添加中藥材對綠衣觀音土曲品質(zhì)影響及相關(guān)性分析

江 威，章 剛，張 龍，唐 潔，張晶晶，安龍旭，張 帆，楊 強(qiáng)，陳申習(xí)*

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435000）

“曲為酒之骨”，酒曲對白酒發(fā)酵質(zhì)量具有重要的作用，一直以來科研人員對酒曲工藝開展了大量研究，旨在通過提升酒曲質(zhì)量來改善酒曲在釀造過程中的作用，提升原酒品質(zhì)。近年來，中藥材被廣泛用于酒曲生產(chǎn)中，中藥材的添加一方面可以抑制酒曲雜菌生長；另一方面可以促進(jìn)有益微生物繁殖，提高酒曲發(fā)酵性能，增強(qiáng)原酒中風(fēng)味及活性成分含量[1-3]。韓紅艷等[4]研究表明，甘草、薄荷等5種藥材對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黃曲霉等雜菌具有抑制作用。蘇瑤等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在油橄欖藥曲中添加西洋參能顯著提升藥曲的液化酶和糖化酶活性。吳瓊燕等[6]通過研究桑葉和辣蓼甜酒曲，發(fā)現(xiàn)桑葉和辣蓼對根霉菌絲生長具促進(jìn)作用，且相應(yīng)酒曲的糖化力和發(fā)酵力均有提升。吳志等[7]在制曲過程中添加3%的石菖蒲、生地黃、白術(shù)等藥材的醇提液，酒曲發(fā)酵力提高了95%～108%，糖化力提高了28%～49%。李麗等[8]分別添加西洋參粉和紅景天，其藥曲中糖化力、蛋白酶、酸度等指標(biāo)均得到提升。羅芳等[9]將21種中藥材分別用于制作純種藥曲，結(jié)果表明添加一定量西洋參粉和黃芪粉，對藥曲糖化力、液化力等性能指標(biāo)具有明顯的提升作用。因此，在制曲過程中添加一定的中藥材對于提升酒曲品質(zhì)具有重要的意義。

綠衣觀音土曲是清香型白酒釀造中使用的酒曲之一，以其身披“綠衣”為主要特征[10-11]。在前期采用20種中藥材分別對綠衣觀音土曲中主要釀造微生物的生長開展探究的基礎(chǔ)上[12]，本研究選擇10種對微生物增殖具有影響或?qū)魄|(zhì)量、原酒風(fēng)味具有提升作用的中藥材（當(dāng)歸、川芎、人參、黃芪、丹參、辣蓼、陳皮、甘草、丁香、肉桂）進(jìn)行綠衣觀音土曲制備，并對存放一段時間綠衣觀音土曲品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行檢測，并探討中藥材添加量與綠衣觀音土曲的品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探究中藥材對綠衣觀音土曲質(zhì)量的影響，為提升綠衣觀音土曲質(zhì)量提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

當(dāng)歸、黃芪：甘肅岷縣；川芎：四川都江堰；人參：吉林撫順；丹參：湖北羅田；辣蓼：廣西欽州；陳皮：廣東新會；甘草：甘肅隴西；丁香：印度尼西亞；肉桂：廣東肇慶；觀音土：湖南臨澧；米糠：當(dāng)?shù)厥袌?；種曲：勁牌有限公司毛鋪制曲車間。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、葡萄糖、可溶性淀粉、濃硫酸、干酪素、碘化鉀、碘、福林酚試劑（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：深圳海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平、FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；90-3磁力攪拌器：上海振榮科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；RH-4C溫濕度記錄儀：江蘇精創(chuàng)電氣股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綠衣觀音土曲的制備

根據(jù)前期研究結(jié)果及經(jīng)驗(yàn)，選取了當(dāng)歸、川芎、人參、黃芪、丹參、辣蓼、陳皮、甘草、丁香、肉桂等比混合、粉碎。米糠∶種曲∶觀音土按照1∶1∶3配制，以未添加中藥材土曲為對照，中藥材粉添加量分別為5.0%、7.5%、10.0%，充分混勻，加入適量水翻拌，翻拌均勻后捏成直徑8～10 cm的球體。成型曲球放置于箱床中，選取箱床中央?yún)^(qū)域的曲球作為監(jiān)測點(diǎn)插入溫濕度記錄儀，每小時自動記錄溫度數(shù)值。入箱20～25 h后開箱，待箱內(nèi)曲坯溫度自然降溫至室溫，將曲坯轉(zhuǎn)移至曲折子上，控制培養(yǎng)室溫度在28～32 ℃，培養(yǎng)室相對濕度保持在（65±10）%，培養(yǎng)7 d后，將曲球烘干至酒曲水分含量≤5.0%，即得綠衣觀音土曲曲球，出烘房入庫。

1.3.2 酒曲品質(zhì)指標(biāo)分析檢測

酒曲的感官評價：依據(jù)勁牌有限公司毛鋪制曲車間的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。土曲的泡度，曲心顏色、裂口數(shù)量和大小，有無異味是綠衣觀音土曲的主要感官指標(biāo)。泡度以一米落地開花，曲心紅色、允許少量黑心，裂口大，數(shù)量較多，無異味較佳。

酒曲溫度采用記錄儀進(jìn)行實(shí)時記錄，水分測定根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[13]進(jìn)行；酸度、氨基酸態(tài)氮：采用連續(xù)滴定法[14]；糖化率的測定：采用化飯法[15]；葡萄糖含量的測定：采用斐林試劑法[16]；發(fā)酵率（每1 g酒曲糖化后發(fā)酵100 g大米飯3 d所生成的酒精換算成20 ℃時的酒精質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的測定：將發(fā)酵醪進(jìn)行蒸餾，接取前100 mL餾出液檢測酒精計示值和溫度。

微生物檢測采用梯度稀釋的方法，培養(yǎng)2 d后分別計數(shù)細(xì)菌、酵母、霉菌和乳酸菌的數(shù)量[17-20]。

酸性蛋白酶酶活測定：采用福林-酚法[21]；糖化酶酶活測定：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[22]；α-淀粉酶酶活測定：采用YOO Y T等[23]的改良法。

酸性蛋白酶酶活定義：1 g酶粉或1 mL酶液在40 ℃，pH 3.0條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為一個酶活力單位（U/g或U/mL）。糖化酶酶活定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），于40 ℃、pH值為4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖，即為1個酶活力單位（U/g或U/mL）。α-淀粉酶酶活定義：1 mL酶液于60 ℃，pH 6.0條件下，1 h液化可溶性淀粉1 g，即為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 9.0繪圖，使用RSTUDIO利用皮爾森統(tǒng)計方法對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量中藥材酒曲培養(yǎng)過程中溫度的變化及其感官分析

土曲出箱后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～7 d稱為一至七燒，酒曲培養(yǎng)期間溫度變化見圖1。隨著微生物的繁殖，酒曲內(nèi)部溫度逐漸上升，從一燒開始，曲球表面逐漸覆蓋霉菌外衣，即“綠衣”。隨著酒曲濕度逐漸下降，表面開始出現(xiàn)裂口，由圖1可知，隨著藥材添加量的增加，曲球表面裂口的時間出現(xiàn)延遲，對照（未添加中藥材）、中藥材添加量為5.0%和7.5%的曲球在第五燒開始出現(xiàn)裂口，藥材添加比例越高，裂口越少且越細(xì)，而中藥材添加量為10%的曲球則在第六燒開始出現(xiàn)裂口。

圖1 不同添加量中藥材酒曲培養(yǎng)期間溫度變化趨勢Fig.1 Trend of temperature variation of Jiuqu with different addition of Chinese medicinal materials during the cultivation period

由圖1亦可知，在一燒至二燒（出箱培養(yǎng)0～48 h）期間，中藥材添加量為5.0%、7.5%及10.0%實(shí)驗(yàn)組的溫度變化同對照酒曲基本一致，均在30 ℃左右開始升溫。微生物的繁殖代謝是導(dǎo)致酒曲升溫的主要原因，溫度在培養(yǎng)末期下降至30 ℃左右，表示酒曲中微生物已增殖完成，酒曲可進(jìn)行下一步的烘干。在三燒（49～72 h）期間溫度開始上升，中藥材添加量為5.0%的土曲溫度上升較快，可能經(jīng)過前期微生物與藥材的相互作用，適量的中藥材促進(jìn)了酒曲中酵母的代謝，導(dǎo)致溫度升高提前，縮短了酒曲的整體培養(yǎng)時間。對照酒曲和其他中藥材添加量的土曲在四燒（73～96 h）期間溫度開始上升，其中，中藥材添加量7.5%和10.0%的酒曲升溫較對照較緩慢，可能由于藥材添加量過高，對酒曲中微生物產(chǎn)生了抑制作用。在五燒（97～120 h）期間，對照和中藥材添加量為5.0%的酒曲開始降溫，說明兩者酒曲中的微生物增殖已接近飽和，溫度開始出現(xiàn)下降，而中藥材添加量為7.5%和10.0%的酒曲則仍處在溫度上升期，微生物生長未飽和，酒曲培養(yǎng)時間延長。因此，合適的中藥材添加量可促進(jìn)微生物的增殖，使酒曲成熟提前，縮短制曲時間。

烘干后酒曲的感官評價結(jié)果見表1。由表1可知，中藥材的添加，一定程度影響了土曲的泡度和裂口情況，在藥材添加量為5.0%時，對酒曲的泡度無明顯影響，藥材添加量為7.5%和10.0%時，酒曲的泡度差。綜上分析，中藥材添加量5.0%制作的土曲泡度較好，曲心紅色，有少量黑心，藥材味適宜。

表1 不同添加量中藥材制備酒曲感官評價Table 1 Sensory evaluation of Jiuqu prepared with different addition of Chinese medicinal materials

2.2 酒曲存放期間品質(zhì)指標(biāo)變化情況

酒曲出庫后水分高、雜菌多，因此貯存是酒曲使用前的必要工序[24]。本研究分析不同添加量中藥材對制備酒曲存放1～2月期間主要品質(zhì)指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同添加量中藥材制備酒曲貯存期間品質(zhì)指標(biāo)變化Fig.2 Changes of quality indexes of Jiuqu prepared with different addition of Chinese medicinal materials during storage period

由圖2A可知，酒曲水分隨著中藥材添加量增加而上升，存放2月后對應(yīng)各酒曲水分稍有下降。存放1月時，糖化率隨藥材添加比例增加而下降，存放2月糖化率進(jìn)一步下降，其中，5.0%添加量中藥材與對照相當(dāng)。而中藥材添加量及存放時間延長對酒曲發(fā)酵率影響不大。由圖2B可知，酒曲酸度和氨基酸態(tài)氮隨著中藥材添加量增加而上升，相比于存放1月，存放2月酒曲氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)上升趨勢。

酒曲質(zhì)量的優(yōu)劣很大程度上取決于微生物群落組成及其代謝性能[25-26]。由圖2C可知，酒曲存放一個月后，5.0%添加量中藥材對酒曲微生物的生長具有一定促進(jìn)作用。隨著藥材比例的增加，微生物生長明顯受到了抑制，表現(xiàn)在酵母、細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)中藥材添加量為10.0%時，酵母、細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量分別下降了78.5%、61.5%和76.8%，霉菌數(shù)量變化較小，可見藥材添加量越多，越抑制微生物的生長。相比存放1月，酒曲存放2月細(xì)菌、酵母和霉菌數(shù)量降低明顯，且隨著中藥材添加量增加，降低趨勢越明顯，其中對酵母數(shù)量的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)合前期單種藥材對微生物生長影響實(shí)驗(yàn)，在制曲和存放環(huán)境下，多種中藥材混合添加后，在較高的中藥材添加量下對微生物容易產(chǎn)生抑制作用，但不同比例藥材對霉菌數(shù)量影響較小，可能由于酒曲儲存的開放環(huán)境，更利有于霉菌的生長，存放2月各添加中藥材酒曲中霉菌數(shù)量有所上升。由圖2D可知，酒曲存放1月及2月后，糖化酶在5.0%中藥材添加量時有所上升，淀粉酶酶活隨中藥材添加量增加而下降，蛋白酶則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。存放2個月時，對淀粉酶和蛋白酶沒有較大影響，糖化酶則在低添加量下出現(xiàn)上升，高中藥材添加量下酶活呈現(xiàn)下降趨勢。

在酒曲培養(yǎng)過程中，中藥材添加量為5.0%的酒曲呈現(xiàn)出較適宜的藥香，且對酒曲的泡度和裂口情況沒有抑制作用。綜合酒曲品質(zhì)指標(biāo)，表明中藥材添加量在5.0%時，酒曲存放時間為1月時，對酒曲大多數(shù)品質(zhì)指標(biāo)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，如酸性蛋白酶、酸度、發(fā)酵率、糖化酶、糖化率、微生物的數(shù)量等，其中酸性蛋白酶和酸度提升幅度最高，分別達(dá)到89.7%和36.7%。盡管隨著中藥材添加量的增加，酸度和氨基酸態(tài)氮增長明顯，然而微生物數(shù)量尤其是酵母的數(shù)量下降顯著，將對釀造過程產(chǎn)生重要影響，如出酒率和乙酸乙酯等。而隨著貯存時間延長至兩個月，酒曲糖化率、微生物數(shù)量和糖化酶急劇下降，氨基酸態(tài)氮和酸度升高，而對發(fā)酵率、水分、酸性蛋白酶和淀粉酶無明顯影響。因此，確定最適中藥材添加量為5.0%，并且酒曲存放時間1月質(zhì)量較佳，其水分為4.56%、酸度為0.41 mmol/10 g、氨基酸態(tài)氮為0.27 g/kg、糖化率為31.2 g/100 g、發(fā)酵率為35.9%，乳酸菌、酵母和霉菌數(shù)量分別為163.5×106CFU/g、280.5×106CFU/g、2.0×106CFU/g，糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶酶活分別為1 217.7 U/mL、50.6 U/mL、44.0 U/mL。

2.3 中藥材添加量與酒曲品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

糖化率和發(fā)酵率是表征綠衣觀音土曲質(zhì)量的主要指標(biāo)，而中藥材添加量對多數(shù)指標(biāo)具有顯著影響，探究指標(biāo)間的相關(guān)性可為酒曲工藝調(diào)控提供策略，中藥材添加量與酒曲品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，中藥材添加量、水分、酸度和發(fā)酵率之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且這四個指標(biāo)與淀粉酶活呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；霉菌數(shù)量與中藥材添加量、水分呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。根據(jù)2.2中酒曲水分隨著中藥材添加量增加而上升，因此推斷中藥材添加量是影響酒曲酸度、發(fā)酵率、霉菌數(shù)量和淀粉酶酶活主要原因。

圖3 中藥材添加量與酒曲的品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果Fig.3 Correlation analysis results between Chinese medicinal materials addition and quality indexes of Jiuqu

3 結(jié)論

在制曲過程中添加合適的中藥材可以在一定程度提升酒曲感官和品質(zhì)指標(biāo)，也賦予酒曲一定的藥香。結(jié)果表明，中藥材添加量5.0%制作的土曲泡度較好，曲心紅色，有少量黑心，藥材味適宜。綠衣觀音土曲存放時間1月質(zhì)量較佳，其水分為4.56%、酸度為0.41 mmol/10 g、氨基酸態(tài)氮為0.27 g/kg、糖化率為31.2 g/100 g、發(fā)酵率為35.9%，乳酸菌、酵母和霉菌數(shù)量分別為163.5×106CFU/g、280.5×106CFU/g、2.0×106CFU/g，糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶酶活分別為1 217.7 U/mL、50.6 U/mL、44.0 U/mL。相關(guān)性分析表明，中藥材添加量、水分、酸度和發(fā)酵率之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且這四個指標(biāo)與淀粉酶活呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；霉菌數(shù)量與中藥材添加量、水分呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。酒曲中添加適量中藥材對于綠衣觀音土曲的品質(zhì)有一定的提高，而其對清香型白酒酒質(zhì)的影響、中藥材的加入是否在原酒中引入中藥材的功效成分等方面尚有待進(jìn)一步的探究。