乳粉中沙門氏菌檢測能力驗證分析

王文潔，李 瑩

（譜尼測試集團股份有限公司，湖北武漢 430000）

微生物污染是影響食品安全的最主要因素，其中致病性細菌對食品安全構成的危害是最顯著的生物性危害[1]。食源性致病菌是以食品、水為傳播媒介引起食物中毒的致病性細菌[2]。在食品生產(chǎn)、加工、貯藏、運輸和銷售過程中，若不能采取有效的控制方法，食源性致病菌會在任何一個環(huán)節(jié)引起食品污染，從而引發(fā)食品腐敗變質，導致人類食物中毒等各種疾病，嚴重威脅人們的身體健康[3-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，食源性致病菌導致全球每年約6 億人患病，42 萬人死亡[5]。常見的食源性致病菌主要有沙門氏菌（Salmonella）、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、致瀉大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌等[6]。沙門氏菌普遍存在于自然界中，是歐盟認定的第二大常見的人畜共患病致病菌[7]，也是全球腹瀉疾病中導致人類死亡的第三大原因[8]。其主要寄生在人類和動物的腸道中，能引起發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀，對人類健康和食品加工產(chǎn)業(yè)造成嚴重損失[4，9-10]。因此，沙門氏菌的檢測需要高度重視。

檢測機構需要對實驗室進行質量控制以保證檢測結果的準確性。能力驗證是保證檢測質量的必要手段[11-12]，可以用于評估實驗室人員的技術能力，其結果直接影響到檢驗報告的準確性和質量[13-14]。能力驗證不僅可以促進實驗室發(fā)現(xiàn)問題，及時采取糾偏措施，還可以提高實驗室檢驗檢測水平[15]。因此，實驗室參加了由中國食品藥品檢定研究院組織的NIFDC-PT-323 乳粉中沙門氏菌檢驗能力驗證項目，采用國標《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）的方法對2 份樣品進行檢驗，分析總結能力驗證試驗過程及結果，以期為沙門氏菌相關檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗室收到2 份中國食品藥品檢定研究院組織的NIFDC-PT-323 乳粉中沙門氏菌檢驗能力驗證發(fā)放的待測樣品，每份樣品由1 個白色菌球和1 袋約25 g 奶粉基質組成，2 份待測樣品的編號分別為7 號和59 號。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎（Tetrathionate Broth Base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（Selenite Cystine Broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（Bismuth Sulfite Agar，BS）、木糖懶氨酸脫氧酸鹽瓊脂（Xylose Lysine Desoxycholate Agar，XLD）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（Salmonella Chromogenic Agar，SA）、營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，NA）、三糖鐵瓊脂（Triple Sugar Iron Agar，TSI）、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，均為北京路橋技術股份有限公司提供；沙門氏菌診斷血清（A-F），寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 儀器與設備

BSP-400 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；DH6000BⅡ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；SX-700 型蒸汽滅菌器，日本TOMY 公司產(chǎn)品；BSC-1604ⅡA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司產(chǎn)品。

1.4 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028），廣東省食品微生物安全工程技術研究開發(fā)中心提供。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品前處理及預增菌

在生物安全柜內開啟西林瓶，取225 mL 無菌BPW 增菌液加入到無菌均質袋中，并將西林瓶內小球加入到BPW 增菌液中，充分溶解。將對應編號的奶粉基質加入到上述BPW 增菌液中，充分均質混勻。同時，將鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）加入BPW 中作為陽性對照，不加任何物質的BPW 作為空白對照。將7 號、59 號樣品、空白對照和陽性對照均放入生化培養(yǎng)箱中，于36 ℃條件下培養(yǎng)18 h。

1.5.2 選擇性增菌

取出預增菌培養(yǎng)物，輕輕搖晃，分別吸取1 mL于10 mL TTB 和10 mL SC 選擇性增菌液中，TTB 于42 ℃條件下培養(yǎng)24 h，SC 于36 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.5.3 分離

將培養(yǎng)后的TTB 和SC 選擇性增菌培養(yǎng)物取出，混勻，分別取1 環(huán)劃線BS、XLD、SA 瓊脂平板，將BS 于36 ℃條件下培養(yǎng)48 h，XLD 和SA 于36 ℃條件下培養(yǎng)22 h。

1.5.4 生化鑒定

根據(jù)菌落特征，挑取BS、XLD、SA 瓊脂平板上的可疑菌落于NA 平板上純化，于36 ℃條件下培養(yǎng)24 h。打開沙門氏菌生化鑒定試劑盒，在試劑盒的長條槽中加入1 mL 無菌水。挑取純化的單菌落于TSI 斜面劃線，底層穿刺。同時，用接種環(huán)挑取同一單菌落至適量無菌水中，制成0.5 麥氏濁度的均一菌懸液，分別吸取200 μL 菌懸液于試劑盒的圓孔中，向賴氨酸脫羧酶和KCN 試驗孔中滴加2～3 滴液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基表面，與TSI 生化管一同于36 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，氰化鉀試驗若24 h 仍為陰性，可延長培養(yǎng)至48 h 再觀察結果。

1.5.5 血清學鑒定

將符合沙門氏菌生化現(xiàn)象的菌落進行血清凝集試驗。在無菌培養(yǎng)皿上滴加1 滴生理鹽水和沙門氏菌診斷血清（A-F），用一次性無菌接種環(huán)從NA 平板上挑取單菌落于診斷血清中輕輕混勻，觀察是否有顆粒狀的凝集現(xiàn)象。生理鹽水無凝集證明該菌落無自凝集現(xiàn)象。

2 結果與分析

2.1 預增菌與增菌結果

預增菌及增菌結果見表1。

表1 預增菌及增菌結果

由表1 可知，經(jīng)培養(yǎng)后，編號7、編號59、陽性對照的BPW 均變渾濁，空白對照保持澄清狀態(tài)。除空白對照保持澄清，編號7、編號59、陽性對照的TTB 和SC 均為渾濁狀態(tài)，且編號7 和編號59 的TTB 變黃，SC 變紅。

2.2 選擇性平板分離結果

選擇性平板分離菌落特征見表2。

表2 選擇性平板分離菌落特征

由表2 可知，陽性對照中的菌落特征均符合沙門氏菌，空白對照無菌落生長。編號為7 的樣品在BS 上呈現(xiàn)2 種菌落形態(tài)，一種為棕褐色菌落，周圍培養(yǎng)基呈棕色；另一種為灰綠色菌落，在XLD 和SA上僅呈現(xiàn)1 種菌落形態(tài)，分別為周圍培養(yǎng)基變黃的黃色菌落和藍綠色菌落。編號為59 的樣品在BS 上也呈現(xiàn)2 種菌落形態(tài)，分別為周圍培養(yǎng)基為黑色帶金屬光澤的黑色菌落和灰綠色菌落，在XLD 上為帶黑色中心的粉紅色菌落，在SA 存在2 種菌落形態(tài)分別為藍綠色菌落和紫紅色菌落。根據(jù)GB 4789.4—2016 中的表1：沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基說明書可知，7 號樣品在BS 和XLD 的菌落屬于可疑菌落，在SA 上的藍綠色菌落不屬于可疑菌落；59 號樣品在BS 和XLD 的菌落為可疑菌落，在SA 上的紫紅色菌落屬于可疑菌落。

2.3 生化鑒定結果

生化鑒定結果見表3。

表3 生化鑒定結果

經(jīng)鑒定，編號7 在BS 和XLD 上的可疑菌落（7-BS-1、7-BS-2、7-XLD-1）的生化現(xiàn)象完全相同，均為TSI 的斜面產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，賴氨酸脫羧酶陽性、氰化鉀陰性、靛基質陰性、尿素陰性，甘露醇陽性、山梨醇陽性，但ONPG試驗結果為陽性，故鑒定為非沙門氏菌。編號59 在BS、XLD、SA 上的可疑菌落（59-BS-1、59-XLD-1、59-SA-1）的生化反應現(xiàn)象為TSI 的斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S，賴氨酸脫羧酶陽性、氰化鉀陰性、靛基質陰性、尿素陰性，甘露醇陽性、山梨醇陽性、ONPG 試驗陰性，與陽性對照的結果一致，屬于典型反應，判定為沙門氏菌。

2.4 血清凝集結果

為進一步對生化鑒定結果進行確認，對所有鑒定為沙門氏菌的菌落進行血清凝集試驗。

血清鑒定結果見表4。

表4 血清鑒定結果

由表4 可知，所有菌落在生理鹽水中均不凝集，排除了菌落的自凝集現(xiàn)象，而在O 多價血清（A-F）中均凝集，與生化鑒定結果一致。

3 結論

綜合上述試驗結果，判定7 號樣品在選擇性培養(yǎng)基上的可疑菌落不屬于沙門氏菌，59 號在BS 上的周圍培養(yǎng)基為黑色，帶金屬光澤的黑色菌落、XLD 上帶黑色中心的粉紅色菌落、SA 上的紫紅色菌落為沙門氏菌。報告7 號樣品未檢出沙門氏菌，59 號樣品檢出沙門氏菌，能力驗證組織單位報告結果為滿意。通過此次能力驗證試驗，總結了以下幾點注意事項，以便指導日常檢測工作。①收到能力驗證樣品后，首先檢查樣品是否存在破損、污染、密封性不強等問題，如發(fā)現(xiàn)問題及時與機構聯(lián)系。若不能及時進行試驗，需按照作業(yè)指導書中的要求儲存樣品。②試驗所用設備應經(jīng)校準合格，且在校準期間范圍內。③在整個試驗過程中，需保證所用培養(yǎng)基、試劑、耗材的無菌狀態(tài)，可采用化學指示帶對其滅菌效果進行監(jiān)測，避免因其污染造成假陽性結果。④所用培養(yǎng)基溫度不能過高，否則會滅活樣品中的目標菌，造成樣品假陰性結果。⑤制備平板時，培養(yǎng)基溫度需適宜。若溫度過高，一方面會使對熱敏感的活性成分失活；另一方面會導致培養(yǎng)基內的水分蒸發(fā)到皿蓋內側，降低了培養(yǎng)基的濕度。而且，皿蓋上的蒸汽經(jīng)冷凝會滴落在培養(yǎng)基上，不利于單菌落的形成。若溫度過低，培養(yǎng)基會凝固成塊，不易制成平板，且培養(yǎng)基質地不均勻。⑥檢測樣品時，應按照空白對照、樣品、陽性對照的順序獨立進行試驗，防止樣品交叉污染及陽性對照污染樣品，保證結果的準確性。⑦在BS 和XLD 上，沙門氏菌呈現(xiàn)多種形態(tài)，而在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，沙門氏菌僅呈現(xiàn)紫紅色一種狀態(tài)。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基能有效區(qū)分目標菌和干擾菌，可以考慮將其作為日常沙門氏菌檢測中的首選培養(yǎng)基，從而節(jié)省人力、物力和時間成本。⑧在選擇性平板上需進行多區(qū)分離劃線，避免因菌落彌漫生長導致無法觀察完整菌落形態(tài)，從而影響后續(xù)鑒定試驗。⑨在此次試驗中發(fā)現(xiàn)SA 培養(yǎng)時間過長，平板上的菌落會由藍綠色變?yōu)樽仙?，影響結果判斷。因此，SA 的培養(yǎng)時間需嚴格按照說明書要求。⑩挑取菌落時，對于非典型但可疑的菌落，需要耐心進行后續(xù)鑒定試驗，不可輕易得出結論。對于初篩疑似陽性后續(xù)鑒定為陰性的菌落，需要挑取多個可疑菌落進行鑒定，避免樣品漏檢。?挑取的可疑菌落可以選擇先在NA 上進行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)后的菌落同時進行TSI、賴氨酸脫羧酶、氰化鉀、靛基質、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG 試驗。一方面可以避免選擇性平板對生化結果的影響，另一方面可以解決菌落量不夠接種的問題，同時縮短了試驗周期。?進行KCN 試驗時，應避免菌懸液的濃度過高，否則會導致對照孔和試驗孔均為渾濁狀態(tài)，導致KCN 假陽性結果。?整個試驗過程需在生物安全柜中進行，防止樣液外溢，避免操作人員被感染。操作結束后，對生物安全柜進行滅菌，并將培養(yǎng)物進行無害化處理，避免污染環(huán)境。?在做血清凝集試驗時，應采用生理鹽水作為對照排除菌落自凝集現(xiàn)象，避免造成血清凝集假象。

實驗室能力驗證是利用實驗室間比對來確定實驗室檢測能力的活動，是檢驗實驗室檢測水平的一項重要方式[16]。通過能力驗證，實驗室對沙門氏菌的檢測能力得到了認可，同時積累了相關檢驗經(jīng)驗，提高了技術水平，為增強實驗室綜合實力奠定了基礎。但是，此次試驗也存在一些不足之處，因為缺少相關血清，實驗室未對檢出的沙門氏菌做血清分型項目，在今后的工作中還需加強相關檢測能力。此外，實驗室僅采用一種方法對沙門氏菌進行檢測，在以后的試驗中可以采用分子檢測技術、免疫檢測技術、全自動細菌鑒定系統(tǒng)等方法與國家標準法結合[6，17]，以提高檢測質量和效率。