腦部外源性顆粒態(tài)污染物的識(shí)別與追蹤＊

李翔宇 黃俞銘 李林謙 陸達(dá)偉 劉 倩 江桂斌

（1.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與環(huán)境毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100085；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京，100049；3.江漢大學(xué)，武漢，430056）

近年來(lái)，流行病學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大氣污染與腦血管、高血壓等腦部疾病發(fā)生或惡化有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)[1?5].這說(shuō)明外源性污染物很可能可以進(jìn)入大腦并引發(fā)不可逆的損傷.比如，顆粒物可能誘導(dǎo)大腦中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能或產(chǎn)生毒性效應(yīng)，如Aβ 淀粉蛋白和TAU 蛋白[6?8]；顆粒物可能干擾脂質(zhì)代謝，使其發(fā)生紊亂，如升高腦血管中的膽固醇水平[9?11]；顆粒物可能影響特定基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)控生酮作用、糖基化、神經(jīng)細(xì)胞增值分化，進(jìn)而引發(fā)腦部神經(jīng)系統(tǒng)損傷[12?14]；顆粒物可能改變血管的緊張度，引起血管炎癥，促進(jìn)心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化，增加腦卒中風(fēng)險(xiǎn)[15?17].2016年，英國(guó)蘭卡斯特大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在英國(guó)曼徹斯特城的真實(shí)人體的大腦內(nèi)存在0.3—12 μg·g?1磁性Fe3O4超細(xì)顆粒物[18]，并推斷其主要來(lái)源于大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）.2022年，中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境中心劉思金研究團(tuán)隊(duì)在腦部疾病患者的腦脊液樣本中發(fā)現(xiàn)外源性超細(xì)顆粒物[19].這引起人們對(duì)PM2.5能否進(jìn)入大腦的廣泛關(guān)注.大腦不同于腎臟、脾臟、肝臟等，其具備較為嚴(yán)密的血腦屏障，可阻止大部分外源性污染物由血液進(jìn)入其內(nèi)，從而維持腦內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定.因此，關(guān)于外源性污染物（包括粒徑更小的超細(xì)顆粒物）能否進(jìn)入大腦一直存在較大的爭(zhēng)議.目前，關(guān)于外源性顆粒物入腦的潛在途徑主要包括[20?26]：1、顆粒態(tài)污染物通過(guò)嗅神經(jīng)入腦；2、顆粒態(tài)污染物與特定蛋白質(zhì)結(jié)合（如血漿載脂蛋白E），再與血腦屏障中細(xì)胞受體作用以胞飲形式進(jìn)入大腦，而不破壞血腦屏障；3、顆粒態(tài)污染物暴露進(jìn)入血液，之后破壞血腦屏障而進(jìn)入大腦.上述入腦途徑主要是基于金屬納米顆粒物的研究結(jié)果，真實(shí)環(huán)境中的顆粒態(tài)污染物成分極其復(fù)雜，既包括金屬組分，也包括大量有機(jī)組分.對(duì)于真實(shí)環(huán)境中可以入腦的污染物信息、暴露途徑、跨生物屏障轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝歸趨及生命周期等尚不清楚.隨著非靶向分析技術(shù)、暴露組學(xué)、原位成像技術(shù)和敏感的生物屏障模型等環(huán)境分析和環(huán)境毒理學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，可嘗試針對(duì)腦部外源性顆粒態(tài)污染物建立“識(shí)別-暴露-表征-追蹤” 的全流程研究路線，以厘清腦部顆粒態(tài)污染物的賦存特征，辨識(shí)具體暴露途徑，闡明代謝轉(zhuǎn)化行為機(jī)制等，進(jìn)而為研究環(huán)境污染與腦部疾病的健康危害提供科學(xué)支撐.本文圍繞腦部外源性顆粒物污染，總結(jié)提出腦部顆粒態(tài)污染物識(shí)別與追蹤的潛在研究方法.

1 腦部顆粒態(tài)污染物的非靶向識(shí)別（Non-target identification of PM in the brain）

外源性顆粒態(tài)污染物組成復(fù)雜，包括各類(lèi)無(wú)機(jī)組分和有機(jī)組分.因此，對(duì)于腦內(nèi)未知顆粒態(tài)污染物的識(shí)別可以分為無(wú)機(jī)組分和有機(jī)組分的非靶向分析.面向無(wú)機(jī)組分的非靶向分析主要采取電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)（ICP-MS）對(duì)腦部提取出的顆粒態(tài)污染物的元素組成進(jìn)行解析.其中，需要解決的一個(gè)瓶頸問(wèn)題是如何從腦部盡可能多的提取出顆粒態(tài)污染物.目前，本研究團(tuán)隊(duì)已建立適用于生物樣本中超細(xì)顆粒物提純分離方法，主要通過(guò)生物酶（核酸酶、蛋白酶）和生物堿（四甲基氫氧化銨）等在保留顆粒態(tài)污染物微觀結(jié)構(gòu)的前提下盡可能去除干擾，隨后通過(guò)超濾、離心等方法完成富集分離，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收法嚴(yán)格質(zhì)量控制[27?28].腦部顆粒態(tài)污染物提取可以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步優(yōu)化.提取出的顆粒態(tài)污染物一方面可通過(guò)消解為液態(tài)進(jìn)樣分析，進(jìn)而揭示其元素組成情況；另一方面可以在顆粒水平進(jìn)行單顆粒分析，比如通過(guò)單顆粒飛行時(shí)間電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)，甚至可以通過(guò)電子顯微學(xué)的X 射線光譜儀、激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等實(shí)現(xiàn)單顆粒原位分析.面向腦部顆粒態(tài)污染物中有機(jī)組分的非靶向分析主要采用以下分析策略：

①基于多溶劑并行提取建立針對(duì)腦部生物樣品的前處理方法，實(shí)現(xiàn)其中有機(jī)組分的無(wú)差別提取，形成適于液相/氣相分離分析的提取液.其中腦部生物樣品的提取步驟為蛋白酶孵育后加有機(jī)溶劑進(jìn)行蛋白沉淀，以釋放蛋白結(jié)合態(tài)有機(jī)物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)最大程度的提取.

② 結(jié)合二維液相色譜-高分辨質(zhì)譜和二維氣相色譜-高分辨質(zhì)譜建立腦部提取樣本中有機(jī)組分的分離與檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)提取液中有機(jī)組分之間的充分分離和不同極性有機(jī)組分的全覆蓋高靈敏檢測(cè)（非靶向分析），形成“色譜-質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)裂解/數(shù)據(jù)非依賴(lài)的二級(jí)裂解”譜圖.

③開(kāi)發(fā)腦部樣品顆粒態(tài)提取物的數(shù)據(jù)分析策略，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)、大數(shù)據(jù)分析技術(shù)，借助有機(jī)化學(xué)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，建立腦部樣品中外源性顆粒態(tài)污染物有機(jī)組分化學(xué)身份識(shí)別的方法系統(tǒng).綜上，實(shí)現(xiàn)腦部顆粒態(tài)污染物中有機(jī)/無(wú)機(jī)組分的非靶向分析，揭示腦部顆粒態(tài)污染物的賦存特征.

2 顆粒態(tài)污染物暴露途徑表征（Characterization on the exposed pathway of PM）

目前，關(guān)于PM2.5入腦的暴露途徑研究仍存在嚴(yán)峻的分析方法學(xué)挑戰(zhàn).現(xiàn)有的入腦途徑（如圖1）解析主要是基于金屬納米顆粒物（如納米銀、納米金、納米二氧化鈰）或金屬摻雜顆粒物的研究結(jié)果[25,29?31].由于生物體中貴金屬的背景含量通常較低，可以對(duì)體內(nèi)貴金屬顆粒物直接分析；對(duì)于體內(nèi)含量較高的金屬顆粒物則需通過(guò)放射性同位素標(biāo)記的方法進(jìn)行示蹤.在黑碳等顆粒物的暴露途徑研究中，主要是通過(guò)將貴金屬（如Au）或放射性同位素（如125I）修飾在顆粒物表面[32?33]，進(jìn)而通過(guò)追蹤標(biāo)記物的信號(hào)進(jìn)而解析其入腦途徑.然而，PM2.5中金銀等貴金屬含量通常很低，很難通過(guò)分析其信號(hào)解析顆粒物的入腦行為；此外，PM2.5的組成復(fù)雜，在其表面進(jìn)行穩(wěn)定修飾標(biāo)記存在技術(shù)挑戰(zhàn)[34].因此，目前針對(duì)金屬納米顆粒物、碳質(zhì)顆粒物等研究方法較難直接用于解析PM2.5的腦暴露途徑研究.

圖1 外源性顆粒物腦部污染研究示意圖[25]Fig.1 Exogenous particulate matter in the brain[25]

對(duì)PM2.5中顆粒及其附著的有機(jī)組分在可能的暴露途徑（嗅神經(jīng)和血腦屏障）上的原位分析將為解析其入腦行為提供直接證據(jù).近年來(lái)快速發(fā)展的成像技術(shù)為該研究提供了有力工具.比如，飛秒激光剝蝕系統(tǒng)（LA）可以在剝蝕大部分金屬顆粒態(tài)物質(zhì)過(guò)程中盡可能減少元素分餾和基體效應(yīng)，從而滿足后續(xù)（多接受器）電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS/MC-ICP-MS）高分辨率的元素或同位素成像分析.這將對(duì)識(shí)別真實(shí)PM2.5中金屬類(lèi)物質(zhì)在生物體的空間分布提供有效幫助.此外，基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜成像系統(tǒng)（MALDI-MSI）和電噴霧解析電離源質(zhì)譜成像系統(tǒng)（DESI-MSI）可以實(shí)現(xiàn)生物組織和細(xì)胞中元素碳（EC）和有機(jī)碳（OC）的成像分析[23]，如與高分辨質(zhì)譜（Orbitrap MS）聯(lián)用則可以實(shí)現(xiàn)PM2.5有機(jī)碳中化合物的識(shí)別篩查.電子顯微學(xué)和光學(xué)顯微技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)生物組織細(xì)胞、金屬顆粒物等微區(qū)分析.需要注意的是，上述成像技術(shù)的應(yīng)用對(duì)檢測(cè)目標(biāo)物的濃度有一定的要求，因此可能無(wú)法全部滿足實(shí)際生物腦組織樣本顆粒態(tài)污染物的表征分析.鑒于此，研究者可以構(gòu)建體內(nèi)和體外的PM2.5暴露模型（如血腦屏障模型），構(gòu)建真實(shí)PM2.5的暴露體系，進(jìn)而通過(guò)上述成像分析技術(shù)和高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)定性定量的解析PM2.5中可入腦的污染物信息、具體暴露途徑及傳輸效率等.

3 追蹤顆粒態(tài)污染物在腦部的代謝與轉(zhuǎn)化（Tracing the metabolism and transformation of PM in the Brain）

外源性顆粒態(tài)污染物暴露進(jìn)入生物體往往會(huì)經(jīng)歷吸收、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化、排出等一系列過(guò)程.然而，關(guān)于顆粒態(tài)污染物在腦部的代謝與排出效率認(rèn)識(shí)十分局限.隨著醫(yī)學(xué)理論和科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，可以嘗試針對(duì)不同醫(yī)療案例設(shè)計(jì)取樣隊(duì)列，并借助質(zhì)譜分析等技術(shù)監(jiān)測(cè)外源性顆粒態(tài)污染物入腦代謝和排出的效率.需要注意的是，在這一系列過(guò)程中，外源性顆粒態(tài)污染物自身往往會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化.比如前期研究已表明MoS2納米顆粒可在生物體發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，降解生成鉬酸根離子，進(jìn)而參加鉬酶的生物合成，影響肝臟的代謝功能[35].然而，PM2.5在體內(nèi)特別是腦部的代謝與轉(zhuǎn)化尚不明確.其主要癥結(jié)是生物基質(zhì)干擾嚴(yán)重，且在生物體內(nèi)可通過(guò)生物礦化作用等生成生物源性的超細(xì)顆粒物[18].穩(wěn)定同位素可作為示蹤PM2.5關(guān)鍵活性組分生物轉(zhuǎn)化研究的有效工具.穩(wěn)定同位素是質(zhì)子數(shù)相同、中子數(shù)不同的非放射性元素形式.由于同一元素的不同穩(wěn)定同位素之間存在一定的質(zhì)量差異，其組成可能在一些特殊的物理、化學(xué)和生物過(guò)程中發(fā)生變化，即穩(wěn)定同位素分餾.PM2.5與生物體內(nèi)源性生成的生物源性細(xì)顆粒物經(jīng)歷了不同的生成過(guò)程，因此可以根據(jù)穩(wěn)定同位素指紋分析實(shí)現(xiàn)兩者的區(qū)分，從而扣除生物源性顆粒物的干擾.另外，PM2.5細(xì)顆粒物在生物體內(nèi)發(fā)生系列生物轉(zhuǎn)化過(guò)程也可引起相關(guān)元素的穩(wěn)定同位素分餾行為，可通過(guò)穩(wěn)定同位素分析解析PM2.5中關(guān)鍵活性組分的腦部生物轉(zhuǎn)化行為并追蹤其參與的重要生命過(guò)程.需要注意的是，實(shí)際樣品同位素指紋分析對(duì)目標(biāo)組分含量有一定的要求.

對(duì)于無(wú)法滿足實(shí)際分析測(cè)試需要的情況，可以通過(guò)構(gòu)建真實(shí)PM2.5的暴露體系研究其在腦部的代謝與轉(zhuǎn)化行為研究.比如，可以在活體動(dòng)物層面開(kāi)展PM2.5暴露實(shí)驗(yàn)，研究其代謝動(dòng)力學(xué)，并對(duì)其腦部組織不同區(qū)位樣本進(jìn)行的多維表征，與初始暴露的顆粒物的結(jié)構(gòu)、形貌、化學(xué)組成進(jìn)行比對(duì)分析，基于呈現(xiàn)的差異推斷其可能的轉(zhuǎn)化行為.進(jìn)而，在分子和細(xì)胞層面具體研究可能發(fā)生的生化反應(yīng)及同位素分餾規(guī)律，基于同位素分餾規(guī)律解析指證其在活體腦部層面的轉(zhuǎn)化過(guò)程，比如，在模擬生理?xiàng)l件下，構(gòu)建肺部表面活性物質(zhì)與血漿蛋白冠包覆的PM2.5及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能涉及的重要生物化學(xué)反應(yīng)（如生物源性顆粒物（如Fe3O4）生成，pH 介導(dǎo)的解離，I 相代謝酶（細(xì)胞色素P450 酶等）介導(dǎo)的氧化還原，II 相代謝酶介導(dǎo)的配位結(jié)合，與膜運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、儲(chǔ)存蛋白等關(guān)鍵蛋白的結(jié)合，典型金屬酶的生物合成等），評(píng)估相關(guān)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，分析反應(yīng)物和生成物的同位素組成變化情況，構(gòu)建同位素分餾模型，標(biāo)定同位素分餾系數(shù)，闡明相應(yīng)反應(yīng)過(guò)程的同位素分餾機(jī)制.進(jìn)而，將之與細(xì)胞水平和活體水平細(xì)顆粒物生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的同位素分餾情況比對(duì)，以揭示目標(biāo)組分生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生的相關(guān)反應(yīng).

4 總結(jié)與展望（Conclusion and perspectives）

本文圍繞PM2.5的腦部識(shí)別與追蹤中的研究現(xiàn)狀與瓶頸問(wèn)題，提出綜合應(yīng)用非靶向分析、原位成像、同位素追蹤等技術(shù)開(kāi)展相關(guān)研究，揭示腦部外源性顆粒物的污染特征，區(qū)分腦部顆粒態(tài)物質(zhì)的生物源性與外源性，識(shí)別具體環(huán)境來(lái)源與可能的暴露途徑，追蹤其關(guān)鍵組分的生物轉(zhuǎn)化與代謝歸趨.需要注意的是，本文所描述的研究對(duì)象主要是醫(yī)院的臨床隊(duì)列，即在遵照醫(yī)學(xué)倫理要求的前提下，對(duì)醫(yī)院具體診療中可以采集到的靶器官樣本進(jìn)行系統(tǒng)分析.考慮到腦部疾病發(fā)生過(guò)程很有可能導(dǎo)致血腦屏障的破損，從而增加顆粒態(tài)污染物的暴露風(fēng)險(xiǎn).因此，未來(lái)對(duì)于健康人群隊(duì)列的腦部顆粒物的識(shí)別與追蹤方法研究非常重要.但是由于方法學(xué)的限制，目前對(duì)于健康人群體內(nèi)顆粒物的識(shí)別與追蹤仍存在極大的挑戰(zhàn).對(duì)腦部顆粒態(tài)污染物的準(zhǔn)確識(shí)別與追蹤是科學(xué)評(píng)估其腦部生物學(xué)效應(yīng)的基本前提.目前關(guān)于顆粒物在腦部的生物學(xué)效應(yīng)評(píng)估多是基于高暴露濃度的研究結(jié)果，無(wú)法準(zhǔn)確發(fā)應(yīng)真實(shí)環(huán)境中低劑量、偶發(fā)性暴露的效應(yīng)特征.

腦部顆粒態(tài)污染物的識(shí)別與追蹤研究是科學(xué)認(rèn)識(shí)顆粒物健康風(fēng)險(xiǎn)的重點(diǎn).基于準(zhǔn)確的腦部顆粒物識(shí)別與追蹤的研究結(jié)果，才能開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)可評(píng)估真實(shí)環(huán)境劑量、環(huán)境暴露的敏感毒理學(xué)模型等，這也是未來(lái)厘清顆粒物腦部生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵.為此，未來(lái)在以下幾個(gè)方面有待開(kāi)展更多的研究：第一，繼續(xù)圍繞臨床隊(duì)列開(kāi)發(fā)更廣譜的非靶向識(shí)別技術(shù).比如提高質(zhì)譜電離效率，豐富二級(jí)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)等；第二，需要針對(duì)生物樣本建立高空間分辨的原位成像技術(shù)；第三，開(kāi)發(fā)適用于健康人群隊(duì)列腦部外源性顆粒物的識(shí)別與追蹤方法.比如，優(yōu)化的生物電成像技術(shù)，有效的顆粒物標(biāo)志物.第四，開(kāi)發(fā)更靈敏、更真實(shí)的毒理學(xué)模型.第五，需要進(jìn)一步結(jié)合人工智能技術(shù)，如完善腦部外源性顆粒物化學(xué)指紋信息及生化反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù).