不同分子量牛蒡多糖的生物活性研究

王解語，滕迎弟，唐業(yè)豪，黃莉莉， 巫永華，2，張建萍，2，劉恩岐，2

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappa L.）為菊科牛蒡?qū)賰赡晟荼局参铮莻鹘y(tǒng)藥食同源的植物，多糖類是牛蒡中具有重要生理活性的物質(zhì)之一，且含量較高。對于牛蒡多糖的提取和生物活性的研究已經(jīng)有大量的報道，呂俊梅等人[1]優(yōu)化了微波法提取牛蒡多糖的工藝；唐仕榮等人[2]采用超聲波法制備了牛蒡多糖，且表明其具有一定的清除DPPH·和·OH 的能力；李玲玉等人[3]也優(yōu)化了超聲輔助提取牛蒡多糖的工藝，并對其體外和細胞內(nèi)的抗氧化活性進行了評價；張辰辰等人[4]優(yōu)化了綠色高效的動態(tài)高壓微射流工藝提取牛蒡多糖，分析表明牛蒡根多糖為呋喃型多糖，并具有較好的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·的能力；課題組也考查了雙水相[5]和閃式提取[6]制備牛蒡多糖的工藝及其抗氧化活性。但牛蒡多糖組成較為復(fù)雜，研究表明多糖的生物活性與其相對分子量大小有關(guān)[7]，Ling Shi-kuan 等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量越小的多糖，其抗氧化性越強；趙婷婷[9]也研究表明分子量對壇紫菜多糖生物活性影響很大，分子量越低其體外抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)作用越顯著。此外，李彩藝等人[10]研究雙參多糖和朱曉冉等人[11]研究黑木耳多糖時也得出相似的結(jié)論。而有關(guān)不同分子量牛蒡多糖生物活性的研究較少，采用超濾技術(shù)獲得不同分子量段的牛蒡多糖，并對其抗氧化、降血糖和膽酸鹽結(jié)合能力等生物活性進行研究，為其進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡，購自農(nóng)貿(mào)市場。

沒食子酸、蘆丁、D -半乳糖醛酸、葡萄糖、福林酚、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH），上海葉源生物科技公司提供；苯酚、無水乙醇、濃硫酸，國藥集團上海試劑公司提供。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MILLIPORE 小型切向流超濾系統(tǒng)，默克生物科技有限公司產(chǎn)品；BGZ-76 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；ALPHA1-4 LD plus 型冷凍干燥機，德國CHRIST 儀器公司產(chǎn)品；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；BioTek Synergy2 型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡多糖的制備

將鮮牛蒡根洗凈、切片，采用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的檸檬酸溶液浸泡2～3 min，撈出瀝水后，于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎后過80 目篩，冷藏備用。取一定量的牛蒡粉，加入5 倍體積的體積分數(shù)為95%的乙醇溶液浸泡2 h，重復(fù)3 次。將藥渣置于50 ℃烘箱中烘干，按料液比1∶30（g∶mL）加入純水，于85 ℃條件下提取3 h 后過濾，濾液濃縮至1/10 后加入無水乙醇至其體積分數(shù)為80%，于4 ℃條件下靜置12 h。將沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌3 次去除色素等雜質(zhì)。用去離子水完全溶解粗多糖，將Sevage 試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4）與多糖溶液按1∶4 的比例混勻，攪拌60 min 以脫除蛋白質(zhì)，多糖溶液冷凍干燥后獲得牛蒡多糖，放入自封袋中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同分子量牛蒡多糖的制備

取一定量的上述牛蒡多糖，用純水溶解后，采用MILLIPORE 小型切向流超濾系統(tǒng)，分別通過5，8，30，50，300 k 的超濾膜，在0.05 MPa 條件下超濾、濃縮、冷凍干燥，獲得不同分子量段的牛蒡多糖。

1.3.3 牛蒡多糖的生物活性研究

（1）DPPH·清除率的測定。參照姚芳等人[12]的方法，于波長517 nm 處測定吸光度，按照公式（1）計算DPPH·清除率。

式中：A1——牛蒡多糖樣品溶液與DPPH 混合液的吸光度；

A2——牛蒡多糖樣品溶液和乙醇混合液的吸光度；

A0——乙醇和DPPH 混合液的吸光度。

（2）·O2-清除率的測定。參照何芳等人[7]的鄰苯三酚自氧化法，測其于波長325 nm 處的吸光度，按照公式（2）計算·OH 清除率。

式中：A0——鄰苯三酚自氧化吸光度；

A1——加入牛蒡多糖溶液后的鄰苯三酚自氧化吸光度。

（3）α -淀粉酶抑制率的測定。參考湯陳鵬等人[13]的方法測定牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的活性，測其于波長540 nm 處的吸光度。按照公式（3）計算α -淀粉酶的抑制率。

式中：A0——純水替換牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A1——牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A2——磷酸鹽緩沖液替換α -淀粉酶溶液測定的吸光度；

A3——純和磷酸鹽緩沖液分別替換牛蒡多糖溶液和α -淀粉酶溶液測定的吸光度。

（4）α -葡萄糖苷酶抑制率的測定。參考李婧雯等人[14]的方法測定牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的活性，采用多功能酶標儀測其在405 nm 波長處的吸光度，按照公式（4）計算α -葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A——牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A1——磷酸緩沖液替換α -葡萄糖苷酶測定的吸光度；

A2——磷酸緩沖液替換牛蒡多糖測定的吸光度。

（5）體外膽酸鹽結(jié)合能力測定。參照于美匯等人[15]的方法，以甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉為標準品，測其于波長387 nm 處的吸光度，分別獲得標準曲線。再根據(jù)文獻報道的方法測定并計算牛蒡多糖對甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的結(jié)合能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量牛蒡多糖的分布

不同分子量牛蒡多糖分布見圖1。

圖1 不同分子量牛蒡多糖分布

由圖1 可知，牛蒡多糖通過不同超濾膜分離后，分子量＜5 k 的牛蒡多糖占5.24%，5～8 k 占12.13%，而＞300 k 的占22.41%，顯著高于前者，但是與30～50 k 和50～300 k 的沒有差異；分子量大于30 k 的多糖占64.17%，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖組成；試驗中同時發(fā)現(xiàn)不同分子量段的牛蒡多糖顏色也會有一定的差異，分子量越大，多糖粉末的顏色越深。

2.2 牛蒡多糖生物活性研究結(jié)果

2.2.1 牛蒡多糖的抗氧化活性

（1）DPPH·清除能力

清除DPPH 自由基的效果見圖2。

圖2 清除DPPH 自由基的效果

由圖2 可知，不同分子量段的牛蒡多糖為0.5～1.0 mg/mL 時，清除DPPH·能力隨多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，與喻俊等人[16]的研究結(jié)果相似，表明牛蒡多糖具有較好的DPPH·清除能力。根據(jù)回歸曲線計算其IC50值，其中＜5 k 組分的為0.99 mg/mL，5～8 k組分的為0.82 mg/mL，8～30 k 組分的為0.96 mg/mL，30～50 k 組分的IC50值為0.95 mg/mL，而50～300 k 和＞300 k 的組分在試驗溶度范圍內(nèi)無法計算其IC50值，但其在質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，清除率僅有40.18%和36.90%，表明分子量為5～8 k 的牛蒡多糖對DPPH·的清除率效果最好。

（2）·O2-清除能力

清除羥自由基的效果見圖3。

圖3 清除羥自由基的效果

考查樣品對·O2-的清除能力時體現(xiàn)樣品抗氧化活性的重要指標，由圖3 可知，在1.0～1.8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同分子量段的牛蒡多糖對·O2-的清除率隨牛蒡多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，并表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，結(jié)果與周濃等人[17]的報道相似。通過計算其IC50值表明，＜5 k 組分的為1.45 mg/mL，5～8 k 組分的為1.31 mg/mL，8～30 k 和30～50 k 組分的均為1.40 mg/mL，50～300 k 組分的為1.14 mg/mL，＞300 k 組分的為1.51 mg/mL，提示50～300 k 的牛蒡多糖對·O2-的清除效果最好，而＞300k 的最差。

2.2.2 牛蒡多糖降血糖活性研究

（1）α -淀粉酶的抑制效果。

抑制α -淀粉酶的效果見圖4。

圖4 抑制α -淀粉酶的效果

對α -淀粉酶的抑制能有效阻礙食品中糖類的水解、消化，從而減少機體對糖分的攝取，從而降低血糖水平[18]。由圖4 可知，在0.1～0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對α -淀粉酶的抑制率隨牛蒡多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，并呈現(xiàn)出良好的量劑關(guān)系，說明各組分都具有較好的α -淀粉酶抑制活性。通過計算其IC50值，＜5 k 組分的為0.28 mg/mL，5～8 k和8～30 k 組分的都為0.26 mg/mL，30～50 k 組分的為0.33 mg/mL，50～300 k 組分的為0.30 mg/mL，＞300 k 組分的為0.42 mg/mL，表明5～8 k 和8～30 k的牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的效果最好，而＞300 k的最差。

（2）α -葡萄糖苷酶的抑制效果。

抑制α -葡萄糖苷酶的效果見圖5。

圖5 抑制α -葡萄糖苷酶的效果

抑制α -葡萄糖苷酶的活性可以減緩葡萄糖的生成和吸收，調(diào)整血糖水平，減少高血糖對胰腺的刺激，有效預(yù)防和改善糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[19]。由圖5 可知，不同分子量段的牛蒡多糖在0.1～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對α -葡萄糖苷酶的抑制率隨牛蒡多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，表現(xiàn)出較好的抑制效果和量效關(guān)系。計算其IC50值表明，＜5 k 組分的為0.31 mg/mL，8～30 k 組分的為0.29 mg/mL，5～8 k和50～300 k 組分的都為0.25 mg/mL，30～50 k 組分的為0.32 mg/mL，＞300 k 組分的為0.36 mg/mL，可知5～8 k 和50～300 k 的牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的抑制效果最好，而＞300 k 的最差。

2.2.3 牛蒡多糖降血脂活性研究結(jié)果

（1）結(jié)合甘氨膽酸鈉能力。

結(jié)合甘氨膽酸鈉的效果見圖6。

圖6 結(jié)合甘氨膽酸鈉的效果

由圖6 可知，不同分子量段的牛蒡多糖對甘氨膽酸鈉的結(jié)合率隨牛蒡多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，且呈較好的量效關(guān)系。從各組分的IC50值來看，＜5 k組分的為4.91 mg/mL，5～8 k 組分的為3.83 mg/mL，而其中組分在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，結(jié)合率都小于50%，無法計算其IC50值。相對而言，分子量為5～8 k 的牛蒡多糖結(jié)合甘氨膽酸鈉的能力較好。

（2）結(jié)合?；悄懰徕c能力。

結(jié)合?；悄懰徕c的效果見圖7。

圖7 結(jié)合?；悄懰徕c的效果

由圖7 可知，不同分子量段的牛蒡多糖對牛磺膽酸鈉的結(jié)合率隨牛蒡多糖質(zhì)量濃度的升高而升高，表明各組分均有一定的?；悄懰徕c結(jié)合能力，并與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。從各組分的IC50值來看，5～8 k 組分的為3.23 mg/mL，＞300 k 組分的為4.53 mg/mL，其中組分在試驗最高質(zhì)量濃度下結(jié)合率都小于50%，說明5～8 k 的牛蒡多糖對?；悄懰徕c的結(jié)合效果較好。

3 結(jié)論

試驗將牛蒡使用熱水浸提法制備、醇沉后，采用不同分子量的超濾膜分離，獲得分子量＜5，5～8，8～30，30～50，50～300，＞300 k 的6 個牛蒡多糖組分。結(jié)果表明，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖組成，分子量小于8 k 的占比較少。生物活性分析表明，不同組分牛蒡多糖都表現(xiàn)出一定的生物活性，其中5～8 k 的牛蒡多糖對DPPH·和·O2-的清除能力，抑制α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶，結(jié)合甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c能力較好，提示5～8 k 的牛蒡多糖具有最好的抗氧化、降血糖和降血脂活性，進一步開發(fā)利用的價值較大。不同分子量牛蒡多糖在生物活性上的差異，可能與其結(jié)構(gòu)、含量、化學(xué)組成等有關(guān)，可對多糖的結(jié)構(gòu)、組成與多糖生物活性的關(guān)系進行進一步探討。