基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討黃花柳抗氧化作用機(jī)制研究

熱吾扎·木哈買(mǎi)提，努爾阿米乃·麥麥提

（新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物實(shí)驗(yàn)室 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830017）

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。在正常情況下，生物體的抗氧化系統(tǒng)會(huì)保持自由基的動(dòng)態(tài)平衡。然而，一旦平衡被打破，過(guò)量積累的自由基就會(huì)攻擊身體的正常細(xì)胞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激［1］。氧化應(yīng)激與一些人類疾病有密切的關(guān)系，例如癌癥、自身免疫性疾病、年齡相關(guān)疾病、白內(nèi)障、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管和神經(jīng)退行性疾病等［2］。研究表明，抗氧化劑可以減輕氧化應(yīng)激造成的傷害，其中天然抗氧化劑因其無(wú)毒副作用而深受青睞。近年來(lái)，在藥用植物中不斷發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分和單體，其在防治氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用［3-5］。

黃花柳（Salixcaprea）別名為山羊柳、絨絮柳、歐洲絨絮柳、大黃華柳。在黃花柳化學(xué)成分的研究中分離得到了多種化合物，以黃酮類化合物為主，還包括萜類化合物、甾體類化合物、鞣質(zhì)類化合物、酚苷類化合物等黃花柳的根、皮、葉和花，這些在新疆很早就被當(dāng)作藥材使用?，F(xiàn)如今采其花、葉做藥用，黃花柳花作為新疆特有的中藥材，具有消熱、消腫止痛、抗菌、補(bǔ)腦補(bǔ)心等功效以及較強(qiáng)的抗腫瘤作用［6-7］，但相關(guān)的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將中藥和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的一個(gè)新興方法，是基于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)分析和網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證來(lái)揭示中藥在分子水平上的作用機(jī)理［8］，為疾病的藥物治療提供了新的研究策略和方法。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，揭示了黃花柳抗氧化作用機(jī)制，為黃花柳臨床應(yīng)用及深入研究其藥理作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃花柳活性成分的收集

在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、維普以及萬(wàn)方數(shù)據(jù)服務(wù)平臺(tái)等數(shù)據(jù)庫(kù)，收集黃花柳中已發(fā)現(xiàn)的化合物。通過(guò)PubChem［9］查找已發(fā)現(xiàn)成分的二維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，保存為sdf 格式。PubChem 未收錄結(jié)構(gòu)的化合物，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)式用ChemDraw Professional 15.0畫(huà)出2D結(jié)構(gòu)，也保存為sdf 格式。

1.2 黃花柳潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

將活性成分以sdf 格式文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction［10-11］數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，得到化合物靶點(diǎn)信息。將得到的化合物靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇物種為“Homo sapiens”，對(duì)其進(jìn)行批量標(biāo)準(zhǔn)化，并下載基因。

通過(guò)在GeneCards［12］和OMIM［13］數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“anti-oxidant”搜索已報(bào)道與抗氧化相關(guān)的基因，刪去重復(fù)基因，與上述潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配分析，使用Venny 2.1 繪圖軟件將預(yù)測(cè)的疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得活性成分抗氧化的潛在作用靶點(diǎn)。再將獲得的黃花柳活性成分與靶點(diǎn)信息通過(guò)Cytoscape 3.9.1［14］軟件構(gòu)建黃花柳抗氧化成分的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了研究黃花柳抗氧化靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，將所得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入在線STRING11.5［15］，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“high confidence（0.7）”，其他條件保持默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行操作，并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型。將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入到Cytoscape3.9.1 軟件，構(gòu)建黃花柳抗氧化作用靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析

作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID［16］數(shù)據(jù)庫(kù)，Select Identifier 設(shè)置為official gene symbol，List Type 設(shè)置為gene list，物種、背景均限定為人，對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，保存結(jié)果。根據(jù)P 值大小，篩選排名靠前的生物過(guò)程或通路。使用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出黃花柳的核心成分及核心靶點(diǎn)。

1.5 分子對(duì)接

對(duì)選取度（Degree）值排名靠前的核心靶點(diǎn)和成分進(jìn)行分子對(duì)接。從PubChem 和RCSB PDB［17］數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取小分子和大分子的pdp 格式，并應(yīng)用AutoDock Tools 1.5.7［18］軟件轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式后進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)Pymol 2.2.6［19］軟件針對(duì)對(duì)接得分較高的靶蛋白與化合物進(jìn)行分子對(duì)接可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 黃花柳活性成分的篩選

本研究通過(guò)文獻(xiàn)檢索，共收集到黃花柳21種活性成分（表1），分別為香草酸、對(duì)羥基內(nèi)桂醇、芥子醇、柚皮素、二氫楊梅素、紫元英苷、異鼠李素、香葉木素等21種活性成分［20-22］，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 黃花柳21種活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

表1 黃花柳活性成分

2.2 黃花柳活性成分-抗氧化作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的所有靶點(diǎn)中刪除重復(fù)并無(wú)法獲取基因名的蛋白，整合后得到21種活性成分靶點(diǎn)320個(gè)，由GeneCards、OMIN 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索整合得到抗氧化靶點(diǎn)1056個(gè)，將活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)取交集得到活性成分-疾病靶點(diǎn)118個(gè)（圖2）。

圖2 黃花柳活性成分抗氧化靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中不同形狀的節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分和抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有21個(gè)成分，118個(gè)靶點(diǎn)，共141個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間形成368條邊（圖3）。AKR1B1、NOX4、ALOX5、XDH、NQO2、SRC、PTGS2、CD38等可能是黃花柳作用的重要靶蛋白。

圖3 活性成分-抗氧化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 軟件得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。圖中包括266 條邊線、41 個(gè)節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)越大表示該靶點(diǎn)選取度越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的作用。在該網(wǎng)絡(luò)中排前十位的核心基因依次為AKT1、SRC、EGFR、MAPK3、VEGFA等靶蛋白，且與其他蛋白關(guān)系密切。

圖4 活性成分作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05.研究相關(guān)靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF），根據(jù)P 值大小選出前10個(gè)條目作圖（圖5）。富集度較高的生物學(xué)過(guò)程主要涉及凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)、對(duì)乙醇的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、對(duì)RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、對(duì)異生素刺激的反應(yīng)等。細(xì)胞組成中富集度較高的條目主要包括細(xì)胞質(zhì)、大分子復(fù)合體、膜筏等。同時(shí)黃花柳抗氧化作用與RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性、酶結(jié)、3 鋅離子結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、序列特異性DNA 結(jié)合、氧化還原酶活性等分子功能密切相關(guān)。上述結(jié)果表明黃花柳化合物可通過(guò)調(diào)控多種生物學(xué)途徑發(fā)揮抗氧化作用。

圖5 GO功能富集分析

2.6 KEGG信號(hào)通路富集分析

將篩選得到的63個(gè)抗氧化靶點(diǎn)輸入到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置P＜0.05，這些靶點(diǎn)可富集到146條信號(hào)通路中，其中跟抗氧化密切相關(guān)的前20條信號(hào)通路如圖6所示。主要包括癌癥通路、內(nèi)分泌耐藥、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路等。結(jié)果表明，黃花柳發(fā)揮抗氧化作用的靶點(diǎn)分布在多條通路中。

圖6 KEGG信號(hào)通路富集分析

2.7 黃花柳“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相關(guān)的活性成分與前20 條通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。該網(wǎng)絡(luò)圖中有96個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括21個(gè)成分、55個(gè)靶點(diǎn)、20條通路）和487條邊，其中V 形節(jié)點(diǎn)代表通路，長(zhǎng)邊形代表靶點(diǎn)，圓形代表黃花柳活性成分。選取度值較高的核心靶點(diǎn)為AKT1、MAPK3、PIK3CA、HRAS、EGFR、TNF 等。選取度較高的關(guān)鍵成分為柚皮素、9，10-裂-9，19-環(huán)羊毛甾烷三萜、香葉木素、二氫楊梅素、槲皮素等。這些靶點(diǎn)和成分是黃花柳發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和成分。

圖7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 分子對(duì)接結(jié)果

驗(yàn)證預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的可靠性，采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了排名前五的柚皮素、9，10-裂-9，19-環(huán)羊毛甾烷三萜、二氫楊梅素、香葉木素、槲皮素與6個(gè)富集于抗氧化相關(guān)的信號(hào)通路中核心基因（AKT1、EGFR、PIK3CA、MAPK3、HRAS、TNF）之間的相互作用（表2）。一般認(rèn)為結(jié)合自由能越小，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。絕對(duì)值＞4.25表示小分子具有一定的結(jié)合活性，絕對(duì)值＞5.0表示具有較好的結(jié)合活性，絕對(duì)值＞7.0表示具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［20］。因此，選取結(jié)合效果最好的六組對(duì)接結(jié)果進(jìn)行Pymol可視化處理，結(jié)果如圖8所示。

圖8 主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖

表2 黃花柳主要活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

3 討論

細(xì)胞無(wú)法充分消除氧化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)量自由基時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。這種有害過(guò)程會(huì)嚴(yán)重改變細(xì)胞膜和其他結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脂蛋白和脫氧核糖核酸（DNA）［24］。因此，通過(guò)抗氧化途徑減輕自由基帶來(lái)的氧化損傷，是抗氧化藥物的重要作用機(jī)制。

文章通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)黃花柳活性成分靶點(diǎn)，并得到與抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，并構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)蛋白之間相互作用的分析，篩選得到核心靶點(diǎn)。通過(guò)GO 分析和KEGG 分析找出涉及抗氧化的主要通路，并構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，最終將抗氧化的6個(gè)靶點(diǎn)蛋白與核心成分進(jìn)行分子對(duì)接分析，從而得到黃花柳抗氧化的主要通路、核心成分和核心靶點(diǎn)。

本次研究結(jié)果表明，黃花柳抗氧化作用的主要成分可能為柚皮素、9，10-裂-9，19-環(huán)羊毛甾烷三萜、二氫楊梅素、香葉木素、槲皮素。柚皮素是二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用。它具有清除自由基，抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、環(huán)氧合酶、脂氧合酶、黃嘌呤氧化酶和金屬離子螯合等促氧化酶活性的作用［25］。9，10-裂-9，19-環(huán)羊毛甾烷三萜是Tantry 等人［21］在黃花柳花提取物的氯仿部位獲取得到的新化合物，其藥理作用需要進(jìn)一步研究。二氫楊梅素是黃酮類化合物，具有解酒保肝、抗病原微生物、抗氧化、抗炎、調(diào)血脂及抗腫瘤等多方面的藥理作用［26］。二氫楊梅素有助于減少體力疲勞小鼠的代謝物積累，可能通過(guò)激活肌肉AMPK 能量信號(hào)通路和肝臟Nrf2、PPARα 相關(guān)抗氧化通路發(fā)揮抗疲勞作用［27］。香葉木素是黃酮類化合物，具有抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，香葉木素能夠干預(yù)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的C57BL/6J 小鼠急性肝臟損傷以及人非腫瘤性肝細(xì)胞，進(jìn)而激活Nrf2 信號(hào)通路，引起下游相關(guān)基因SOD2、G6pdx、NQO1顯著上升，同時(shí)LO2細(xì)胞活力恢復(fù)且GSH含量增加，表明香葉木素的抗氧化作用跟Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路的活化有關(guān)［28］。槲皮素是類黃酮化合物，具有預(yù)防癌變、延緩衰老、保護(hù)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等作用，與其較強(qiáng)的抗氧化功能密不可分。槲皮素通過(guò)維持氧化平衡表達(dá)其抗氧化活性，主要表現(xiàn)為清除氧自由基、整合金屬離子、抑制ox-LDL 引起的氧化損傷及提高抗氧化酶活性，通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路和影響基因表達(dá)過(guò)程，在細(xì)胞和動(dòng)物模型以及人體中發(fā)揮抗氧化作用［29］。

在黃花柳抗氧化作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，AKT1、MAPK3、PIK3CA、HRAS、EGFR、TNF 等6 個(gè)靶點(diǎn)的連接度較高，屬于該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，是黃花柳抗氧化作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞生長(zhǎng)和存活過(guò)程的關(guān)鍵介質(zhì)，包括葡萄糖代謝、凋亡、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和遷移［30］。MAPK3 是細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Regulated protein Kinases，ERK）的一種亞基，又稱ERK 1，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞的重要使者之一。細(xì)胞外的刺激信號(hào)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、G 蛋白偶聯(lián)受體或機(jī)體缺血缺氧等，均可激活MAPK3，促使MAPK3 磷酸化并向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)激活下游信號(hào)通路，將信號(hào)從細(xì)胞膜表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核［31］。PIK3CA 是一個(gè)關(guān)鍵原癌基因，它位于3號(hào)染色體上，共有20個(gè)外顯子。從信號(hào)通路來(lái)看，PIK3CA 基因?qū)儆赑I3K-Akt信號(hào)通路，它的主要職責(zé)是編碼p110α蛋白。PIK3CA 基因突變，會(huì)使PI3K 酶處于持續(xù)激活狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致所有通路的紊亂，引起一系列疾病，包括自身免疫性疾病、癌癥、造血型疾病和神經(jīng)病變等［32］。作為RAS 基因家族成員之一的HRAS，負(fù)責(zé)其突變后蛋白過(guò)度活化，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，導(dǎo)致Ras/MAPK 通路發(fā)生異常，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖或細(xì)胞死亡失控［33］。EGFR 是HER 家族的成員之一，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨細(xì)胞膜受體糖蛋白。EGFR 廣泛存在于體內(nèi)多種組織中，以胃腸道、上皮為多，它有利于燒傷后受損的皮膚和胃腸道黏膜屏障的修復(fù)［34］。TNF 是一種既能通過(guò)激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，又能直接殺死腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。可以抑制腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給而使其壞死［35］。

由KEGG富集分析可知，抗氧化靶點(diǎn)主要富集于癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等。其中FoxO 信號(hào)通路參與多種代謝過(guò)程，包括能量代謝、細(xì)胞凋亡、DNA 修復(fù)和氧化應(yīng)激等。FoxO 信號(hào)通路可以改善由多種刺激產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，包括氧化劑、炎性細(xì)胞因子和紫外線［36］。HIF-1是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子。HIF-1 是低氧環(huán)境下的氧調(diào)節(jié)型α 亞基與組成型β 亞基形成的穩(wěn)定的異二聚體，其促進(jìn)腫瘤血管生成、上調(diào)并激活基質(zhì)金屬蛋白酶及賴氨酸氧化酶等細(xì)胞因子及信號(hào)通路、誘導(dǎo)特異性微RNA 生成，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)生物學(xué)行為［37］。PI3K-Akt信號(hào)通路是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的通路之一。PI3K-Akt 信號(hào)通路作用于核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nrf2）能夠使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的損害。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了黃花柳發(fā)揮抗氧化作用的可能藥物成分、靶點(diǎn)以及通路，并通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了活性成分與抗氧化核心靶點(diǎn)的對(duì)接活性，驗(yàn)證了黃花柳通過(guò)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用方式抗氧化。但受限于數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性、時(shí)效性等條件，本研究還需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床開(kāi)發(fā)新的藥物提供更為充分的理論依據(jù)和指導(dǎo)。