NCA處理對鮮切蘋果貯藏品質(zhì)的影響

楊尚山，楊 悅，尚鵬鵬，朱樹華,*，張麗麗,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)膜應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

蘋果富含多種人體必需礦物質(zhì)元素，如鉀、鋅、銅和碘[1]。鮮切蘋果具有清潔、天然、營養(yǎng)、方便等優(yōu)點(diǎn)，已成為常見且受廣大消費(fèi)者歡迎的即食生鮮食品[2]，具有廣闊的消費(fèi)前景[3]。然而，貯藏過程中發(fā)生的褐變和失水萎蔫等一系列問題限制了鮮切蘋果的應(yīng)用[4-5]。因此，科研人員一直在尋找安全和有效的方法來提高鮮切蘋果的貯藏品質(zhì)。

現(xiàn)有的鮮切蘋果保鮮方法多為薄膜保鮮，這是一種具有商業(yè)價(jià)值的實(shí)用保鮮方法[6-8]?？墒承阅づc抗褐變抑制劑聯(lián)合處理后，蘋果的呼吸速率和微生物繁殖率顯著降低，護(hù)色效果良好[9]。使用蜂膠提取物涂膜后，果蔬的硬度和表觀品質(zhì)有所提高[10]。Thivya 等[11]開發(fā)了一種含有蔥廢料提取物的海藻酸鈉/羧甲基纖維素膜，該膜可有效控制鮮切蘋果和馬鈴薯的褐變。然而，涂膜材料的毒性、不穩(wěn)定性、可持續(xù)性以及保鮮效果是鮮切果蔬涂膜保鮮中面臨的問題。除涂膜保鮮外，物理保鮮和化學(xué)保鮮方法也常應(yīng)用于鮮切水果保鮮，如基于姜黃素的光動(dòng)力處理鮮切哈密瓜[12]、低分子量巖藻依聚糖處理鮮切蘋果[13]、馬茶提取物處理鮮切蘋果[14]等。

1-亞硝基環(huán)己基乙酸酯（NCA）是一種可以提供硝?；℉NO）的?；鶃喯趸衔颷15]。HNO 是一氧化氮（NO）的單電子還原和質(zhì)子化同源物，已被證明在制藥領(lǐng)域具有獨(dú)特的藥理作用，如治療心力衰竭[16]。HNO 能與金屬蛋白、硫醇和含硫醇的蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)直接反應(yīng)，從而改變酶的活性，如對蛋白中特定半胱氨酸殘基的修飾能抑制線粒體的呼吸[17]。此外，HNO 是NO 和硫化氫（H2S）相互作用產(chǎn)生的反應(yīng)中間體，而NO 和H2S 作為信號分子參與植物的多種生理過程，并在果實(shí)采后貯藏中發(fā)揮重要作用，因此可以推斷HNO 對植物的生理過程有一定調(diào)節(jié)作用[18]。然而，關(guān)于HNO 在植物中生理作用的研究較少。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在模式植物擬南芥的活細(xì)胞中能檢測到內(nèi)源性HNO的形成，并且HNO對植物的乙烯信號通路具有一定的調(diào)節(jié)作用，且氧化還原環(huán)境的改變可引發(fā)HNO 衰變及·NO/HNO 相互轉(zhuǎn)化[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的HNO 供體處理能有效抑制西紅柿多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，減緩西紅柿亮度值和VC含量的下降，抑制果實(shí)中丙二醛含量和失重率的上升，從而延緩西紅柿的衰老[20]。基于此，本研究以NCA 為HNO 供體，探究HNO 對鮮切蘋果貯藏品質(zhì)的影響，以期為鮮切果蔬的保鮮提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

‘紅富士’蘋果：購自山東省泰安市水果批發(fā)市場，選擇無病蟲害、色澤鮮艷、無機(jī)械傷痕、大小均勻、成熟度相近的新鮮、良好的蘋果，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室5 ℃保存。

NCA，本實(shí)驗(yàn)室自制；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、濃硫酸（98.3%）、濃氨水（23%）、過氧化氫（分析純）和乙二胺四乙酸（EDTA，分析純），天津市凱通化學(xué)試劑公司；鄰苯二酚（99.5%）和2-脫氧核糖（分析純），上海麥克林生化科技公司；甲硫氨酸（≥99.0%），北京全式金生物技術(shù)有限公司；氮藍(lán)四唑（≥98.0%），蘇州亞科科技股份有限公司；核黃素（98%），上海如吉生物科技發(fā)展公司；冰乙酸、聯(lián)苯胺、硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯二酚、丙酮，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司；次氯酸鈉（NaClO，分析純），成都華融化工有限公司；2,7-二氯熒光素（分析純），廣東元泰化工有限公司；2-脫氧-D-核糖（98%），南京杜萊生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

D3024R 型高速冷凍離心機(jī)，武漢華科達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；WY015R型手持折光儀，北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司；CR-10型色差計(jì)，美國柯尼卡美能達(dá)公司；GY-4型果實(shí)硬度計(jì)，青島拓科儀器有限公司；食品級拉鏈袋（材質(zhì)為聚乙烯，長度為70 mm，寬度為50 mm，厚度為70μm），桐城市天之錦包裝有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

試驗(yàn)前，所需儀器均使用0.02% NaClO 溶液浸泡30 min以消毒滅菌，取出儀器，晾干。用去離子水洗凈5 ℃下預(yù)冷的蘋果，之后使用0.02%NaClO 浸泡3 min消毒。將蘋果表面的水分晾干，切成2～3 cm見方的蘋果塊，分別在5、10、15μmol/L NCA 溶液中浸泡5 min（以去離子水浸泡5 min 為對照（CK）），取出蘋果塊，用無菌紗布將蘋果塊表面的溶液吸干。將處理后的蘋果塊分組標(biāo)記，放入食品級拉鏈袋（每袋140 g）中并置于冰箱中5 ℃冷藏。每48 h 取1 次樣品，分組包裝并在-80 ℃下凍藏。每次測試前，將每組凍藏樣品取出，加入液氮研磨，取1 g 粉末加入試管，用于測樣。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.2.1 色差

使用色差計(jì)測定。測量前，采用標(biāo)準(zhǔn)白度進(jìn)行校準(zhǔn)測量（L*0=97.06，a*0=0.04，b*0=2.01）。隨機(jī)選取3個(gè)自封袋，每個(gè)自封袋中隨機(jī)選取3 塊蘋果，分別記錄L*（亮度）、a*（紅綠度）、b*（黃藍(lán)度）值。色差用ΔE表示，其計(jì)算公式如下：

1.2.2.2 可溶性固形物含量（SSC）

使用手持式折光計(jì)測定[21]。

1.2.2.3 硬度

使用硬度計(jì)測定，探頭直徑為11 mm，結(jié)果取其平均值。硬度單位為N/cm2。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性

在3 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g樣品粉末，提取10 min，在12 000×g條件下離心20 min，得到粗酶液。制備含13 mmol/L 蛋氨酸、63μmol/L 氮藍(lán)四唑、1.3μmol/L 核黃素和10 mmol/L EDTA的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液作為反應(yīng)溶液。取反應(yīng)液1.5 mL，暗處加酶液10μL，5 ℃陽光下照射約15 min。當(dāng)顏色發(fā)生變化后，立即停止光照，測定560 nm 處的吸光度。以不加酶溶液作為空白對照，以單位時(shí)間內(nèi)抑制氮藍(lán)四唑光還原率50%為1 個(gè)酶活力單位（U）[22]，超氧化物歧化酶活性單位為U/mg。

3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，在12 000×g下離心20 min，得到粗酶液。吸取0.1 mL 酶液，加入2 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液和0.2 mL 0.3%H2O2，立即測定溶液在240 nm 處的吸光度值。其中一根裝有2 mL 磷酸鹽緩沖液、0.1 mL 去離子水和0.2 mL H2O2的管作為對照管，測定OD240nm以指示酶活性的變化[23]。以每秒內(nèi)改變0.1個(gè)單位的吸光度定義為1 個(gè)酶活性單位（U），過氧化氫酶活性單位為U/mg。

1.2.2.5 多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性

在3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，再于12 000×g條件下離心20 min，得到粗酶液。將0.1 mol/L 兒茶酚和50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）-0.2 mmol/L EDTA 在30 ℃下預(yù)熱30 min。在1 mL粗酶溶液中加入1 mL兒茶酚和1.5 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.8）-0.2 mmol/L EDTA，立即測定420 nm 處的吸光度[24]。以每分鐘吸光度變化0.01 為1 個(gè)酶活力單位（U），多酚氧化酶活性單位為U/mg。

在3 mL 0.4 mol/L NaCl 中加入1 g 樣品粉末，浸提10 min，12 000×g下離心15 min，得到粗酶液。在3 mL聯(lián)苯胺乙酸-乙酸鈉溶液中加入0.1 mL酶溶液，30 ℃水浴5 min。加入0.5 mL 0.3%H2O2，測定580 nm處吸光度的變化。以每秒內(nèi)吸光度變化0.001 個(gè)單位定義為1個(gè)酶活性單位（U）[25]。過氧化物酶活性單位為U/mg。

1.2.2.6 活性氧（ROS）和羥基自由基（·OH）含量

在3 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）中加入1 g樣品粉末，12 000×g離心20 min，得到粗酶液。取0.2 mL 粗酶液加入1.8 mL Tris-HCl 緩沖液中，加入10μL 2.0 mmol/L 2,7-二氯熒光素，靜置30 min，以Tris-HCl緩沖液調(diào)零，檢測熒光強(qiáng)度。最大激發(fā)波長為485 nm，最大發(fā)射波長為530 nm，狹縫為5 nm[26]?；钚匝鹾繂挝粸閍.u/mg。

在2 mL 50 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中加入1 g 樣品粉末，10 000×g離心10 min。取0.5 mL 上清，加入0.5 mL 50 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和1 mL 含2.5 mol/L 2-脫氧-D-核糖的25 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），35 ℃暗處反應(yīng)1 h。加入1 mL 1%三丁基錫化合物和1 mL 醋酸，黑暗中煮沸30 min 后立即冰水中冷卻10 min，于532 nm 處測定吸光度。羥基自由基含量單位為mmol/g。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以x±s表示。使用Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果色差的影響

鮮切水果和蔬菜因其方便、營養(yǎng)、無污染和外觀新鮮而受到消費(fèi)者的歡迎[27]，但蘋果在鮮切加工后切面容易受損。L*值和色差是鮮切蘋果保鮮過程中重要的理化參數(shù)，是反映果肉在貯藏過程中亮度和褐變程度的重要指標(biāo)。由圖1A 可見，隨貯藏時(shí)間的延長，各組鮮切蘋果L*值呈降低后升高再降低的變化趨勢。NCA 處理鮮切蘋果的亮度整體高于對照，貯藏第8 天，對照L*值為53.97，5、10、15μmol/L NCA 處理組分別為56.03、57.50、58.07，分別是對照的1.03、1.06、1.07 倍。由圖1B 可見，鮮切蘋果的色差值隨貯藏時(shí)間的延長整體增大，且與對照相比，NCA處理組保持較低的色差值。第8 天時(shí)，對照色差值為6.55，而5、10、15 μmol/L NCA 處理的蘋果色差值分別為4.05、2.87、2.90，分 別 為對 照的61.83%、43.82%、44.27%。ΔE值越大，說明蘋果表面顏色越深，新鮮度越低?？梢?，NCA 處理可有效延緩鮮切蘋果色差值的增大，保鮮效果較好。其中，10、15μmol/L NCA處理2 d后，果實(shí)ΔE值變化較小，說明NCA處理能延緩鮮切蘋果褐變。綜上所述，NCA 處理能有效延緩鮮切蘋果的褐變，保持較好的外觀品質(zhì)。

圖1 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果L*值（A）和ΔE值（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NCA treatment on L*(A)and ΔE(B)of fresh-cut apples

2.2 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果可溶性固形物含量的影響

可溶性固形物含量是影響水果口感的重要因素之一。由圖2可見，5μmol/L NCA處理果實(shí)的SSC與對照呈相同變化趨勢，但其SSC 始終高于對照，第2天和第4天有一定差異，6 d后相差不明顯。10μmol/L NCA 處理維持果實(shí)SSC 效果較好，處理4～10 d，SSC無顯著變化。15μmol/L NCA 處理4 d 內(nèi)對果實(shí)SSC維持效果不明顯，后期呈先增后減再增的波動(dòng)變化?？傮w來看，NCA 處理對果實(shí)中SSC 的維持有積極作用，且NCA 處理濃度對鮮切蘋果可溶性固形物含量有較大影響，其中10μmol/L處理的效果最好。

圖2 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NCA treatment on soluble solids content in fresh-cut apples

2.3 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果硬度的影響

果實(shí)硬度是影響鮮切蘋果脆感的重要因素之一，也是反映其貯藏品質(zhì)最直觀的指標(biāo)之一[28]。果實(shí)中的組織軟化是由細(xì)胞壁成分的酶解、水分流失、滲透變化以及其他與組織相關(guān)的復(fù)雜機(jī)制引發(fā)的[29]。由圖3可以看出，鮮切蘋果的硬度隨貯藏時(shí)間的延長而降低。對照初始硬度為56.97 N/cm2，第10 天時(shí)降至38.95 N/cm2，下降了31.63%。貯藏第10 天，5、10、15 μmol/L NCA 處理組的果實(shí)硬度分別為44.53、45.26、46.31 N/cm2，均顯著高于對照（P＜0.05），其中以15μmol/L NCA處理的果實(shí)硬度下降最緩慢，保持了較好的效果。說明NCA處理可以減緩鮮切蘋果硬度的降低，抑制果實(shí)軟化。

圖3 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果硬度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NCA treatment on hardness of fresh-cut apples

2.4 不同濃度NCA 處理對鮮切蘋果SOD 和CAT 活性的影響

抗氧化酶參與植物清除活性氧的過程，被認(rèn)為是保護(hù)生物體免受有害物質(zhì)負(fù)面影響的有效防御屏障，其中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是兩種主要的酶促抗氧化劑[30]。由圖4A 可見，不同濃度NCA 處理鮮切蘋果的SOD 活性總體呈下降趨勢，對照組SOD 活性隨著貯藏時(shí)間的延長持續(xù)降低。5μmol/L NCA 處理組SOD 活性在第2 天達(dá)到峰值，是對照的1.3倍。10μmol/L和15μmol/L NCA處理組SOD活性在8 d 內(nèi)保持較高水平，第8 天時(shí)果實(shí)的SOD 活性分別是對照的1.6 倍和2.0 倍。由圖4B 可以看出，不同濃度NCA 處理后，鮮切蘋果的CAT 活性整體呈下降趨勢，除5μmol/L NCA 處理第4 天外，其余均高于對照。不同濃度NCA處理4 d后，CAT活性整體呈緩慢下降，第10天時(shí)，5、10、15μmol/L NCA處理組CAT活性分別為20、29、30 U/mg，分別為對照的1.43、2.07、2.14倍。CAT是一種能從蘋果中去除過氧化氫的酶。當(dāng)過氧化氫含量減少時(shí)，蘋果的老化變質(zhì)過程就會(huì)被延緩。因此，高活性的CAT 有利于鮮切蘋果的貯藏。綜上所述，NCA 處理有利于減緩鮮切蘋果SOD和CAT 活性的下降，且以NCA 濃度為10 μmol/L 和15μmol/L時(shí)效果較好。

圖4 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果SOD（A）和CAT（B）活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NCA treatment on activities of SOD(A)and CAT(B)in fresh-cut apples

2.5 不同濃度NCA 處理對鮮切蘋果PPO 和POD 活性的影響

研究證實(shí)，鮮切果蔬食品褐變的主要原因是酶促褐變，而參與酶促褐變的關(guān)鍵酶是多酚氧化酶和過氧化物酶[31-32]，鮮切果蔬的褐變敏感性是褐變相關(guān)酶和酚類化合物之間發(fā)生復(fù)雜的相互作用的結(jié)果[33-34]。在氧氣存在下，多酚氧化酶會(huì)催化單酚羥基化為鄰二酚（甲酚酶活性），鄰二酚氧化為鄰醌（兒茶酚酶活性）[35]，鄰醌既能相互作用形成高分子聚合物，也能與氨基酸或蛋白質(zhì)作用生成高分子絡(luò)合物，從而生成棕色、紅色或黑色物質(zhì)。一般來說，PPO 活性的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致蘋果軟化，不利于鮮切蘋果的保存和貯藏，甚至?xí)?dǎo)致鮮切蘋果變質(zhì)。由圖5A 可見，在5 ℃貯藏條件下，鮮切蘋果的PPO 活性先升高后降低，均在第2天達(dá)到峰值。各濃度NCA處理組PPO活性均低于對照，且15μmol/L NCA處理組PPO活性最低，處理效果最佳。

圖5 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果PPO（A）和POD（B）活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NCA treatment on activities of PPO(A)and POD(B)in fresh-cut apples

過氧化物酶（POD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的酶類，具有氧化還原作用。許多研究表明POD 與褐變有關(guān)[36]。盡管POD 受到超氧自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化等電子受體化合物可用性的限制，但它可以將組織中的一些碳水化合物轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，提高木質(zhì)化程度。因此，POD可以作為組織老化的生理指標(biāo)。由圖5B可見，在貯藏期間，鮮切蘋果的POD活性先升高后降低。不同濃度NCA處理組POD活性均低于對照，貯藏第4天，對照組POD活性為16.45 U/mg，而5、10、15 μmol/L NCA 處理組分別為15.75、15.20、13.34 U/mg，分別比對照降低4.26%、7.50%和18.91%。10μmol/L NCA 處理組貯藏第4 天POD 活性出現(xiàn)峰值，且較其他處理組的峰值低。15μmol/L NCA 處理組貯藏第2 天出現(xiàn)POD 活性峰值，貯藏2～10 d，POD 活性下降趨勢明顯。一般來說，POD 是一種氧化還原酶，會(huì)催化蘋果的氧化，誘發(fā)一系列氧化反應(yīng)，導(dǎo)致蘋果老化。因此，POD活性過高不利于鮮切蘋果的貯藏。比較發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L 和15 μmol/L NCA處理可顯著降低鮮切蘋果POD活性。

2.6 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果活性氧和羥基自由基含量的影響

蘋果細(xì)胞中的活性氧包括超氧陰離子、過氧化物和羥基，其可誘導(dǎo)膜脂氧化和細(xì)胞凋亡，是蘋果變質(zhì)的重要影響因素[37]。如果ROS含量超過閾值，則會(huì)直接觸發(fā)或加劇膜脂過氧化，破壞細(xì)胞微環(huán)境和正常代謝。由圖6A可見，貯藏過程中，鮮切蘋果的ROS含量呈上升趨勢，且不同濃度NCA處理組活性氧含量低于對照。貯藏6～10 d，對照鮮切蘋果ROS含量的增加趨勢顯著高于NCA處理組，且15μmol/L NCA處理組增長趨勢最慢，延緩鮮切蘋果ROS含量升高的效果最好。

圖6 不同濃度NCA處理對鮮切蘋果ROS（A）和·OH（B）含量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NCA treatment on contents of ROS(A)and·OH(B)in fresh-cut apples

脂質(zhì)過氧化是植物組織膜降解的主要機(jī)制，并導(dǎo)致許多副產(chǎn)物，如羥基自由基的形成。羥基自由基是一種活性氧，它可以破壞細(xì)胞中的大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或脫氧核糖核酸[38]。羥基自由基具有很強(qiáng)的氧化能力，會(huì)加速蘋果的衰老、萎蔫等生理過程。因此，為了延長蘋果的保存時(shí)間，應(yīng)該降低蘋果中羥基自由基的含量[39]。由圖6B可見，隨著貯藏時(shí)間的延長，鮮切蘋果的羥基自由基含量整體呈先降低后升高的趨勢。對照組羥基自由基含量在第6天達(dá)到最低水平，隨后急劇上升，之后盡管有下降，但仍保持在較高水平。10 μmol/L 和15 μmol/L NCA 處理組變化趨勢相同，0～4 d，羥基自由基含量急劇下降，6～10 d，羥基自由基含量增加。除第6天外，15μmol/L NCA處理組羥基自由基含量明顯低于對照?？梢姡琋CA處理可以減緩鮮切蘋果活性氧含量的增加，延緩細(xì)胞壁的水解，從而提高鮮切蘋果的硬度，保持較好的品質(zhì)和外觀。

3 結(jié)論

上述試驗(yàn)結(jié)果表明：不同濃度的NCA 處理可有效減緩鮮切蘋果亮度、可溶性固形物含量和硬度的下降，保持色澤的穩(wěn)定，較好地保持了鮮切蘋果的外觀和風(fēng)味，抑制了PPO和POD活性的增加，減緩了鮮切蘋果的褐變，提高了SOD 和CAT 活性，降低了活性氧和羥基自由基的含量，減輕了活性氧對鮮切蘋果的傷害。推測可能是由于NCA 產(chǎn)生的HNO 能有效抑制鮮切蘋果褐變，保持良好的貯藏品質(zhì)，其中15μmol/L NCA處理效果最佳。