基因工程菌在石油污染修復(fù)中的研究進(jìn)展與前景＊

宮兆波 郭瑛瑛 張燕萍 楊永霞 趙增義 劉艷偉 史 斌 畢 磊 陰永光 宋茂勇

（1.中國(guó)石油新疆油田分公司實(shí)驗(yàn)檢測(cè)研究院，克拉瑪依，834000；2.新疆維吾爾自治區(qū)油氣田環(huán)保節(jié)能工程研究中心，克拉瑪依，834000；3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境納米技術(shù)與健康效應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，北京，100085；4.中國(guó)石油新疆油田分公司質(zhì)量安全環(huán)保處，克拉瑪依，834000）

在石油開采、加工、運(yùn)輸和使用等環(huán)節(jié)，石油污染物會(huì)發(fā)生泄露和排放，造成環(huán)境污染問(wèn)題.石油污染物種類復(fù)雜，烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴是含量最高的組分[1].芳香烴主要包括苯系物（benzene，ethylbenzene，toluene and xylene，BTEX）和多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），具有高毒性和環(huán)境持久性，危害人類健康和生態(tài)系統(tǒng)[2?3].

相較于物理和化學(xué)修復(fù)，生物修復(fù)更為環(huán)境友好，經(jīng)濟(jì)成本較低，而微生物可降解大多數(shù)脂肪族和芳香化合物，是最有效的生物修復(fù)方法[3?4].不同石油組分的生物可降解程度依次為：正構(gòu)烷烴＞支鏈烷烴＞支鏈烯烴＞低分子量正烷基芳烴＞單環(huán)芳烴＞環(huán)烷烴＞多環(huán)芳烴＞瀝青質(zhì)[5].目前，關(guān)于烷烴和芳香化合物微生物降解過(guò)程的研究最多.但是，石油污染的微生物修復(fù)仍存在諸多問(wèn)題和挑戰(zhàn).首先，微生物生存能力受環(huán)境影響較大，實(shí)驗(yàn)室條件下降解效果良好的菌株在實(shí)際環(huán)境中的活性可能下降，或者環(huán)境中污染物的濃度不能誘導(dǎo)代謝基因的表達(dá)[6?7]；其次，石油污染物組成復(fù)雜，多數(shù)微生物只能降解特定組分，很難實(shí)現(xiàn)多種石油烴組分的完全降解[7?8]；另外，石油污染物的親脂性使其生物可利用性低，制約微生物的吸收和利用；最后，外源菌的引入可能影響土壤微生態(tài)平衡，且可能發(fā)生基因的水平遷移，存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

通過(guò)分子生物學(xué)手段改造微生物代謝通路是修復(fù)石油污染的重要發(fā)展方向，構(gòu)建基因工程菌（genetically engineered microorganisms，GEMs）為提高微生物的存活率、增強(qiáng)降解能力以及減少微生物修復(fù)的環(huán)境影響提供了解決方法.理論上，通過(guò)代謝調(diào)控可以設(shè)計(jì)出降解效率更高和環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)的工程菌.本文概述了微生物降解石油污染物的代謝通路和遺傳調(diào)控機(jī)制，綜述了石油污染物降解基因工程菌的主要改造策略和應(yīng)用，并展望了基因工程菌在石油污染修復(fù)的研究和發(fā)展趨勢(shì).

1 石油污染物的微生物代謝途徑（Microbial metabolic pathways of petroleum hydrocarbon pollutants）

1.1 微生物降解石油污染物的主要途徑

石油污染物的降解途徑包括有氧和缺氧降解途徑.有氧條件下，氧氣作為最終電子受體和底物參與脂肪族化合物的碳鏈和芳香族化合物的芳環(huán)活化；在缺氧條件下，硝酸鹽、硫酸鹽、Mn（Ⅳ）、Fe（Ⅲ）和CO2等作為最終電子受體，參與PAHs 的生物降解[9?10].好氧降解微生物種類繁多，降解速率較快，不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，因此石油污染物的微生物降解研究多集中在有氧降解[11].PAHs 分為低分子量多環(huán)芳烴（low molecular weight PAHs，LMW-PAHs）和高分子量多環(huán)芳烴（high molecular weight PAHs，HMW-PAHs）.一些脂肪族化合物和LMW-PAHs 可作為微生物的唯一碳源和能源，直接被微生物利用；但是苯并[α]芘等較難降解污染物需要與其他有機(jī)物共代謝進(jìn)行降解，LMW-PAHs 也可為HMWPAHs 的共代謝提供碳源和能量[12?13].一些微生物可以同時(shí)降解脂肪族化合物和芳香化合物，也有一些只能降解脂肪族化合物；某些細(xì)菌對(duì)某個(gè)化合物可能只有一種代謝通路，也可能有多種代謝通路[14].

微生物對(duì)石油污染物的主要降解途徑如圖1 所示.對(duì)于烷烴，微生物在單加氧酶作用下將氧原子加入烷烴末端或亞末端生成醇類化合物，其中1-烷醇在脫氫酶作用下逐步生成醛和酸，再經(jīng)β-氧化進(jìn)入三羧酸循環(huán)[1,15?16].另外，烷烴也可在雙加氧酶作用下生成過(guò)氧化物，再逐步反應(yīng)進(jìn)入三羧酸循環(huán)，即Finnerty 途徑[1,16].其中，烷烴羥化酶可分為降解C1—C4的甲烷單加氧酶類、降解C5—C16的非血紅素鐵膜整合蛋白和細(xì)胞色素P450 酶（cytochrome P450 enzyme system,CYP450）、以及降解C17及更長(zhǎng)碳鏈烷烴的酶系統(tǒng)[17].BTEX 和PAHs 的細(xì)菌降解過(guò)程非常復(fù)雜，涉及非常多的代謝產(chǎn)物和酶.比如，分枝桿菌屬的MyobacteriumvanbaaleniiPYR-1 是第一株分離的可降解HMW-PAHs 的菌株，蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)160 種蛋白可能參與PAHs 的降解，降解過(guò)程涉及183 個(gè)代謝產(chǎn)物和224 個(gè)化學(xué)反應(yīng)[18].其中，環(huán)羥基化雙加氧酶在芳香烴降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2,5,17]，該類酶催化兩個(gè)氧原子加入PAHs 的芳環(huán)中，再發(fā)生羥基化和芳環(huán)斷裂生成順式-二氫二醇，該中間產(chǎn)物在脫氫酶和加氧酶等作用下繼續(xù)發(fā)生芳環(huán)斷裂，生成鄰苯二酚、苯醌和龍膽酸鹽等中間產(chǎn)物[19].甲苯和二甲苯則在加氧酶作用下經(jīng)苯甲酸等中間產(chǎn)物生成鄰苯二酚[15].作為常見(jiàn)的中間產(chǎn)物，鄰苯二酚在鄰苯二酚雙加氧酶作用下發(fā)生芳環(huán)的徹底斷裂，其產(chǎn)物通過(guò)進(jìn)一步代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)[9,19].此外，單加氧酶也可以介導(dǎo)單環(huán)芳烴和多環(huán)芳烴的微生物降解.

圖1 石油污染物的主要微生物降解途徑Fig.1 The major microbial degradation pathways for petroleum pollutants

真菌可通過(guò)細(xì)胞色素P450 酶的胞內(nèi)降解途徑和木質(zhì)素降解酶的胞外降解途徑參與石油污染物降解[20].細(xì)胞色素P450 酶是一種單加氧酶，參與芳環(huán)的斷裂；木質(zhì)素降解酶可將PAHs 轉(zhuǎn)化為醌類化合物，然后發(fā)生加氫、脫水等反應(yīng)[12,20].木質(zhì)素降解酶包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、依靠錳的過(guò)氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）和漆酶，這些酶在真菌體內(nèi)合成后，分泌至胞外降解污染物.其中，LiP 和MnP 對(duì)污染物的降解需要H2O2的參與，漆酶對(duì)PAHs 的降解無(wú)需H2O2和其他輔因子的參與.

1.2 石油污染物降解相關(guān)基因

石油污染物降解的基因表達(dá)包括誘導(dǎo)型和組成型，以操作子單元或者獨(dú)立的基因位于質(zhì)?；蛘呷旧w上，并涉及石油污染物轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和調(diào)控等過(guò)程[15].位于質(zhì)粒上的PAH 降解基因包括nah、ndo、dox、nag和phn，位于染色體上的PAH 降解基因包括pah、nah、phd和nid等[21].

目前發(fā)現(xiàn)的石油污染物降解質(zhì)粒主要包括含烷烴降解基因的質(zhì)粒（如OCT 質(zhì)粒）、含萘和水楊酸降解基因的質(zhì)粒（如NAH 質(zhì)粒）以及甲苯和二甲苯降解相關(guān)的質(zhì)粒（如TOL 質(zhì)粒）[15].OCT 質(zhì)粒的alkBFGHJKL基因簇編碼烷烴降解的烷烴羥化酶、單加氧酶、外膜蛋白、醇脫氫酶和醛脫氫酶等；TOL 質(zhì)粒的xylCAB基因介導(dǎo)甲苯生成苯甲酸的過(guò)程，而生成鄰苯二酚的相關(guān)基因在質(zhì)粒和染色體上均有發(fā)現(xiàn)；NAH 質(zhì)粒是一類含有兩個(gè)操縱子的高度保守質(zhì)粒，其中操縱子（nahAaAbAcAdBFCED）與芳香烴（如萘、蒽和菲）轉(zhuǎn)化為水楊酸的反應(yīng)有關(guān)，下游操縱子（nahGTHINLOMKJ）則介導(dǎo)水楊酸生成乙醛和丙酮酸的過(guò)程[15].石油污染物降解菌的代謝酶和操縱子可以被特定底物或中間產(chǎn)物誘導(dǎo)，AraC/XylS、LysR、IclR 和XylR 等蛋白家族可以調(diào)控芳香化合物降解相關(guān)的基因或者操縱子的轉(zhuǎn)錄[19].

2 石油污染物降解微生物的基因改造策略（Construction strategies of GEMs used for degradation of petroleum pollutants）

隨著對(duì)微生物降解路徑和調(diào)控系統(tǒng)的挖掘，目前已經(jīng)構(gòu)建了多種可降解石油污染物的基因工程菌，主要基因改造策略包括增強(qiáng)宿主菌的環(huán)境適應(yīng)能力、增加微生物可利用底物范圍、提高微生物降解效率以及實(shí)現(xiàn)高選擇性的底物轉(zhuǎn)化途徑，一些基因改造策略如圖2 所示.

圖2 石油污染物降解微生物的主要改造策略Fig.2 Major genetic modification strategies of petroleum pollutant degradation in microorganisms

2.1 宿主菌的選擇與改造

污染物降解的基因工程菌多采用基因序列已知和代謝網(wǎng)絡(luò)研究較為透徹的模式生物，如大腸桿菌和假單胞菌[22].大腸桿菌具有廣泛的遺傳操作工具，是合成生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的底盤生物.惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）的環(huán)境耐受能力強(qiáng)，新陳代謝多樣，營(yíng)養(yǎng)需求較低，是環(huán)境修復(fù)的模式菌株.目前已發(fā)展了該菌的合成基因回路用于啟動(dòng)子基因設(shè)計(jì)和降解基因表達(dá)[23?24].其中，高效降解PAHs 的PseudomonasputidaB6-2 的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)已發(fā)表[25]，該菌株存在苯甲酸鹽、兒茶酚、4-羥基苯甲酸鹽和水楊酸鹽降解相關(guān)的多個(gè)基因簇，而bphABC是多環(huán)芳烴降解上游通路中的唯一基因簇[26].

為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜石油污染物的降解，底物類型多樣的微生物和環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的土著菌也是石油污染修復(fù)的重要宿主菌.降解PAHs 等污染物的睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonastestosteroni）在環(huán)境中廣泛存在，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)小，但該菌缺少功能基因表達(dá)的工具[27].Tang 等在該菌中構(gòu)建了穿梭系統(tǒng)，可用于大腸桿菌中基因回路的高效構(gòu)建以及睪丸酮叢毛單胞菌的表型測(cè)試，構(gòu)建雜合啟動(dòng)子提高基因表達(dá)強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)范圍，植入來(lái)源于噬菌體的T7 RNA 聚合酶-PT7 啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，并構(gòu)建了T7 啟動(dòng)子的隨機(jī)突變數(shù)據(jù)庫(kù)以提供強(qiáng)度范圍廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，為該菌株的基因改造提供了有效的分子工具[27].此外，研究人員構(gòu)建了可在特定環(huán)境條件下進(jìn)行石油污染物修復(fù)的基因工程菌，可滿足不同環(huán)境場(chǎng)景下的石油污染修復(fù)需求.例如，在嗜冷菌PseudomonasputidaQ5 和Pseudoalteromonas haloplanktisTAC125 中引入石油污染物降解相關(guān)的質(zhì)粒（如TOL 質(zhì)粒）或基因（如tou），可在低至0 ℃環(huán)境中降解甲苯等芳香烴[28?30].另外，石油污染、重金屬污染和放射性污染在環(huán)境中可能同時(shí)發(fā)生，復(fù)合污染問(wèn)題突出[4,31].耐輻射球菌（Deinococcusradiodurans）可還原六價(jià)鉻生成低毒的三價(jià)鉻，在該菌中異源表達(dá)甲苯降解相關(guān)的tod和xyl基因，重組菌能在高輻射環(huán)境下降解苯、甲苯和氯苯，可用于處理核生產(chǎn)廢物中鉻和有機(jī)污染物[31?32].

2.2 降解通路關(guān)鍵酶的表達(dá)與改造

對(duì)降解通路關(guān)鍵酶的調(diào)控表達(dá)和改造是提高微生物降解能力的主要策略，可以提高宿主菌的污染物降解能力以及對(duì)污染環(huán)境的耐受能力[33].在無(wú)降解能力或降解能力弱的菌株中引入相關(guān)基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)石油污染物的降解；已有降解功能的菌株添加其他污染物降解通路，增加底物類型，實(shí)現(xiàn)多種污染物的同時(shí)降解.通過(guò)對(duì)石油污染物降解通路關(guān)鍵酶基因改造而構(gòu)建的基因工程菌見(jiàn)表1.

表1 構(gòu)建的用于降解石油污染物的基因工程菌Table 1 Genetically engineered microorganisms（GEMs）designed for the degradation of petroleum pollutants

2.2.1 胞內(nèi)降解通路關(guān)鍵酶

單加氧酶和雙加氧酶是微生物降解石油污染物的關(guān)鍵酶，主要參與脂肪鏈斷鏈和芳環(huán)斷裂.在不能降解烷烴的天藍(lán)色鏈霉菌M145 菌株，過(guò)表達(dá)編碼烷烴單加氧酶的基因alkB可以實(shí)現(xiàn)正十六烷的快速降解[34].在煙草分枝桿菌異源表達(dá)來(lái)自楚布分枝桿菌的丙烯單加氧酶和乙烯單加氧酶的編碼基因，可以降解烯烴[46].將含有編碼菲雙加氧酶的phdABCD基因的外源質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中可有效降解菲[35].分枝桿菌PYR-1 可礦化蒽、熒蒽、芘、1-硝基芘、菲和苯并[a]芘，通過(guò)分析其蛋白質(zhì)表達(dá)和組成，確定其染色體上的nidA、nidB和nidD基因編碼了雙加氧酶和二氫二醇脫氫酶，將編碼雙加氧酶的基因克隆至pBAD/ThioFusion 質(zhì)粒，并在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)可以降解HMW PAHs[21].

石油污染物的降解過(guò)程產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的生成和進(jìn)一步轉(zhuǎn)化反應(yīng)也需酶的參與.如在水楊酸代謝通路，水楊酸加氧酶催化水楊酸生成鄰苯二酚.在鞘氨醇單胞菌屬的Sphingomonas yanoikuyaeB1 菌株，水楊酸加氧酶包括bphA2cA1c編碼的加氧酶、bphA3編碼的鐵氧還蛋白和bphA4編碼的鐵氧還蛋白還原酶，將bphA2cA1c基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，可使重組菌具有水楊酸加氧酶活性[37].此外，芳香烴降解進(jìn)入TCA 循環(huán)的關(guān)鍵步驟為鄰苯二酚的降解，鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（catechol 2,3-dioxygenase，C23O）是催化鄰苯二酚徹底開環(huán)裂解的關(guān)鍵酶.將編碼C23O 的基因異源表達(dá)，可增加細(xì)菌的底物利用范圍，提高芳香化合物的降解效率.不動(dòng)桿菌屬BS3 菌株可降解烷烴，但無(wú)法降解芳香烴.將惡臭假單胞菌BNF1 中編碼C23O 的基因xylE在Acinetobactersp.BS3 異源表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)該菌對(duì)烷烴和芳香烴（如氯酚、萘和菲）的同時(shí)降解[41].另外，將含有C23O 基因的泛宿主性質(zhì)粒（pRK415）引入假單胞菌CGMCC2953，重組菌株CGMCC2953-pK 完全降解菲（0.1%）的時(shí)間縮短一半[47]；將NAH7 質(zhì)粒中編碼C23O 的基因nahH，通過(guò)pUC18 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入惡臭假單胞菌和大腸桿菌可有效降解菲和芘，且惡臭假單胞菌重組菌株的降解能力較天然降解菌株有顯著提高[39?40].

2.2.2 木質(zhì)素降解酶

真菌分泌到胞外的木質(zhì)素降解酶可降解多種污染物[20].將編碼木質(zhì)素降解酶的基因異源表達(dá)，可以提高其他菌株對(duì)石油污染物的降解能力.例如，將肉色隔孢伏革菌KUC8836 編碼MnP 的基因pimp1在無(wú)法降解蒽的釀酒酵母BY4741 中異源表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)蒽的降解（降解量6.5%）[42]；將黃孢原毛平革菌中編碼MnP 的基因mnp1表達(dá)在黑曲霉中，可提高該菌對(duì)PAHs 的降解能力，在17 d 后可降解土壤中95%的菲（初始濃度：400 mg·kg?1）[43]；將朱紅栓菌的漆酶基因異源表達(dá)在深綠木霉，也可有效去除工業(yè)廢水中的酚類物質(zhì)，并降解菲和苯并[a]芘[44].

采用過(guò)表達(dá)、基因編輯和定向進(jìn)化等手段，構(gòu)建穩(wěn)定生產(chǎn)高活性木質(zhì)素降解酶的基因工程菌，再?gòu)奈⑸矬w內(nèi)提純酶應(yīng)用于石油污染修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)可行的修復(fù)策略.相較于LiP 和MnP，漆酶降解過(guò)程無(wú)需H2O2參與，在石油污染的酶修復(fù)中有更大優(yōu)勢(shì)[48].已有研究通過(guò)定向進(jìn)化獲得了可用于蒽降解的漆酶，如將嗜熱菌絲體的漆酶基因轉(zhuǎn)入到釀酒酵母，其漆酶表達(dá)提高了8 倍，酶活提高170 倍[49?50].

2.2.3 降解通路的理性設(shè)計(jì)與關(guān)鍵酶的整合

微生物代謝途徑的進(jìn)化較慢，現(xiàn)有的代謝途徑可能無(wú)法滿足實(shí)際修復(fù)需求，可通過(guò)理性設(shè)計(jì)降解通路和整合關(guān)鍵酶改變微生物的代謝途徑.間位和鄰位裂解途徑分別是甲基芳烴（如甲苯、二甲苯和甲酚）和氯代芳烴（如氯苯和氯酚）的主要降解途徑，但這兩類污染物降解也可通過(guò)另一種途徑發(fā)生一些反應(yīng)[51].因此，當(dāng)這兩類污染物同時(shí)存在時(shí)，這兩種降解途徑都被激活，影響降解效率和細(xì)菌生長(zhǎng)[51].研究將來(lái)自3 種細(xì)菌的編碼降解關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行整合，包括TOL 質(zhì)粒上編碼甲苯酸酯雙加氧酶和環(huán)己基甲酸二羥基酯脫氫酶的基因、NAH 質(zhì)粒上編碼水楊酸羥化酶以及真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌編碼4-甲基-2-烯內(nèi)酯異構(gòu)酶的基因，從而在假單胞菌B13 菌株中構(gòu)建了新的鄰位裂解途徑，實(shí)現(xiàn)了甲基芳烴和氯化芳烴在不發(fā)生間位降解途徑下的鄰位裂解[51].該重組菌株可在復(fù)雜的底泥環(huán)境中存活，并顯著降解3-氯苯甲酸鹽和4-甲苯甲酸鹽[52].

2.3 通過(guò)引入血紅蛋白合成途徑提高好氧菌活性與降解能力

氧氣含量和可利用性是土壤和水體等環(huán)境中制約微生物生存和修復(fù)效率的關(guān)鍵問(wèn)題.通過(guò)將透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscillahemoglobin，VHb）編碼基因vgb異源表達(dá)到降解菌中，生成的VHb 蛋白可傳遞氧氣分子給氧化酶和加氧酶，可有效解決修復(fù)過(guò)程中氧氣含量不足和利用效率低的問(wèn)題[53].已有研究將vgb基因在銅綠色假單胞菌中表達(dá)，重組菌在氧含量正常或偏低情況下降解苯甲酸的速率均顯著高于野生型[54?55].苯、甲苯和二甲苯為碳源時(shí)，重組菌的生長(zhǎng)速率更快；以甲苯為唯一碳源時(shí)，重組菌中代謝產(chǎn)物3-甲基鄰苯二酚的累積更明顯，表明氧化酶對(duì)苯環(huán)裂解更快速[56].

2.4 全細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)改造與優(yōu)化

石油污染物降解的代謝通路復(fù)雜，對(duì)單一關(guān)鍵酶或者通路的改造可能影響其他代謝過(guò)程，因此，需要對(duì)石油污染物降解相關(guān)的代謝通路進(jìn)行深入研究，并開展全細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)改造與優(yōu)化.例如，谷氨酸棒狀桿菌具有芳香烴降解相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝通路和調(diào)控通路等，能以苯甲酸、苯酚、苯甲醇和萘等芳香烴為碳源[57].在有氧條件下，芳香烴通過(guò)不同的周邊通路代謝生成鄰苯二酚和庚二酸鹽等中間產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)生芳環(huán)裂解，進(jìn)入中心碳代謝途徑.所以，中心碳代謝通路的調(diào)控影響芳香烴的降解，比如，敲除果糖-1,6-雙磷酸鹽酶的fbp基因?qū)е戮隉o(wú)法在芳香烴上生存[57].同時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌是生產(chǎn)多種氨基酸和維生素的重要工程菌，三羧酸循環(huán)與氨基酸（如谷氨酸和天門冬氨酸）的合成有關(guān)，而芳香烴降解的中間產(chǎn)物可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，并增加這些氨基酸的生成量[58].目前，針對(duì)石油污染物降解微生物的全細(xì)胞代謝工程改造研究很少.3,4-二羥基苯甲酸是PAHs 降解的中間產(chǎn)物[59].有研究對(duì)PseudomonasputidaKT2440 進(jìn)行多方面的代謝工程改造，使其在以葡萄糖為碳源的條件下，產(chǎn)生大量3,4-二羥基苯甲酸[60].該工作首先開發(fā)了具有不同表達(dá)強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，用于微調(diào)基因的表達(dá)；其次，采用過(guò)表達(dá)限速酶、去除負(fù)向調(diào)節(jié)因子、加強(qiáng)前體供應(yīng)以及減少途徑競(jìng)爭(zhēng)等策略促進(jìn)3,4-二羥基苯甲酸的生產(chǎn)；然后，進(jìn)一步篩選出高產(chǎn)的基因工程菌株[60].該工作為以PAHs 為碳源的微生物的代謝工程改造提供了研究思路.

另外，群體感應(yīng)系統(tǒng)被認(rèn)為是石油污染物降解的重要調(diào)控通路.在敲除銅綠色假單胞菌CGMCC1 菌株的群體感應(yīng)rhl基因后，C23O 酶活性和細(xì)菌降解芳香烴的能力顯著下降，編碼C23O 酶的基因nahH和轉(zhuǎn)錄活化子nahR的轉(zhuǎn)錄水平也受影響，而該抑制作用在添加N-丁酰同源內(nèi)酯（rhlQS 系統(tǒng)的信號(hào)分子）后有所緩解[61].赤桿菌科的CroceicoccusnaphthovoransPQ-2 中群體感應(yīng)系統(tǒng)與PAHs 降解基因（ahdA1e,xylE和xylG）和調(diào)控基因ardR成正相關(guān)[62].對(duì)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)超過(guò)11%的微生物（78 種）同時(shí)具有環(huán)羥基化雙加氧酶和群體感應(yīng)系統(tǒng)AHL/AI 信號(hào)分子合成酶的基因，并從多種環(huán)境介質(zhì)中篩選出6 種鞘氨醇菌和4 種根瘤菌，為石油污染物降解微生物的代謝改造提供了支持[63].

3 基因工程菌用于微生物菌群和植物強(qiáng)化修復(fù)石油污染（Application of GEMs for microbial consortium and plant-microbe remediation of petroleum hydrocarbon pollution）

石油污染物降解基因工程菌的構(gòu)建多采用單個(gè)降解菌株，但是單一菌株在實(shí)際環(huán)境中難以達(dá)到良好修復(fù)效果[4,62].另外，在單一菌株上過(guò)量表達(dá)質(zhì)粒上的基因會(huì)增加細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)，質(zhì)粒的兼容性和穩(wěn)定性也是影響降解效果的重要因素[22,36].相較于單一菌株修復(fù)，微生物菌群修復(fù)和植物-微生物聯(lián)合修復(fù)可以豐富污染物的代謝途徑，增加可利用底物類型，并提高微生物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力，通過(guò)優(yōu)化微生物菌群結(jié)構(gòu)以及植物和微生物的搭配，可以獲得良好代謝互補(bǔ)性，以及增強(qiáng)微生物環(huán)境適應(yīng)能力和污染物降解能力[64?66].因此，將基因工程菌結(jié)合微生物菌群、微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)是石油污染修復(fù)的重要發(fā)展方向.

3.1 微生物菌群強(qiáng)化修復(fù)石油污染

微生物菌群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，在復(fù)雜石油污染物的生物降解中更具潛力.有研究將黃孢原毛平革菌編碼LiP 和MnP 的基因分別在黑曲霉中表達(dá)并構(gòu)建了兩種基因工程菌，將其與從原油污染土壤中分離出的4 種真菌和5 種細(xì)菌一起用于土壤修復(fù)，該菌群可產(chǎn)生LiP、MnP、漆酶、過(guò)氧化物酶和雙加氧酶[67].在接種兩周后，土壤中菲、芘和苯并[α]芘（初始濃度均為333 mg·kg?1）的降解率為92%、64%和65%，降解效率高于未加GEMs 的菌群和已報(bào)道的其他微生物菌群[67].將Mycobacterium vanbaaleniiPYR-1 編碼菲雙加氧酶的基因（nidA和nidB）和AlcanivoraxborkumensisSK2 電子傳遞鏈相關(guān)的基因（fdr和fdx）在大腸桿菌中表達(dá)，得到重組菌株HY1；將PseudomonasaeruginosaPH1 編碼鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的基因加強(qiáng)表達(dá)得到重組菌株P(guān)H2.這兩種菌的聯(lián)合降解能力顯著優(yōu)于野生降解菌株P(guān)H1[64].也有研究將芳環(huán)裂解、水楊酸合成和鄰苯二酚代謝途徑分別引入到大腸桿菌BL21 菌株，得到重組菌株M1、M2 和M3，該菌群可協(xié)同參與菲的降解，21 d 降解效率達(dá)到90.66%（初始濃度：100 mg·L?1）[68].

鼠李糖脂等生物表面活性劑可提高疏水性石油污染物的生物利用性[69?71].采用微生物原位持續(xù)產(chǎn)生表面活性劑是提高污染物生物可利用性和降解菌降解效率的一個(gè)有效措施.Pseudomonas aeruginosa可產(chǎn)生鼠李糖脂，但該菌具有一定的致病性，將編碼鼠李糖脂合成的rhlABRI基因轉(zhuǎn)入沒(méi)有致病性的PseudomonasputidaKT2440 的染色體中可得到重組菌KT2440-rhlABRI，該菌雖然不能降解芘，但是可在天然土壤中存活，30 d 后重組菌和野生菌添加組芘的降解效率分別為79%和43%，即重組菌穩(wěn)定產(chǎn)生的鼠李糖脂提高了芘的溶解，進(jìn)而促進(jìn)其他微生物對(duì)芘的降解活性[38].另外，將產(chǎn)鼠李糖脂的Pseudomonasputida和上述大腸桿菌重組菌株（M1、M2 和M3）組成降解菌群，菲（初始濃度：100 mg·L?1）的7 d 降解率從61.15%提高到73.86%[68,72].

3.2 細(xì)菌與植物聯(lián)合修復(fù)用于石油污染物的降解

促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物耐受脅迫的能力并提高污染物的生物可利用性，基因改造的根際菌和植物內(nèi)生菌已用于石油污染修復(fù)研究[66].將洋蔥伯克氏菌G4 的甲苯降解質(zhì)粒pTOM 引入到羽扇豆內(nèi)生菌L.S.2.4 得到重組菌株VM1330，在根際添加該重組菌可以更好地保護(hù)植物，提高甲苯的降解量，并降低甲苯的蒸騰量進(jìn)而減輕甲苯的植物毒害作用[73].另外，將越南伯克氏菌BU61 中甲苯降解相關(guān)的pTOM-TCE 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到柳樹的根際菌Burkholderiasp.HU001 和根內(nèi)生菌Pseudomonassp.HU002，可以促進(jìn)植株地上部分的生物量，顯著降低甲苯向大氣的揮發(fā)，并且不影響柳樹對(duì)Cd 的吸收[66].將PseudomonasputidaG7 的pNAH 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物根系組織和根際的共生菌PseudomonasputidaVM1441 中，接種該重組菌后，植物和重組菌對(duì)萘的降解效率比單獨(dú)植物修復(fù)提高40%，并可提高種子發(fā)芽率和植物蒸騰作用，減少萘對(duì)植物的毒害作用[74].

4 微生物全細(xì)胞傳感器用于監(jiān)測(cè)石油污染物（Application of microbial whole-cell sensors for monitoring petroleum hydrocarbon pollution）

微生物全細(xì)胞傳感器是一種簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段，可評(píng)估污染物的生物可利用性，并反映細(xì)菌活性和環(huán)境污染物毒性.一種微生物全細(xì)胞傳感器是將含啟動(dòng)子、調(diào)控基因和報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到宿主菌，另一種是將報(bào)告基因融入到宿主菌的基因組中，在代謝基因的上游表達(dá)或者替代這些代謝基因[75].在特定污染物存在下，特異調(diào)控蛋白被激活并調(diào)控下游的報(bào)告基因發(fā)出信號(hào)，該信號(hào)強(qiáng)度與污染物的濃度存在相關(guān)關(guān)系，可用于污染物的檢測(cè)和定量分析[76].報(bào)告基因主要是細(xì)菌熒光素酶基因（lux）、綠色熒光蛋白基因（gfp）和螢火蟲熒光素酶基因（luc）.

1990年，第一個(gè)用于檢測(cè)萘的微生物全細(xì)胞傳感器被成功構(gòu)建[77].熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）5R 是從人工制氣廠環(huán)境中分離出的菌株，其中降解萘的基因位于pKAl 質(zhì)粒，其與NAH7 質(zhì)粒有同源性.將含有費(fèi)氏弧菌（vibriofischeri）的lux基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到P.fluorescens5R，通過(guò)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，得到含有l(wèi)ux基因的萘代謝質(zhì)粒pUTK21.然后，在含有萘或水楊酸環(huán)境中篩選含有該質(zhì)粒的5RL 菌株，該菌株可累積水楊酸但不能完全礦化萘，表明lux插在了編碼水楊酸羥化酶nahG基因的位置；進(jìn)而，將pUTK21 通過(guò)結(jié)合方式轉(zhuǎn)移到PseudomonasfluorescensHK9 獲得HK44 重組菌株，此菌株不能降解萘但是可以降解水楊酸.該菌可以快速響應(yīng)（15 min）萘暴露，并反映萘濃度的動(dòng)態(tài)變化，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)萘的降解活性[77].該菌株是首次應(yīng)用在美國(guó)場(chǎng)地修復(fù)的基因工程菌[78].目前，已開發(fā)10 余種基于模式菌（如大腸桿菌）和烷烴降解菌（如假單胞菌和不動(dòng)桿菌）的微生物全細(xì)胞傳感器用于烷烴檢測(cè)[75,79].例如，將調(diào)控烷烴降解酶基因表達(dá)的調(diào)控基因alkS、啟動(dòng)子PalkB和哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）的luxAB基因的融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，該傳感器可以用于烷烴檢測(cè)，但不響應(yīng)環(huán)烷烴和芳烴，其中辛烷的最低檢出濃度為24.5 nmol·L?1[79].目前，石油污染物的全細(xì)胞傳感器多采用基于質(zhì)粒的報(bào)告系統(tǒng)，存在基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn).也有研究在不動(dòng)桿菌屬的ADP1 菌株的染色體上引入可被水楊酸特異性誘導(dǎo)的報(bào)告基因luxCDABE，獲得的重組菌株AcinetobacterADPWH_lux可以響應(yīng)低至0.5–1 μmol·L?1水楊酸[80].由于水楊酸是萘的重要代謝產(chǎn)物，將萘降解的基因nahAD引入該重組菌，可以使該菌有效降解萘，并用于快速檢測(cè)天然水體和土壤中的萘[81].

面對(duì)復(fù)合污染問(wèn)題，目前已經(jīng)開發(fā)了多種微生物全細(xì)胞傳感器用于不同污染物的同時(shí)響應(yīng).如在Pseudomonasputida引入phnS-luxCDABE和merR-egfp，可同時(shí)響應(yīng)菲（0—60 mg·kg?1）和汞（0—0.24 mg·kg?1）[82].基于PseudomonasputidaN1 的菲生物傳感器BMB-PL（含nah-luxCDABE的pCMPL 質(zhì)粒）和基于Escherichiacoli的汞生物傳感器BMB-ME1（含merR-pmerT-egfp的pGEX-ME 質(zhì)粒），可用于同時(shí)測(cè)定土壤中生物可利用的菲和汞含量[83].另外，構(gòu)建的大腸桿菌DH5α 2296-gfp（含pPROBE-Tbut-RBS-gfp-npt質(zhì)粒）和DH5α 2301-cfp（含pPROBE-phn-RBS-cfp-npt質(zhì)粒）可以分別響應(yīng)BTEX 和PAHs，可用于定量1—100 μmol·L?1濃度范圍的苯系物和多環(huán)芳烴，誘導(dǎo)時(shí)間為30 min[84].另外，基于AcinetobacterbaylyiADP1 菌株開發(fā)的生物傳感器能同時(shí)檢測(cè)烷烴和烷烴的中間產(chǎn)物，可用于監(jiān)測(cè)天然烷烴的降解和外源烷烴的生物合成過(guò)程[85].

5 構(gòu)建自毀程序減少降解工程菌的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)（Construction of conditional-suicide containment systems to reduce ecological risks from engineered microorganisms）

作為外來(lái)菌種，降解菌可能與土著菌群競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而影響生態(tài)系統(tǒng)平衡；降解菌的基因也可能發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，造成基因污染.因此，微生物用于環(huán)境修復(fù)受到嚴(yán)格控制，一些地區(qū)禁止基因工程菌或者非土著菌用于生物強(qiáng)化修復(fù).目前，用于降低工程菌環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的措施包括物理性遏制、自毀遏制、營(yíng)養(yǎng)性遏制和語(yǔ)義性遏制[86].物理性遏制是將基因工程菌封閉或固定在生物反應(yīng)器，但該措施仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)；自毀遏制通常是將自殺基因及其調(diào)控通路引入到工程菌中，在特定化學(xué)或物理?xiàng)l件下誘導(dǎo)自殺基因的表達(dá)；營(yíng)養(yǎng)性遏制是指通過(guò)敲除基因構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，使菌株無(wú)法在缺乏某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下存活；語(yǔ)義性遏制是通過(guò)設(shè)計(jì)新的核苷酸、密碼子或聚合酶等來(lái)阻止工程菌和天然菌株間的遺傳信息共享[86].

目前，構(gòu)建具有自殺控制功能的基因工程菌是降低降解菌環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的常用方法[87].多篇研究構(gòu)建了針對(duì)石油烴的主動(dòng)生物防御系統(tǒng)，使細(xì)菌在芳香烴污染物濃度低時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞自殺程序，以減少外源菌的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[88?91].在該系統(tǒng)中，將xylS、lacI和Pm啟動(dòng)子融合表達(dá)，芳香烴及其衍生物降解產(chǎn)生的苯甲酸等中間產(chǎn)物可作為XylS 蛋白的效應(yīng)子來(lái)誘導(dǎo)Pm啟動(dòng)子和下游lacI基因的表達(dá)，進(jìn)而生成LacI 蛋白質(zhì)，而LacI 蛋白遏制自殺基因的表達(dá)；當(dāng)這些污染物濃度不足以誘導(dǎo)Pm和下游LacI 表達(dá)時(shí)，自殺基因的表達(dá)不受抑制，因而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[88].目前，該系統(tǒng)采用的自殺基因包括大腸桿菌編碼毒性多肽的基因gef[88,89]、φX174 噬菌體編碼裂解蛋白E 的基因[90]和親和素鏈霉菌編碼鏈霉親和素的基因stv[91].另外，將XylS 替換為XylSthr45 可以改變效應(yīng)子的特異性和親和性，從而可用于更多污染物降解過(guò)程的控制[88].但是，這些基因工程菌在土壤中死亡速率仍較慢，且基因突變會(huì)導(dǎo)致一些菌株存活.在工程菌中引入多個(gè)自殺系統(tǒng)，即通過(guò)多種靶點(diǎn)和調(diào)控通路進(jìn)一步降低工程菌的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[86].例如，研究者將gef自殺系統(tǒng)引入天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因asd缺失的突變菌株中，并在染色體上融合表達(dá)Pm啟動(dòng)子和asd基因，采用雙重自殺防御系統(tǒng)加快細(xì)菌死亡速率并減少突變體逃逸[89].

6 結(jié)論與展望（Conclusion and prospect）

微生物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)可行的石油污染修復(fù)手段，但實(shí)驗(yàn)室分離和篩選的高效降解菌株在外界環(huán)境中的存活率和降解效果常不盡如人意.而且，面對(duì)越來(lái)越復(fù)雜的環(huán)境污染問(wèn)題，微生物通過(guò)自然選擇進(jìn)化出的降解途徑難以滿足環(huán)境修復(fù)需求.因此，通過(guò)多種基因工程策略來(lái)改造微生物，可提高微生物的污染物降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力，并為環(huán)境修復(fù)提供有效解決思路.目前，基因工程菌在環(huán)境中的應(yīng)用非常有限，以下幾方面工作的開展將推動(dòng)基因工程菌在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用.

（1）提高降解菌的降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力是微生物修復(fù)的關(guān)鍵，目前研究主要圍繞污染物降解通路和關(guān)鍵酶進(jìn)行改造，欠缺全細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)改造與優(yōu)化.未來(lái)發(fā)展需結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)，繼續(xù)發(fā)現(xiàn)功能基因、降解關(guān)鍵酶、調(diào)控蛋白和降解途徑，尋找和開發(fā)更好的遺傳操作工具，采用系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)思路從底盤選擇、路徑設(shè)計(jì)和代謝優(yōu)化等方面對(duì)降解微生物進(jìn)行代謝改造.

（2）在基因工程菌的實(shí)際應(yīng)用中，基因工程菌的環(huán)境安全性是最受人們關(guān)注的問(wèn)題.目前，通過(guò)在降解微生物中引入識(shí)別元件和報(bào)告元件可監(jiān)測(cè)基因工程菌的存活狀況和污染物的降解效果，而構(gòu)建自毀程序可避免工程菌的過(guò)度繁殖和減少基因的水平轉(zhuǎn)移.未來(lái)，需結(jié)合更多物理性遏制、自毀遏制、營(yíng)養(yǎng)性遏制和語(yǔ)義性遏制等手段降低基因工程菌的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

（3）構(gòu)建基因工程菌用于降解酶和生物表面活性劑的規(guī)模生產(chǎn)，也是環(huán)境修復(fù)的重要發(fā)展方向.石油污染物的生物降解受限于污染物的生物可利用性、微生物活性和代謝酶活性等因素.生物表面活性劑可提高石油污染物的生物可利用性，酶修復(fù)則在更寬的pH 和溫度范圍下保證酶的活性和降解效果，二者的環(huán)境遷移性強(qiáng)且環(huán)境友好.構(gòu)建穩(wěn)定生產(chǎn)高活性降解酶和生物表面活性劑的基因工程菌將為石油污染的環(huán)境修復(fù)提供有效策略.

近些年，基因工程菌的構(gòu)建已經(jīng)從單個(gè)基因編輯發(fā)展為對(duì)整個(gè)微生物基因組和全細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的改造.但是，合成生物學(xué)在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用處于初始階段，隨著合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)在微生物環(huán)境修復(fù)中更廣泛的應(yīng)用，以及更多環(huán)境管理與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作的開展，基因工程菌在環(huán)境修復(fù)中展現(xiàn)良好的應(yīng)用潛力.