扁桃果皮熊果酸對酒精性肝損傷保護作用研究

黃雪玲，李 進＊，張 俊

（1.新疆師范大學 生命科學學院 新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室 干旱區(qū)植物逆境生物學實驗，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州 木壘哈薩克自治縣 西吉爾鎮(zhèn)人民政府，新疆 昌吉 831900）

適量飲酒可以促進機體新陳代謝，但長期大量飲酒會導致急性酒精中毒或各種酒精性肝損傷疾病的發(fā)生，除心腦血管及腫瘤外，急性酒精中毒、酒精性肝損傷疾病已經(jīng)成為一個世界性問題，慢性過量飲酒也可引起肝損傷，其中最具代表性的是脂肪肝，持續(xù)飲酒可導致肝臟炎癥，纖維化，肝硬化，甚至肝癌［1］，據(jù)不完全統(tǒng)計，意外死亡事件中的3.8%和意外傷殘事件中的4.8%都是由飲酒造成的［2］。人體的肝臟器官是酒精代謝的主要場所，酒精可以在肝臟中對應的兩種脫氫酶催化作用下轉(zhuǎn)變成乙酸，乙酸進一步反應生成二氧化碳和水，長期大量飲酒會導致攝入的酒精含量超過身體所能承擔的代謝能力，從而使酒精及其代謝產(chǎn)物——乙醛在體內(nèi)蓄積，并可直接與SOD、GSH-PX和GSH 結(jié)合而導致抗氧化酶活性下降，造成系統(tǒng)抗氧化功能降低，引起肝組織損傷［3］。酒精在肝臟中代謝會產(chǎn)生大量自由基，當這些自由基過量時會攻擊肝細胞膜，加快肝細胞的衰亡速度，引起脂質(zhì)過氧化反應，對細胞膜及細胞器結(jié)構(gòu)造成損傷［4］。

扁桃（AmygdaluscommunisL.）為薔薇科（Rosaceae），桃屬（AmygdalusL.）落葉喬木［5］，其種仁是干果巴旦木，截至2021 年，僅在我國新疆莎車縣種植面積就達到90.32 萬畝，年總產(chǎn)量9.30 萬噸，備受人們關(guān)注和喜愛［6］。李維霞等人采用超聲波提取法對扁桃果皮成分進行研究并發(fā)現(xiàn)扁桃果皮中富含熊果酸［7］，而熊果酸是一種三萜類化合物，具有抗癌［8］、抗類風濕［9］、抗菌［10］等功效。有研究報道熊果酸對肝損傷［11-12］或腸道損傷［13］有保護作用，卻較少報道扁桃果皮中熊果酸對肝損傷的具體研究。在扁桃生產(chǎn)過程中，主要加工大量扁桃種仁，常將富含大量熊果酸的果皮作為廢棄物處理，這不僅造成資源浪費，還會污染環(huán)境［14］。為了提高扁桃果皮的利用價值，本研究以扁桃果皮為原料提取熊果酸，針對扁桃果皮熊果酸開展酒精性肝損傷的保護作用研究，為扁桃資源的綜合開發(fā)與利用提供技術(shù)支持，為扁桃果皮熊果酸保健功能的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扁桃果皮（外果皮、中果皮），采集于新疆莎車縣扁桃種植區(qū)；體質(zhì)量（20±2）g的清潔級昆明（KM）雄性小鼠60只，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK（新）2018-0001.

熊果酸標準品（上海源葉生物科技有限公司）；聯(lián)苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團股份有限公司）；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Glutamate aminotransferase，ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機（永康市小寶電器有限公司）；RV10 自動控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA 集團）；TDL-60-B臺式離心機（長沙湘儀儀器有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司）；JYD001-2007 石蠟切片機（浙江金華益迪醫(yī)療設備廠）；FA1104N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；HHS-數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精密科學儀器公司）；OLYMPUS BX51型顯微鏡（北京恒利通科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 扁桃果皮熊果酸的制備

取干燥后的扁桃果皮并將其磨成粉末狀，過40 目篩后，準確稱取扁桃果皮粉末2 g，放置于250 mL 錐形瓶中，以體積分數(shù)為65%的乙醇為提取液，選擇1∶20（g/mL）的液料比，提取時間為1.5 h，提取溫度控制為80 ℃，浸提2 次，合并浸提液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，水洗3 次，在恒溫箱中60 ℃烘干，得率為2.89%，純度為32%的扁桃果皮熊果酸粗品［15］。

1.3.2 小鼠肝損傷模型的建立與分組

將60 只雄性KM 小鼠適應性喂養(yǎng)5 d 后，隨機分為6 組，每組10 只，分別為正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯陽性對照組（150 mg/kg）、熊果酸低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）劑量組。其中對熊果酸低、中、高劑量組小鼠每天分別給予10 mL/kg熊果酸樣品，連續(xù)30天；與此同時對正常對照組、模型對照組進行灌胃處理，給予等體積蒸餾水。從第16 天起，除正常對照組外，其他各組每天給藥結(jié)束4 h 后使用30%乙醇（10 mL/kg）進行灌胃處理，試驗至最后一次注射后，各組小鼠禁食不禁水，12 h 后，摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠［16］。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量與肝臟指數(shù)的測定［17］

解剖取出肝臟組織，以4 ℃冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，計算肝臟指數(shù)，具體計算公式如下。

1.3.4 血清肝組織生化指標測定［18］

取小鼠眼眶血，血液靜置過夜，4 ℃下3000 r·min-1離心20 min，分離血清，血清樣品置于-80 ℃冰箱中保存待測。按照試劑盒使用說明書中的具體步驟配制試劑測定血清AST、ALT、SOD活力和MDA含量。

1.3.5 肝組織生化指標測定［18-19］

將肝臟組織研磨后，使用0.9%生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為10%的組織勻漿液，4 ℃下3000 r·min-1離心15 min，分離上清液，組織勻漿樣品置于-80 ℃冰箱中保存待測。根據(jù)試劑盒說明書測定肝臟SOD、GSH-PX活力和MDA、GSH含量。

1.3.6 肝組織病理學檢查［20-21］

取部分新鮮肝臟組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后制作厚度約4～5 μm的切片，然后用蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學變化，并拍照。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件分析處理，實驗結(jié)果以xˉ±s表示；圖表由Origin 2021 繪制，以P＜0.05表示差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 扁桃果皮熊果酸對小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

在試驗期間，正常對照組小鼠毛色光澤，活動正常，精力充沛。模型對照組小鼠毛色光澤度差，行動遲緩，精神萎靡。如表1 所示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠肝臟質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），但體質(zhì)量呈減少趨勢（P＜0.05），肝臟指數(shù)明顯增大，差異顯著（P＜0.05），表明模型對照組小鼠肝消化吸收功能受損，即酒精性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。與模型對照組相比，扁桃果皮熊果酸低劑量組小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），說明低劑量扁桃果皮熊果酸也許無法對肝損傷的小鼠體質(zhì)量恢復起作用，但扁桃果皮熊果酸中劑量組、高劑量組均可顯著增加小鼠體質(zhì)量及降低小鼠肝臟指數(shù)（P＜0.05）。由以上結(jié)果可以得出，中、高劑量的扁桃果皮熊果酸可以促進酒精性肝損傷小鼠對食物的吸收消化，即扁桃果皮熊果酸對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量降低及肝臟指數(shù)增加具有一定改善作用。

表1 扁桃果皮熊果酸對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響( ± s,n=10)

表1 扁桃果皮熊果酸對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響( ± s,n=10)

注:與正常對照組相比，*P＜0.05；與模型對照組相比，#P＜0.05.

2.2 扁桃果皮熊果酸對小鼠血清ALT、AST、SOD活力及MDA含量的影響

由圖1 可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清ALT、AST 活力及MDA 含量均顯著升高（P＜0.05），且SOD 活力均顯著下降（P＜0.05），說明模型對照組小鼠肝功能出現(xiàn)異常，酒精性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。與模型對照組相比，扁桃果皮熊果酸低劑量組小鼠血清ALT 活力有所下降，但差異不顯著（P＞0.05），表明低劑量扁桃果皮熊果酸可能對酒精性肝損傷小鼠肝細胞中的ALT有緩解作用。與扁桃果皮熊果酸中劑量組、高劑量組與模型對照組相比，可以有效降低小鼠血清ALT、AST 活力及MDA 含量，同時能夠升高小鼠血清SOD活力，且差異顯著（P＜0.05）。

圖1 小鼠血清ALT、AST、SOD活力及MDA含量( ± s,n=10)

2.3 扁桃果皮熊果酸對小鼠肝組織SOD、GSH-PX活力及MDA、GSH含量影響

如圖2 所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝組織SOD、GSH-PX活力及GSH 含量顯著降低（P＞0.05），MDA 含量顯著升高（P＜0.05），表明酒精性肝損傷小鼠模型建立成功。與模型對照組相比，扁桃果皮熊果酸低劑量組、中劑量組、高劑量組的MDA 含量顯著下降（P＜0.05），表明扁桃果皮熊果酸可以減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應MDA 的產(chǎn)生，顯著提高肝臟的抗氧化能力，有效保護細胞膜脂。扁桃果皮熊果酸高劑量組SOD 活力，GSH 含量和GSH-PX活力顯著升高（P＜0.05），扁桃果皮熊果酸低劑量組與模型對照組相比，SOD活力、GSH含量和GSH-PX活力變化不顯著（P＞0.05）。這說明低劑量和中劑量組扁桃果皮熊果酸保肝功效存在閾值，當劑量過低時，無法消耗大量自由基起到保肝作用，而高劑量組熊果酸能夠有效提高肝臟抗氧化能力從而保護肝細胞，即扁桃果皮熊果酸雖然具備體內(nèi)抗氧化特性可以增強肝臟抗氧化能力，但是需要達到一定濃度才能夠有效改善酒精性肝損傷。

圖2 小鼠肝組織SOD、GSH-PX活力及MDA、GSH含量( ± s,n=10)

2.4 扁桃果皮熊果酸對小鼠肝臟組織病理學的影響

由圖3 可見，通過HE 染色，正常對照組（圖3（a））小鼠肝細胞核結(jié)構(gòu)清晰，凹凸不平的肝板排列整齊呈放射狀，肝竇正常，無水腫現(xiàn)象；模型對照組（圖3（b））小鼠部分肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，細胞間隙增大，肝索排列紊亂，細胞核呈淺色染色，形態(tài)大小不一，該結(jié)果表明小鼠酒精性肝損傷模型構(gòu)建成功；陽性對照組（圖3（c））小鼠細胞結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊呈放射狀；與模型對照組相比，扁桃果皮熊果酸低（圖3（d））、中劑量組（圖3（e））點狀肝細胞壞死均明顯減少，且肝細胞結(jié)構(gòu)清晰；扁桃果皮熊果酸高劑量組（圖3（f））肝細胞恢復正常，細胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞大小均一，肝索排列整齊呈放射狀。肝組織病理觀察表明，通過施加扁桃果皮熊果酸處理后的低、中、高各組別的小鼠肝細胞狀態(tài)明顯優(yōu)于模型對照組，即扁桃果皮熊果酸對酒精性肝損傷起到明顯的修復作用。

圖3 小鼠肝組織HE染色（10×20）

3 討論

本實驗通過建立酒精性肝損傷小鼠模型，開展扁桃果皮熊果酸對小鼠酒精性肝損傷的保護作用研究。ALT 和AST 主要存在于肝細胞質(zhì)內(nèi)，當肝臟受到損傷或壞死時，細胞膜的通透性增加，肝細胞中的ALT 和AST 可以進入血液中，使血液中的ALT、AST 濃度升高，因此ALT、AST 這兩種酶可以作為檢測肝損傷的重要指標［18，22-23］。崔偉偉等人研究發(fā)現(xiàn)白首烏總苷可以明顯降低血清中ALT、AST 水平［24］，與本實驗中扁桃果皮熊果酸降低了小鼠肝比重和血清中ALT、AST酶活性的結(jié)果一致，表明扁桃果皮熊果酸對酒精引起的肝損傷有一定的緩解作用。MDA 是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，即MDA 的產(chǎn)生會增加肝細胞膜的損傷，能夠間接反映細胞膜脂損傷程度，是評價細胞膜過氧化程度和細胞內(nèi)自由基存在的重要指標［25］。SOD 是清理體內(nèi)超氧化自由基的天然內(nèi)源性抗氧化酶，能催化自由基發(fā)生歧化反應，促使H2O2和O2產(chǎn)生，從而保護肝細胞［26-27］。當長期大量飲酒時，機體內(nèi)存在大量自由基，會造成肝損傷，本實驗結(jié)果顯示扁桃果皮熊果酸可以抑制脂質(zhì)過氧化物MDA 產(chǎn)生，升高小鼠SOD、GSH-PX及GSH 活性，以此消耗自由基等有害物質(zhì)來阻斷自由基發(fā)生鏈式反應，從而降低肝臟脂質(zhì)過氧化損傷［28］，這與Ma等人［29］的研究結(jié)果一致。酒精性肝損傷不僅使肝功能生化指標發(fā)生改變，同時也會使肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此可以將肝臟組織病理學變化作為肝損傷變化的參照。實驗中熊果酸低、中、高劑量組處理后通過肝組織染色發(fā)現(xiàn)可以改善小鼠肝細胞損傷，這與賈逸林等人通過使用熊果酸對酒精誘導的小鼠腸黏膜損傷［30］有類似作用。

在扁桃果皮熊果酸高劑量組、中劑量組、低劑量組與模型對照組之間均具有明顯差異性的基礎上，根據(jù)均值比較分析，與扁桃果皮中劑量組和低劑量組相比，扁桃果皮高劑量組在小鼠體質(zhì)量增加最多，肝臟指數(shù)最低；ALT、AST 及MDA 酶活性水平最低；在SOD、GSH-PX、GSH 水平上均值升高最為明顯，可得出結(jié)論:高劑量扁桃果皮熊果酸對小鼠酒精性肝損傷作用效果最佳。綜上所述，扁桃果皮熊果酸對肝細胞的修復和保護起到重要作用，能夠有效提高酒精性肝損傷小鼠的體質(zhì)量，提高小鼠肝細胞抗氧化能力，減少自由基對肝臟的損傷，維持細胞膜結(jié)構(gòu)相對完整性及肝細胞連接間的緊密性，從而維持肝細胞的正常生理功能，進而對小鼠酒精性肝損傷起改善作用。

本研究為進一步探索扁桃果皮熊果酸對酒精性肝損傷保護作用提供了參考，為熊果酸可實現(xiàn)的護肝功能研究提供方向，也為提高扁桃果皮的利用價值提供了實驗依據(jù)，為推進該類資源的可持續(xù)開發(fā)利用提供了途徑。