火龍果皮花青素生物轉(zhuǎn)化菌株篩選及工藝優(yōu)化

程水明，李露欣，劉杰鳳

（廣東石油化工學(xué)院 生物工程系，廣東 茂名 525000）

火龍果（Hylocereus undulatusBritt）屬仙人掌科（Cactaceae）、量天尺屬（Hylocereus Britton.&.Rose）[1]，果肉顏色多樣[2]，原產(chǎn)于中美洲[3]，中國于1645年引種，目前在福建、廣東、海南、臺灣及廣西大面積種植，規(guī)模達3.33～4.00萬hm2[4]?；瘕埞恰盎ü尜p，賞食兼用”的園林綠化植物，全身是寶，果皮占火龍果總質(zhì)量的25%，富含多糖、膳食纖維、天然色素及黃酮類等物質(zhì)，其中，花青素含量較高。火龍果上市時間集中、量大、貨架期短、不易保存；食用后的果皮當(dāng)作廢棄物扔掉，導(dǎo)致嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[5]。目前，對果皮的研究利用非常有限，僅限于天然色素和膳食纖維提取[6-12]，研究多認為火龍果皮色素成分為β-青苷，不含花青素[6，8]。但楊洪元等[13-14]認為火龍果紅色素是由有多種結(jié)構(gòu)的植物色素混合而成，既含甜菜苷，又含花色苷和花青素等。色素提取研究較多地集中于紅色素方面，有關(guān)花青素、甜菜苷研究成果報道少且存在不全面、不系統(tǒng)、不深入等問題，值得進一步研究。

目前，花青素主要靠物理手段或化學(xué)方法從植物材料中直接提取[8-10]，但存在易破壞花青素結(jié)構(gòu)且工藝復(fù)雜、有機溶劑使用量大、毒性高、提取率低、產(chǎn)品純度不高，大規(guī)模制備時經(jīng)濟成本高且操作困難等不足。如何經(jīng)濟有效地提高花青素提取率一直是個探索熱點。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)提取方法相比，生物轉(zhuǎn)化因其具有選擇性高、可限制不需要副產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)、常在溫和的溫度及壓力下進行等特點，隨著生物代謝調(diào)控手段及合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，以生長周期短、遺傳背景簡單、操作方便的微生物作為生物代謝反應(yīng)器進行天然活性產(chǎn)物合成（如黃酮類物質(zhì)）逐漸成為研究熱點[15]。利用微生物發(fā)酵植物在《千金要方》[14]中已有記載，現(xiàn)代利用微生物發(fā)酵植物研究始于上個世紀八十年代，如淡豆豉、六神曲、豆黃等[16-18]；其研究成果充分證明微生物轉(zhuǎn)化是有效增加天然產(chǎn)物多效性方法之一，已在食品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[15，18]，但運用食用真菌來發(fā)酵火龍果皮提取相關(guān)活性物質(zhì)則報道甚少。如何有效地提高植物材料中花青素類物質(zhì)的產(chǎn)量，這一困惑生產(chǎn)實踐中的問題，既需從學(xué)術(shù)理論上加以闡述，又關(guān)乎相關(guān)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型與持續(xù)發(fā)展，值得深入研究與探討。

基于此，本研究選用20種食用真菌分別發(fā)酵火龍果皮，利用pH示差法測定發(fā)酵液中花青素含量，篩出適用于火龍果皮發(fā)酵的食用真菌菌株，并在單因素試驗基礎(chǔ)上，以花青素含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法優(yōu)化菌株發(fā)酵工藝條件，為植物材料中花青素類物質(zhì)的資源開發(fā)及深度利用提供科學(xué)的方法與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

火龍果（Hylocereus undulatusBritt），品種為玉龍果，產(chǎn)于廣東湛江，市購。

20種供試食用真菌：滑菇（Pleurotus ostreatus）、茯苓（Wolfporia cocos）、黃傘（Pholiota adiposa）、香菇（Lentinula edodes）、阿魏菇（Pleurotus ferulae）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、桑黃（Fleckedflesh polypore）、金針菇（Flammulina velutipes）、繡球菌（Sparassis crispa）、長根菇（Pleurotus ne brodensis）、黑平菇（Pleurotus ostreatus）、裂褶菌（Schizo phyllum commune）、野蘑菇（Agaricus arvensis）、蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）、灰褐香蘑（Lepista panaeola）、白小圈齒麟傘（Pholiota albocrenulata）、玉覃離褶傘（Lyophyllum shimeji）、毛柄庫恩菇（Kuehneromyces mutabilis），依次用2～21表示，所有菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑

醋酸（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；醋酸鈉、鹽酸、硫酸鎂、氯化鉀（均為分析純）：天津市百世化工有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基[19]：葡萄糖2%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、磷酸二氫鉀0.046%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.1%，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

火龍果果皮液體培養(yǎng)基：將火龍果果皮去除綠色部分，冷凍干燥，粉碎過100目篩，按料液比1∶45（g∶mL）加入到液體培養(yǎng)基中，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；V-5000型722分光光度計：上海元析儀器有限公司；DF-15高速萬能粉碎機：浙江溫嶺市林大機械有限公司；SPX-250B人工智能生化培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Super-Genie U大流量RO純水超純水工作站：上海樂楓生物科技有限公司；CR-080S超聲波清洗器：深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司；DHG-9073BS-Ⅲ電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械有限公司；NRY-1102立式恒溫搖床：上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；TG16A-WS臺式高速微量離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；L5S紫外可見分光光度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食用真菌的篩選

將活化后的供試食用真菌分別接種到液體培養(yǎng)基中，100 r/min、25 ℃培養(yǎng)3 d得種子液；將種子液按4%的接種量接種于火龍果果皮液體培養(yǎng)基中，以未接種的火龍果果皮液體培養(yǎng)基為空白對照，100 r/min、25 ℃培養(yǎng)7 d，測定發(fā)酵液中的花青素含量，篩選出花青素含量最高的食用真菌作為后續(xù)工藝優(yōu)化用菌株。

1.3.2 食用菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素工藝優(yōu)化

單因素試驗：固定其他條件不變，考察發(fā)酵溫度（22.5℃、25.0 ℃、27.5 ℃、30.0 ℃、32.5 ℃）、料液比（1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60）（g∶mL）、發(fā)酵時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對發(fā)酵液中花青素含量的影響。

響應(yīng)面試驗：以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以花青素含量（Y）為響應(yīng)值，選擇發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和料液比（D）4個因素為自變量，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 食用菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素工藝優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface tests for anthocyanidin production process optimization from pitaya pericarp by edible fungi fermentation

1.3.3 花青素含量的測定

參照參考文獻[20-21]中pH示差法測定花青素含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)測定3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準差”表示，采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理；采用Origin 2019軟件繪圖；通過Design Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用真菌菌株的篩選結(jié)果

20種供試食用真菌菌株發(fā)酵火龍果果皮后，發(fā)酵液中的花青素含量見圖1。

圖1 20種供試食用真菌發(fā)酵火龍果果皮花青素含量的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of anthocyanin contents in pitaya pericarp fermented by 20 kinds of tested edible fungi

由圖1可知，火龍果果皮經(jīng)供試食用真菌發(fā)酵后，花青素含量（0.20～1.90mg/100mL）均比空白對照（0.17mg/100mL）有所增加，表明經(jīng)微生物發(fā)酵可促進火龍果果皮中花青素的形成和釋放。其中，蜜環(huán)菌（菌株17）發(fā)酵后花青素含量最高，為（1.90±0.02）mg/100 mL，顯著高于空白對照及其他供試菌株，為空白對照的11.18倍，故而后續(xù)試驗采用蜜環(huán)菌為供試菌株。

2.2 蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對花青素含量的影響

發(fā)酵溫度對蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對花青素含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on anthocyanidin contents

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中的花青素含量呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時，花青素含量最高為1.84 mg/100 mL，分析原因可能是由于發(fā)酵溫度過低或過高都不利于蜜環(huán)菌生長，導(dǎo)致發(fā)酵性能下降[22]。同時還因為花青素不能耐受高溫，高溫時可能引起花青素的結(jié)構(gòu)變化甚至分解，從而使得花青素含量下降[22-23]。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

2.2.2 發(fā)酵時間對花青素含量的影響

發(fā)酵時間對蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對花青素含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on anthocyanidin contents

由圖3可知，在發(fā)酵3～5d內(nèi)，花青素含量隨發(fā)酵延長而逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵5d時，花青素含量達最大，為1.90 mg/100 mL。發(fā)酵5 d后，隨著發(fā)酵時間延長，花青素含量逐漸降低。分析原因可能是發(fā)酵時間過短，微生物群體較小，生長較為緩慢且以菌體生長為主，用于轉(zhuǎn)化的酶積累較少，故而轉(zhuǎn)化花青素的量也相應(yīng)較少；發(fā)酵5 d時菌體生長進入快速期，次級代謝轉(zhuǎn)旺，花青素轉(zhuǎn)化速度加快，含量增長亦加快；發(fā)酵時間過長，因次級代謝旺盛，會產(chǎn)生更多代謝物質(zhì)，與花青素發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)，導(dǎo)致花青素結(jié)構(gòu)破壞，從而使花青素含量下降。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵時間為5 d。

2.2.3 料液比對花青素含量的影響

料液比對蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素的影響見圖4。

圖4 料液比對花青素含量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on anthocyanidin contents

由圖4可知，花青素的含量隨料液比在1∶40～1∶50（g∶mL）范圍減小而增加，當(dāng)料液比達到1∶50時，花青素含量達最大值1.94 mg/100 mL；繼續(xù)增大料液比，花青素含量略有降低但變化不大。原因可能是因隨發(fā)酵液體積增加，火龍果皮粉與發(fā)酵液接觸面積亦不斷增加，加快了花青素類物質(zhì)的溶出速度，但發(fā)酵液用量過大，會加速果皮中其他成分溶出，溶出物與花青素反應(yīng)或干擾花青素穩(wěn)定性，導(dǎo)致花青素的得率反而降低。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶50（g∶mL）。

2.2.4 接種量對花青素含量的影響

接種量對蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素的影響見圖5。

圖5 接種量對花青素含量的影響Fig.5 Effect of inoculum on anthocyanidin content

由圖5可知，隨著接種量不斷增大，發(fā)酵液中花青素含量逐漸升高，當(dāng)接種量為6.0%時，花青素含量達到最高，為1.87 mg/100 mL；繼續(xù)增加接種量，花青素含量略有下降并趨于穩(wěn)定，分析原因可能是接種量過大，微生物生長較快，使群體峰值較早出現(xiàn)，從而導(dǎo)致生長限制因子快速消耗，容易導(dǎo)致菌體衰老或自溶現(xiàn)象出現(xiàn)。綜合考慮，選擇最佳接種量為6.0%。

2.3 蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和料液比（D）作為考察因素，以花青素含量（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 蜜環(huán)菌發(fā)酵火龍果果皮產(chǎn)花青素工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests for anthocyanidin production process optimization from pitaya pericarp by Armillaria mellea

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到各因素水平對花青素含量的二次多項回歸模型方程：Y=2.04+0.078A+0.050B-0.12C+0.012D-0.089AB+0.013AC+5.75AD+0.043BC-5BD+0.039CD-0.37A2-0.30B2-0.33C2-0.063D2。

由表3可知，回歸模型P值＜0.0001，極顯著，失擬項P值＞0.05，不顯著，表明模型高度可靠[24-27]。決定系數(shù)R2=0.957 3，說明模型能解釋95.73%的響應(yīng)值變化，誤差小，模型F值=22.42、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.914 6，表明該模型預(yù)測值與實測值擬合度高，可以很好地解釋響應(yīng)值的實際變化情況。4個因素對花青素轉(zhuǎn)化的影響程度為C＞A＞B＞D，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量＞料液比。其中，一次項A、C，二次項A2、B2、C2對花青素含量的影響極顯著（P＜0.01），一次項B，交互項AB對花青素含量影響顯著（P＜0.05），其他項對花青素含量影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，該模型可較好地預(yù)測不同條件下花青素轉(zhuǎn)化量的變化規(guī)律。

2.3.2 因素間交互作用分析

響應(yīng)面和等高線圖可直觀表示各因素間交互作用對花青素含量的影響。三維響應(yīng)面圖中坡度越陡，說明該因素對響應(yīng)值的影響越大，反之，走勢平滑則表明影響較小[25-26]。等高線呈橢圓形代表兩因素間交互作用較強，圓形則代表交互作用不顯著。發(fā)酵時間與接種量間交互作用對花青素含量影響的響應(yīng)面及等高線見圖6。由圖6可知，發(fā)酵時間與接種量間交互作用對花青素含量影響的響應(yīng)面呈凸面，坡度較陡；等高線呈橢圓形，顏色變化較快，說明AB交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 發(fā)酵時間與接種量間交互作用對花青素含量影響的響應(yīng)面（a）及等高線（b）Fig.6 Response surface plots (a) and contour lines (b) of effects of interaction between each factor on anthocyanidin content

2.3.3 驗證試驗結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6軟件對二次回歸方程各個自變量求極值，得到預(yù)測的最佳工藝條件：發(fā)酵時間5.17 d、接種量6.2%、發(fā)酵溫度22.23 ℃、料液比1∶49.22（g∶mL），在此條件下花青素含量預(yù)測值為2.04 mg/100 mL?？紤]實際操作，將最佳工藝條修正為發(fā)酵時間5 d、接種量6%、發(fā)酵溫度25℃、料液比1∶50（g∶mL），在此條件下進行5次平行驗證試驗，得到發(fā)酵液中花青素含量實際值為（2.03±0.02）mg/100 mL。與預(yù)測值2.04 mg/100 mL接近，誤差極小，說明該模型能準確反映各因素的變化與花青素含量之間的關(guān)系，模型設(shè)計可靠。

3 結(jié)論

本研究以花青素含量為評價指標(biāo)，選取20種食用真菌發(fā)酵火龍果果皮，篩選得到蜜環(huán)菌轉(zhuǎn)化火龍果皮中花青素的效率最高，花青素含量是空白對照的11.18倍；通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計確定蜜環(huán)菌轉(zhuǎn)化花青素發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間5 d、接種量6%、發(fā)酵溫度25 ℃、料液比1∶50（g∶mL），在此條件下，發(fā)酵液中花青素含量最高達到（2.03±0.02）mg/100 mL，是未經(jīng)食用真菌轉(zhuǎn)化的11.94倍。結(jié)果證實，微生物可有效轉(zhuǎn)化火龍果皮中花青素。