沒有任何單一的分析方法或儀器組合能夠覆蓋給定樣本的整個(gè)代謝組組成[60].在未來,擴(kuò)展代謝組覆蓋范圍的新分析技術(shù)將非常重要.最近,靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)質(zhì)譜技術(shù)與LC 或GC 相結(jié)合,為植物分泌物和微生物的非靶向代謝組學(xué)提供了當(dāng)前最佳選擇.然而,在不久的將來,離子遷移光譜質(zhì)譜法(IMS-MS)可能會(huì)成為非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的拐點(diǎn).其允許在一次運(yùn)行中檢測(cè)和表征數(shù)百種代謝物[81?82].因此,IMS-MS 代謝組學(xué)將在以前從未實(shí)現(xiàn)的時(shí)間范圍內(nèi),從非常復(fù)雜的根際中快速準(zhǔn)確地獲得代謝組學(xué)圖譜.此外,不同技術(shù)如:高分辨LC-MS 與GC-MS 和/或超高分辨FT-ICRMS 耦合起來,將有助于從復(fù)雜混合物中發(fā)現(xiàn)濃度極低的新化合物,獲取廣泛的代謝組學(xué)指紋.由此,基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的高通量的組學(xué)技術(shù)有助于更加全面地分析根際化學(xué)分子多樣性分布特征,逐漸成為根際科學(xué)的研究趨勢(shì).

    盡管如此,根際代謝組學(xué)目前仍然是一個(gè)新興領(lǐng)域,在理解根際復(fù)雜系統(tǒng)方面仍有很大的發(fā)展空間.一方面,由于根系分泌物取樣的限制、組學(xué)分析平臺(tái)的靈敏性以及相關(guān)尺度上實(shí)時(shí)追蹤分泌物的時(shí)空動(dòng)態(tài)的困難性[58],導(dǎo)致根際的代表性顯示出明顯不足.另一方面,為了準(zhǔn)確理解代謝過程中植物和微生物兩者復(fù)雜的相互作用,必須從微生物和植物以及它們相互作用的最終產(chǎn)物中獲得單獨(dú)的數(shù)據(jù).研究者們通過不同的方法對(duì)植物滲出液收集進(jìn)行了多次嘗試[83],但根際代謝組學(xué)面臨的最大挑戰(zhàn)是區(qū)分微生物和植物各自的代謝產(chǎn)物,以及它們相互作用的最終產(chǎn)物.因此,有必要對(duì)根際不同部分進(jìn)行精確取樣和優(yōu)化分析方案,以便更為精準(zhǔn)表征根際和陸生生態(tài)系統(tǒng)中植物和微生物代謝過程的綜合性質(zhì).

    2.2 根際科學(xué)中宏基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

    大多數(shù)棲息在根際區(qū)域的微生物是無法培養(yǎng)的,無從對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析.宏基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)因突破了有些微生物不可培養(yǎng)的瓶頸而顯示其優(yōu)勢(shì).它們能夠快速高效地獲取植物根際專屬微生物群落的詳細(xì)信息[84?85].隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展[86],宏基因組和轉(zhuǎn)錄組逐漸應(yīng)用于研究根際微生物群落結(jié)構(gòu)[87];推斷根際核心微生物群落[88]及其代謝潛力[89];闡釋植物-微生物相互作用[90];探討外源有毒污染物處理下的根際微生物群落表達(dá)[91].利用宏基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)對(duì)根際的研究主要集中于模式植物擬南芥[87?88]、豆類和谷物[89?91].這些研究提供了大量關(guān)于擾動(dòng)響應(yīng)以及根際群落的豐度、結(jié)構(gòu)、多樣性、空間分布和核心成員的信息,也為破譯環(huán)境中有機(jī)和無機(jī)污染物解毒、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的分子機(jī)制提供新的機(jī)遇[92].

    宏基因組也稱微生物環(huán)境基因組或元基因組,其以某一特定環(huán)境中微生物的基因組為研究對(duì)象,采用生物信息學(xué)的分析方法,研究微生物的多樣性、微生物的群落結(jié)構(gòu),探索微生物的潛在功能以及與環(huán)境之間的互作關(guān)系.利用16SrDNA 測(cè)序的宏基因組學(xué)領(lǐng)域的第一項(xiàng)重大研究表明本體土壤和根際土壤的微生物群落顯著不同,根際存在著多種特異的微生物種群[88].通過特定基因的擴(kuò)增子靶向或鳥槍測(cè)序?qū)χ参锔H、葉際或內(nèi)生圈進(jìn)行宏基因組分析,研究者們總結(jié)出寄主-微生物和微生物-微生物聯(lián)合作用共同推動(dòng)了根-土壤界面微生物的分化[87].Alzubaidy 等[93]運(yùn)用宏基因組學(xué)方法研究了紅海中紅樹林微生物群,結(jié)合454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)探討了與白骨壤相關(guān)的根際微生物群.這項(xiàng)研究首次深入了解了灰紅樹林根際土壤微生物的功能范圍和多樣性.Bhattacharyya 等[94]在他們的研究中描述了低地水稻的全基因組宏基因組測(cè)序分析,該結(jié)果篩選出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落為扁平菌、變形菌和厚壁菌.Pascual 等[95]同時(shí)利用可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的策略來探索生長在西班牙內(nèi)華達(dá)山脈國家公園的百里香根際的細(xì)菌群落,宏基因組學(xué)研究證明了居住在根際的一個(gè)小型“核心”微生物群落以及叢枝菌根真菌和其他有益微生物可以用作生物接種劑.下一代測(cè)序技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)方法的發(fā)展使科學(xué)家能夠設(shè)計(jì)策略和操作流程,以更好地了解亞基因組.Bell 等[86]進(jìn)行了一項(xiàng)針對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn),重金屬對(duì)植物的脅迫決定微生物修復(fù)的強(qiáng)度,根際叢枝菌根真菌數(shù)量取決于重金屬濃度水平[85].事實(shí)上,宏基因組學(xué)既可以通過靶向保守區(qū)域來確定群落結(jié)構(gòu),也可以使用重組DNA 的經(jīng)典技術(shù)來確定任何環(huán)境中功能基因的可用性[92].因此,它有助于量化微生物群落內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率.在植物修復(fù)過程中,一些功能未知的微生物菌株可能棲息在根際,并可能獲取新污染物降解途徑,為根際土壤中污染物去除的植物-微生物相互作用提供了見解.

    轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)注整個(gè)微生物群落中的基因表達(dá),并解釋特定環(huán)境中微生物種群的動(dòng)態(tài)功能,是研究復(fù)雜的微生物生理學(xué)、功能分析和未知的微生物群落結(jié)構(gòu)的一種有力的技術(shù).轉(zhuǎn)錄組還可以表征環(huán)境樣本的實(shí)時(shí)mRNA 表達(dá)[96],通過闡明特定轉(zhuǎn)錄基因并對(duì)植物相關(guān)微生物群落進(jìn)行功能分析,支持宏基因組學(xué)獲得的數(shù)據(jù).利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,研究人員比較了3 種不同作物:燕麥、豌豆和小麥的根際微生物群,發(fā)現(xiàn)豌豆根際比非根際中含有更多的微生物,并且微生物組表現(xiàn)出顯著不同的根際特異性[5].此外,轉(zhuǎn)錄組法能夠精確地表示復(fù)雜微生物群落中活躍表達(dá)的基因,從而剖析微生物組在特定污染環(huán)境下功能的改變,為土壤污染物轉(zhuǎn)化或降解機(jī)制提供新見解.例如:de Menezes 等[97]研究暴露于菲的土壤微生物轉(zhuǎn)錄組,觀測(cè)到雙加氧酶及與解毒和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因豐度增加.對(duì)田間生長的柳樹根際和根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序時(shí),Yergeau 等[98]發(fā)現(xiàn)與降解關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄物在污染土壤和柳樹根際中明顯富集,隨后其消減與放線菌目、紅螺旋菌目、伯克霍爾德菌目等相關(guān)[99].研究施加農(nóng)藥后玉米和大豆轉(zhuǎn)錄組時(shí),發(fā)現(xiàn)草甘膦會(huì)影響作物細(xì)胞氨基酸代謝和碳水化合物的含量[91],mRNA 豐度與阿特拉津降解活性之間存在著密切的聯(lián)系[100].轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,許多參與碳?xì)浠衔锷锝到獾幕蛟诜N植園污染土壤中表達(dá)最為豐富,說明物種間的相互作用在污染物修復(fù)中具有越來越重要的意義.宏基因組學(xué)分析代表根際中微小數(shù)量的真核生物,而轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示超過25%的真核生物能夠被讀取,這可能對(duì)受污染土壤根際的微生物功能起到重要指導(dǎo)作用[90].由此,宏基因組-轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的結(jié)合可能會(huì)解釋根際微生物群在污染場(chǎng)地根際修復(fù)中的相對(duì)有效性.

    2.3 根際科學(xué)中蛋白組學(xué)研究

    蛋白組學(xué)對(duì)給定時(shí)間直接從環(huán)境樣本中回收的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分析[101],在土壤研究方面有一定的優(yōu)勢(shì).首先,由于mRNA 和蛋白質(zhì)豐度之間的弱相關(guān)性,以及mRNA 轉(zhuǎn)錄后處理和修飾的復(fù)雜性,即使是基于核酸的方法也受到很大限制[102].其次,根際土壤中的生物過程也很復(fù)雜,不僅受到微生物的驅(qū)動(dòng),還受到生態(tài)系統(tǒng)中動(dòng)植物的驅(qū)動(dòng),擴(kuò)展土壤蛋白質(zhì)鑒定對(duì)于理解土壤生態(tài)過程和影響根際土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的環(huán)境因素至關(guān)重要[103].根際土壤蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白水平上為土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物過程提供了直接證據(jù).因此,蛋白質(zhì)組學(xué)可以作為研究根際土壤生物學(xué)的重要工具.

    蛋白組學(xué)在根際中研究中的應(yīng)用非常有限.Wang 等[104]建立了一種適用于不同土壤蛋白質(zhì)的提取方法,利用雙向凝膠電泳(2-DE)鑒定出接近1000 個(gè)具有高重現(xiàn)性的單獨(dú)斑點(diǎn),通過MALDI-TOF/TOFMS 成功識(shí)別了水稻土壤中122 種蛋白質(zhì)的189 個(gè)斑點(diǎn).對(duì)蛋白質(zhì)組解析,發(fā)現(xiàn)根際大約三分之一的蛋白質(zhì)點(diǎn)無法鑒定,且來自植物的保守蛋白構(gòu)成了根際蛋白質(zhì)組的特征分布;蛋白的功能揭示了土壤生物群落中涉及的各種代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),證實(shí)作物根際土壤中植物和微生物之間復(fù)雜的相互作用,為土壤生物學(xué)的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個(gè)范式.隨后,Wu 等[105]發(fā)展了根際土壤的比較元蛋白質(zhì)組學(xué),闡釋了糯稻連作障礙的潛在機(jī)制.根際土壤蛋白組學(xué)分析表明來源于植物和微生物的蛋白質(zhì)在根際土壤生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用.進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)根際土壤與非根際土壤中有33 個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn).Hultman 等[106]在多年凍土中鑒定出7000 種蛋白質(zhì),無論是本體土壤還是根際土壤,其微生物多樣性都遠(yuǎn)高于永久凍土;與低生長凍土相比,由于這些土壤類型中微生物的生長速率更高,散裝土壤和根際土壤中獨(dú)特蛋白質(zhì)的數(shù)量可能比永久凍土多1 個(gè)數(shù)量級(jí)[107].迄今,蛋白質(zhì)組學(xué)還被用于表征與凋落物分解相關(guān)的根際[108]、水稻根際/根組織中的甲烷諾菌[109]、作物根際[104,110]和黑塊菌[111].水稻葉際、植物地上部和根際宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析識(shí)別了約4600 種蛋白質(zhì),主要功能涉及產(chǎn)甲烷和甲烷氧化.

    同樣,根際蛋白組學(xué)也是一種相對(duì)較新的方法,它面臨著許多需要解決的經(jīng)驗(yàn)、技術(shù)、計(jì)算和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等挑戰(zhàn).根際存在高度的生物多樣性、蛋白質(zhì)冗余以及蛋白提取困難等普遍問題[112].由于生物體含有與其他許多蛋白質(zhì)相似的冗余肽,通過將蛋白質(zhì)消化成肽,其特異性喪失.這一挑戰(zhàn)將基于自下而上的蛋白組學(xué)方法簡化為一種主要用于評(píng)估相關(guān)生物群中蛋白質(zhì)變化的技術(shù).另一個(gè)值得注意的點(diǎn)是,自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)方法傾向于檢測(cè)來自高度翻譯蛋白質(zhì)的肽,如核糖體蛋白、伴侶蛋白和其他參與細(xì)胞維持的蛋白.該方法測(cè)量完整的蛋白質(zhì),可以緩解冗余問題.因此,自上而下的蛋白組學(xué)為根際研究提供了另一個(gè)直接的機(jī)遇.即可以通過更佳的蛋白質(zhì)組提取方法和分餾,降低肽的復(fù)雜性,提高蛋白質(zhì)組的覆蓋率.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)與下游代謝組學(xué)分析不兼容.一種從根際土壤中同時(shí)提取代謝物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的新方法提供了改進(jìn)的可能[113].進(jìn)一步,在線2D 分離,包括直接電噴霧到質(zhì)譜儀中的強(qiáng)陽離子交換,或高/低pH 反相的二維分離,也可以提高蛋白覆蓋率[114?115].這些附加的分離技術(shù)降低了質(zhì)量分析儀的復(fù)雜性,允許對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)的覆蓋范圍進(jìn)行更多檢測(cè).使用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)以及串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)等標(biāo)準(zhǔn)肽標(biāo)記方法不可能實(shí)現(xiàn)在一次分析中運(yùn)行多個(gè)樣本[116?117].此外,根際土壤樣品的基質(zhì)中含有豐富的腐殖酸,這阻礙了有效標(biāo)記.而無標(biāo)記樣本無法多路復(fù)用,復(fù)接超蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的首選方法是向微生物群落提供同位素標(biāo)記的底物(例如13C、15N、18O 和2H),直接為根際和/或土壤樣品中的定量蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記蛋白質(zhì)[118].

    2.4 多組學(xué)整合在根際科學(xué)中的研究

    單一組學(xué)分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)僅僅提供了單一層次的理解,而生物數(shù)據(jù)集是異構(gòu)的,因此需要多層網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)來理解交互式作用,以概述生物學(xué)機(jī)制.多組學(xué)的整合使用整體而不是簡化的生物學(xué)研究方法,在單個(gè)生物體和多生物體群落中,利用來自基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等,集成多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)集信息[119].目前,根際復(fù)雜的相互作用的研究局限于嘗試通過單一組學(xué)的方法來闡釋[120],對(duì)根際科學(xué)中多組學(xué)方法的潛力僅僅進(jìn)行了初步探討.例如:聯(lián)合DNA、mRNA 和蛋白組的多組學(xué)方法,Hultman 等[106]全面探索了永久凍土的微生物組,該研究是通過單獨(dú)處理每個(gè)組,然后整合使用比率、基因組可視化和雙標(biāo)圖來揭示所有組學(xué)的多重益處.多組學(xué)研究往往使用各種儀器直接收集和測(cè)量數(shù)據(jù),至少分子生物學(xué)的“中心法則”:即遺傳信息從DNA 到RNA 到蛋白質(zhì)的流動(dòng)仍適用,同時(shí)需要考慮多變量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量、分析和整合各組學(xué).Larsen 等[121]的研究從基因組、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、DNA 結(jié)合基序和蛋白質(zhì)組的先驗(yàn)知識(shí)與基于實(shí)驗(yàn)室的共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合,以獲得多組學(xué)關(guān)聯(lián)結(jié)果,為植物-菌根相互作用提供了一個(gè)極好的框架,用于以綜合的整體方法對(duì)各種組學(xué)進(jìn)行建模.同時(shí),基于網(wǎng)絡(luò)分析和基于聚類方法是整合多個(gè)組學(xué)研究結(jié)果最流行的方法.Bersanelli 等[122]和de Keersmaecker 等[123]分別從數(shù)學(xué)和單一微生物基因組的角度對(duì)此進(jìn)行了綜述.此外,多組學(xué)將所獲得的不同組學(xué)的信息關(guān)聯(lián),從整體研究生物系統(tǒng)對(duì)基因或環(huán)境變化的響應(yīng)網(wǎng)絡(luò),有助于對(duì)機(jī)理的全面揭示.Haas 等[124]推薦了多組學(xué)方法,詳細(xì)闡述了基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組學(xué)作為戰(zhàn)略構(gòu)建技術(shù),以了解和豐富植物的根際,利用植物細(xì)菌相互作用來改善多環(huán)芳烴(PAHs)降解,在機(jī)理闡釋的基礎(chǔ)上作者提出并描述了使用組學(xué)方法對(duì)PAHs 降解的根際微生物組進(jìn)行工程改造的前景.

    雖然,多組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中應(yīng)用前景廣闊,但新技術(shù)也面臨一些困難和需要挑戰(zhàn)的方面.首先,根際存在的大量微生物組,它們相互連接形成的微生物網(wǎng)絡(luò)不僅與植物直接相互作用,也受根系分泌組分的驅(qū)動(dòng)[125].由此,根際組學(xué)的數(shù)據(jù)體量大,數(shù)據(jù)整合異常復(fù)雜.其次,組學(xué)數(shù)據(jù)分布不規(guī)則,具有稀疏性,為確保統(tǒng)計(jì)學(xué)的有效性和可靠性,分析根際組學(xué)需要每個(gè)樣本有更多的重復(fù)[126],這給根際組學(xué)的數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)管理帶來新挑戰(zhàn).再者,組學(xué)中軟件的大批數(shù)據(jù)是可用的,但不能充分分析和挖掘,即軟件本身存在系統(tǒng)性問題,阻止了數(shù)據(jù)的有效利用.并且,傳統(tǒng)的信息數(shù)據(jù)處理算法已不能滿足大數(shù)據(jù)的處理要求.因此,多組學(xué)的大數(shù)據(jù)整合分析需要不斷地更新軟件、開發(fā)新算法和優(yōu)化新方法[120,127].總之,多組學(xué)方法還存在著前期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集與制備,中期的數(shù)據(jù)文庫系統(tǒng)的完善,后期生物學(xué)意義的闡釋等多方面的挑戰(zhàn)[128].

    3 總結(jié)和展望(Research Outlook)

    根土界面的化學(xué)反應(yīng)與生物過程復(fù)雜.根際滲出物的化學(xué)表征和量化在很大程度上是一個(gè)分析挑戰(zhàn).根際科學(xué)正在迅速向跨學(xué)科方法過渡,需要多學(xué)科領(lǐng)域的交叉合作,包括化學(xué)、生物學(xué)、生物信息學(xué)、土壤學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等.針對(duì)土壤“黑箱”,傳統(tǒng)的研究方法大大低估了根際化學(xué)和生物的多樣性及其關(guān)聯(lián).近年,組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)將會(huì)推進(jìn)根際科學(xué)的快速進(jìn)展.本文綜述了根際傳統(tǒng)的化學(xué)與微生物分析方法,并重點(diǎn)討論了新型組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中應(yīng)用進(jìn)展與挑戰(zhàn).針對(duì)目前國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀以及存在的問題,對(duì)本文作出如下總結(jié)和展望:

    (1)全面了解根際化學(xué)多樣性才能更好地理解根際界面過程.依靠光譜技術(shù)、色譜的分離手段以及傳統(tǒng)的低分辨質(zhì)譜分析方法,過去關(guān)于根系分泌物的檢測(cè)只實(shí)現(xiàn)了對(duì)有限化合物的識(shí)別與鑒定.傳統(tǒng)的研究方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法解析根際分子組成的多樣性.亟需開發(fā)和應(yīng)用先進(jìn)的采樣程序,結(jié)合高選擇性和高靈敏度的分析技術(shù),準(zhǔn)確量化根釋放的多種化合物,開發(fā)研究自然條件下根際生態(tài)的新方法,完整理解根際動(dòng)態(tài)過程.

    (2)由于微生物的數(shù)量多樣性,根際土壤代表了一個(gè)異常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng).傳統(tǒng)的根際微生物培養(yǎng)法尚不能提供有關(guān)微生物種群結(jié)構(gòu)和功能多樣性的詳細(xì)信息.典型的聚合酶鏈反應(yīng)方法,逐漸被高速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)所替代.

    (3)組學(xué)技術(shù)為根際科學(xué)的研究提供了良好的契機(jī).基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的組學(xué)方法已成為代謝物鑒定的重要手段,有助于深入揭示根際化學(xué)多樣性過程.而基于宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等組學(xué)手段是研究根際微生物多樣性的有力手段.它們能夠識(shí)別基因、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì),提供根際微生物組成及微生物組基因和蛋白的表達(dá)、功能特性等更詳細(xì)的信息,全面揭示根際微生物的多樣性.

    (4)盡管單一組學(xué)技術(shù)可以表征根際化學(xué)和生物多樣性豐富的信息,但是多組學(xué)的整合更是一種強(qiáng)有力的工具.多組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒏H微域群落結(jié)構(gòu)的不同數(shù)據(jù)集與微生物功能、表達(dá)、翻譯及最終的代謝物關(guān)聯(lián)起來,有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關(guān)鍵過程與機(jī)制.

    (5)目前多組學(xué)技術(shù)在根際科學(xué)中的研究面臨數(shù)據(jù)規(guī)模龐大、平行樣品和大數(shù)據(jù)管理復(fù)雜、軟件開發(fā)、模型構(gòu)建、算法更新等直接的挑戰(zhàn).但總得說來,根際科學(xué)為多組學(xué)方法的應(yīng)用提供了巨大的潛力.因此,應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是,未來需要開發(fā)和應(yīng)用先進(jìn)的取樣程序,發(fā)展更多的模型、框架和計(jì)算基礎(chǔ)來實(shí)現(xiàn)根際多組學(xué)的全面整合.

    猜你喜歡
    植物方法研究
    FMS與YBT相關(guān)性的實(shí)證研究
    遼代千人邑研究述論
    視錯(cuò)覺在平面設(shè)計(jì)中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    哦,不怕,不怕
    將植物穿身上
    可能是方法不對(duì)
    用對(duì)方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    植物罷工啦?
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    cao死你这个sao货| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美日韩黄片免| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片高清免费大全| 久久热在线av| 午夜成年电影在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美成狂野欧美在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 午夜福利免费观看在线| 99久久精品热视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品影院久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩欧美在线乱码| 男男h啪啪无遮挡| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产成人av激情在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久| 校园春色视频在线观看| 性欧美人与动物交配| aaaaa片日本免费| 国产成人aa在线观看| 久久久久九九精品影院| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产一区二区三区视频了| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲真实伦在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产真人三级小视频在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产看品久久| 十八禁网站免费在线| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲九九香蕉| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品 国内视频| 日韩大码丰满熟妇| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产av又大| 免费在线观看黄色视频的| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久中文字幕一级| 岛国在线免费视频观看| 1024视频免费在线观看| 久9热在线精品视频| 在线观看免费午夜福利视频| xxxwww97欧美| 日韩欧美在线二视频| 两个人看的免费小视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产欧美网| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美日韩精品网址| 久久婷婷成人综合色麻豆| 999久久久国产精品视频| 午夜福利18| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产清高在天天线| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产一区二区激情短视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品久久久久久久末码| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲人与动物交配视频| 成人国语在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 怎么达到女性高潮| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一区二区三区激情视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产1区2区3区精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲精品在线美女| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 九色成人免费人妻av| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精华国产精华精| 国产精华一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品久久电影中文字幕| 日本在线视频免费播放| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品野战在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 久热爱精品视频在线9| 悠悠久久av| 日韩欧美精品v在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 波多野结衣高清作品| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩av在线大香蕉| 制服诱惑二区| 性欧美人与动物交配| 天堂影院成人在线观看| 一级毛片精品| 亚洲专区字幕在线| 国产视频一区二区在线看| 999久久久国产精品视频| av欧美777| 波多野结衣高清作品| 亚洲无线在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 免费搜索国产男女视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人国语在线视频| 久久人妻av系列| 看黄色毛片网站| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 淫秽高清视频在线观看| 欧美zozozo另类| 欧美乱妇无乱码| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品国产亚洲在线| 午夜福利18| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美3d第一页| 午夜两性在线视频| 国产三级黄色录像| 99久久精品热视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 极品教师在线免费播放| 亚洲七黄色美女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久久国产a免费观看| 免费搜索国产男女视频| 最近在线观看免费完整版| aaaaa片日本免费| 久久人妻av系列| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲熟女毛片儿| 日本免费一区二区三区高清不卡| 在线视频色国产色| 亚洲av美国av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 丝袜人妻中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本在线视频免费播放| 欧美一级a爱片免费观看看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本免费a在线| 成人手机av| 成年免费大片在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 妹子高潮喷水视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久中文看片网| 免费观看人在逋| 香蕉国产在线看| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人亚洲精品av一区二区| 中文字幕久久专区| 手机成人av网站| 午夜福利高清视频| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中国美女看黄片| 首页视频小说图片口味搜索| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 中文资源天堂在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产成人系列免费观看| 久久中文看片网| 国产黄色小视频在线观看| 久久精品成人免费网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲 欧美一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 男女床上黄色一级片免费看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线看三级毛片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费av毛片视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 我要搜黄色片| 久久性视频一级片| 中出人妻视频一区二区| 亚洲在线自拍视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 老鸭窝网址在线观看| 在线看三级毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 男人舔奶头视频| 国产成年人精品一区二区| 日韩av在线大香蕉| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 窝窝影院91人妻| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产不卡一卡二| 国产高清有码在线观看视频 | 一本大道久久a久久精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜免费观看网址| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 麻豆一二三区av精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 两个人免费观看高清视频| 日本免费a在线| e午夜精品久久久久久久| 国产99久久九九免费精品| 国产午夜福利久久久久久| 午夜免费观看网址| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲成人久久爱视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲全国av大片| 天堂动漫精品| 十八禁人妻一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜福利在线在线| 婷婷六月久久综合丁香| a级毛片a级免费在线| 久久香蕉激情| 男女那种视频在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| av在线播放免费不卡| 日韩欧美免费精品| 成人av在线播放网站| 国产精品永久免费网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | www日本黄色视频网| 久久精品综合一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品久久久av美女十八| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线观看免费日韩欧美大片| 色av中文字幕| 又黄又粗又硬又大视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 俺也久久电影网| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲专区字幕在线| 好男人电影高清在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人影院久久av| 日本三级黄在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲 欧美一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲成人国产一区在线观看| 夜夜爽天天搞| 亚洲avbb在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线视频色国产色| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 高清在线国产一区| 国产亚洲精品av在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品久久视频播放| 日韩欧美在线二视频| 亚洲一区中文字幕在线| 美女大奶头视频| 免费观看人在逋| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产视频一区二区在线看| 久久99热这里只有精品18| 国产成人精品久久二区二区91| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品合色在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 波多野结衣巨乳人妻| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费搜索国产男女视频| 亚洲av成人精品一区久久| 老汉色∧v一级毛片| 十八禁网站免费在线| av片东京热男人的天堂| 脱女人内裤的视频| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品九九99| 99热6这里只有精品| 精品高清国产在线一区| 国产三级中文精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 久99久视频精品免费| 日日夜夜操网爽| 日韩欧美 国产精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美日韩精品网址| 国产av一区二区精品久久| 欧美黑人巨大hd| 精品久久久久久久久久久久久| 午夜两性在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久久国内视频| 亚洲第一电影网av| 欧美成人午夜精品| 岛国视频午夜一区免费看| 香蕉国产在线看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一个人免费在线观看电影 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 69av精品久久久久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久香蕉国产精品| 久久这里只有精品19| 在线观看舔阴道视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 此物有八面人人有两片| 69av精品久久久久久| 久久久久久久久免费视频了| 国产高清视频在线播放一区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成熟少妇高潮喷水视频| 黄色成人免费大全| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 色老头精品视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产麻豆成人av免费视频| 日本熟妇午夜| 黄色女人牲交| 成人av在线播放网站| 欧美乱色亚洲激情| 午夜a级毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线免费观看的www视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 白带黄色成豆腐渣| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 女人被狂操c到高潮| 国产视频一区二区在线看| 十八禁网站免费在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 麻豆成人av在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 特大巨黑吊av在线直播| 我的老师免费观看完整版| 午夜亚洲福利在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品 国内视频| 国产精品野战在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 一本一本综合久久| 国产免费男女视频| 国产精品一及| 国产97色在线日韩免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 制服丝袜大香蕉在线| 国产成人av激情在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 制服诱惑二区| 色老头精品视频在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久成人av| 精品国产亚洲在线| 我要搜黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲国产精品999在线| 欧美色视频一区免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产高清视频在线观看网站| 免费看日本二区| 午夜福利高清视频| 在线观看午夜福利视频| 国产午夜精品论理片| 免费高清视频大片| 狂野欧美激情性xxxx| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人av激情在线播放| 搡老岳熟女国产| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 男女床上黄色一级片免费看| 一a级毛片在线观看| 国产精品av久久久久免费| 国产高清videossex| 久久人人精品亚洲av| 亚洲五月婷婷丁香| 一本大道久久a久久精品| 九色成人免费人妻av| 色av中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久精品国产清高在天天线| 欧美黄色淫秽网站| 日本黄色视频三级网站网址| 国产伦人伦偷精品视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 在线视频色国产色| av福利片在线| bbb黄色大片| 国产午夜精品论理片| 男女床上黄色一级片免费看| 婷婷丁香在线五月| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中国美女看黄片| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成年版毛片免费区| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 少妇粗大呻吟视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 黄色视频不卡| 伦理电影免费视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| xxx96com| 色噜噜av男人的天堂激情| 最新在线观看一区二区三区| 老司机靠b影院| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av美国av| 日韩欧美在线二视频| 国产精品久久久av美女十八| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久国产精品影院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 宅男免费午夜| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品影院久久| 欧美日韩一级在线毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一个人免费在线观看电影 | 久久久精品大字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久久久精品吃奶| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| xxx96com| 亚洲美女视频黄频| 精品欧美一区二区三区在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美日韩一级在线毛片| 日本黄大片高清| 久久久久国内视频| 国产乱人伦免费视频| 黄频高清免费视频| netflix在线观看网站| 久久久久久久午夜电影| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜免费观看网址| www.精华液| 国产不卡一卡二| 99久久综合精品五月天人人| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费在线观看黄色视频的| 三级国产精品欧美在线观看 | 制服诱惑二区| 久久香蕉精品热| 男女视频在线观看网站免费 | 日日干狠狠操夜夜爽| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费电影在线观看免费观看| 正在播放国产对白刺激| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久伊人香网站| 国产主播在线观看一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品一区av在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 精品国产亚洲在线| 久久性视频一级片| 亚洲精品在线美女| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久性视频一级片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜免费激情av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产成人精品久久二区二区91| 搞女人的毛片| а√天堂www在线а√下载| 超碰成人久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费观看人在逋| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩欧美免费精品| 一本大道久久a久久精品| 久久中文字幕一级| 超碰成人久久| 岛国在线免费视频观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成人午夜高清在线视频| 精品福利观看| 在线观看午夜福利视频| 日本成人三级电影网站| 十八禁人妻一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日本一二三区视频观看| 精品国产亚洲在线| 好男人在线观看高清免费视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 制服诱惑二区| 久久久久久九九精品二区国产 | 悠悠久久av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久这里只有精品中国| 正在播放国产对白刺激| 欧美黑人欧美精品刺激| 一级毛片精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 搞女人的毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美成人午夜精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| ponron亚洲| 午夜老司机福利片| 午夜福利18| 精品久久久久久成人av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲全国av大片| 午夜激情福利司机影院| 最好的美女福利视频网| av福利片在线| 全区人妻精品视频| 一级作爱视频免费观看| 午夜免费成人在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品永久免费网站| 亚洲av美国av| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 757午夜福利合集在线观看| 日本a在线网址| 国产亚洲av高清不卡| 国产真实乱freesex| 精品人妻1区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美黑人精品巨大| 欧美一级a爱片免费观看看 | 免费观看精品视频网站| 91成年电影在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中亚洲国语对白在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 三级毛片av免费| 一级a爱片免费观看的视频| 国产av一区在线观看免费|