麩醋醋醅中產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶葡萄球菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

童文華，王書琴，楊 瑩，黃志久，4，黃 丹，2，羅惠波，2，喬宗偉

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000；4.醉清風(fēng)酒業(yè)股份有限公司，四川 瀘州 646000）

食醋是一種由糯米、高粱、大米、玉米、小麥以及糖類發(fā)酵制成的酸味調(diào)味品，富含多種營養(yǎng)成分，如多酚類、黃酮類、川芎嗪等[1-2]，在抗癌、心血管疾病的預(yù)防方面也有很大作用[3]，可開發(fā)為功能食品，市場前景廣闊。四川麩醋是我國四大名醋之一，以麥麩為主要原料，藥曲為糖化發(fā)酵劑，糖化、酒精發(fā)酵和乙酸發(fā)酵同池進(jìn)行，并加以9次耖糟釀制而成[4-5]，其成品呈黑褐色、澄清、香味濃郁、酸味柔和[6]，可長時(shí)間儲(chǔ)存。

研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸是衡量食醋品質(zhì)的主要指標(biāo)[7]，影響食醋的口感和風(fēng)味。食醋中大部分有機(jī)酸來自發(fā)酵過程中的各種微生物代謝[8-10]，小部分是來源于釀造原料本身所具有的風(fēng)味。食醋中的有機(jī)酸有乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等[11]，不同地域釀造食醋的工藝、原料來源、地理環(huán)境以及氣候不同，造成有機(jī)酸的組成和含量均存在很大的差異[12]，但在各種食醋中，乳酸和乙酸始終是主要有機(jī)酸[13]，乙酸是醋中主要的酸味成分，乳酸可柔和醋酸刺激性氣味[14]，兩者含量可達(dá)到樣品總有機(jī)酸含量的80%以上[15]。此外，乳酸和乙酸還可與一些醇類結(jié)合生產(chǎn)酯，中間代謝產(chǎn)物丙酮還可作為其他風(fēng)味物質(zhì)的前體[16]，增加醋的風(fēng)味。蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱，廣泛應(yīng)用于食品加工。在食醋發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)分解不完全會(huì)產(chǎn)生沉淀[17]，蛋白酶能水解原料中的蛋白質(zhì)，促進(jìn)微生物生長及風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[18]，潘佩平等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶的存在可以提高淀粉的利用率、酒精發(fā)酵力。在酒精發(fā)酵階段或醋酸發(fā)酵階段加入酸性蛋白酶可以明顯提高醋醅中酸度和氨基酸態(tài)氮的含量[20]。

葡萄球菌（Staphylococcus）多存在于發(fā)酵制品中，在香腸發(fā)酵過程中，能促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的降解[21]，賦予香腸好的風(fēng)味，對(duì)色澤穩(wěn)定也起著重要作用。已有研究顯示，在鎮(zhèn)江香醋醋醅中存在葡萄球菌，且首次從醋醅中獲得了葡萄球菌純培養(yǎng)物[22]。CASABURI A等[23]對(duì)不同種類的葡萄球菌進(jìn)行蛋白酶活性分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)葡萄球菌可以產(chǎn)蛋白酶。董杰等[24]也研究發(fā)現(xiàn)，大部分葡萄球菌的蛋白酶活力雖然有限，但是對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用顯著。目前，對(duì)食醋微生物的研究多集中于醋酸菌和乳酸菌，葡萄球菌作為發(fā)酵香腸的主要微生物，在同為發(fā)酵產(chǎn)品的醋中也一定發(fā)揮了其獨(dú)特的作用。

本試驗(yàn)旨在從麩醋醋醅中篩選得到一株可產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶的無致病性葡萄球菌。對(duì)菌株的產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶能力進(jìn)行測定，并利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶條件進(jìn)行優(yōu)化。將菌株應(yīng)用于食醋固態(tài)發(fā)酵，探究菌株對(duì)食醋固態(tài)發(fā)酵的影響，這對(duì)豐富葡萄球菌在食醋釀造工藝中的應(yīng)用、探究醋醅中產(chǎn)酸菌株、提高食醋風(fēng)味均具有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

醋醅：采集自宜賓市某醋廠，在一個(gè)發(fā)酵池中的上、中、下三層的四個(gè)角及中心各取醋醅500 g，并將每層樣品充分混勻后的樣品置于無菌袋中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇、無水乙酸鈉、吐溫80、氯化鈉、冰乙酸（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；甘露醇、氯化鈣、L-酪氨酸、酪蛋白、福林-酚試劑、氫氧化鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸（分析純）、甲醇（色譜級(jí)）、乳酸、乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5g/L、氯化鈉10 g/L。

分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、碳酸鈣5 g/L、葡萄糖30 g/L、乙醇含量3.5%（V/V）、瓊脂粉20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、葡萄糖30 g/L、乙醇含量3.5%（V/V），調(diào)節(jié)pH 6.5。

蛋白酶活性鑒定培養(yǎng)基[25]：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、甘露醇10 g/L、氯化鈉25 g/L、瓊脂粉20 g/L。

甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、甘露醇10 g/L、酵母浸粉5 g/L、溴麝香草酚藍(lán)0.024 g/L。

醋固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[26]：30 g麩皮，10 g稻殼置于500 mL錐形瓶中。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

EX20光學(xué)顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；V-1000可見分光光度計(jì)：翱藝儀器（上海）有限公司；PR224ZH/E電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；TC-96/G/H（b）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州博日科技股份有限公司；DYY-6D電泳儀：北京六一生物科技有限公司；LC-2030 C 3D PLUS高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；pHS-3Cb酸度計(jì)：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

初篩：無菌條件下稱取10 g充分研磨的醋醅樣品，加入90 mL無菌生理鹽水中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 h，得到菌懸液。接種2%菌懸液于富集培養(yǎng)基，相同條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h。將富集后的菌液用無菌生理鹽水梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5梯度菌液各100 μL涂布于分離培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑選分離平板上產(chǎn)生透明圈的單個(gè)菌落，在分離培養(yǎng)基上多次劃線純化。將經(jīng)初篩得到的菌株劃線于蛋白酶活性鑒定培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍有無白色沉淀。

復(fù)篩：將篩選菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，采用HPLC法測定發(fā)酵液中乙酸、乳酸含量。

1.3.2 產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定

形態(tài)特征觀察：觀察平板上菌落的顏色、形狀、大小、隆起、平滑程度及邊緣特征，挑取處于生長對(duì)數(shù)期的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察。

分子生物學(xué)鑒定：DNA提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心吸附柱型）。以通用引物16S-27f和16S-1429r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測提取效果；將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送往擎科生物科技有限公司進(jìn)行基因測序。將測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）序列比對(duì)，再利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 安全性檢測

溶血實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[27]的方法進(jìn)行測定。

甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，取活化后的菌液1%接種于甘露醇發(fā)酵管（以金黃色葡萄球菌為對(duì)照），37℃孵育18～24 h，每隔6 h觀察發(fā)酵管顏色變化。

凝固酶實(shí)驗(yàn)：用接種環(huán)取活化后的菌液于滴加一滴生理鹽水的載玻片上，混合均勻后觀察有無自凝現(xiàn)象（以已知凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌為對(duì)照），若15 s內(nèi)無自凝，再加入1環(huán)兔新鮮血漿，混勻后觀察結(jié)果，5～10 s內(nèi)出現(xiàn)凝集則為陽性，反之則為陰性。

1.3.4 菌株生長特性研究

菌株生長曲線繪制：將活化后的菌液以2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取1 mL菌液適當(dāng)稀釋后，利用可見光分光光度計(jì)測定菌液在波長600 nm處的OD600nm值[28]。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

菌株最適生長條件優(yōu)化：將活化后的菌液以2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同培養(yǎng)溫度（22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）（用1 mol/L冰乙酸溶液調(diào)節(jié)）、初始乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%、0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%）、初始葡萄糖含量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液在波長600 nm處的吸光度值，確定菌株生長的最適條件。

1.3.5 菌株產(chǎn)酸能力測定

樣品處理：將分離得到的菌株接種到含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h后，取1 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min后取上清液，經(jīng)0.22 μL濾膜過濾后進(jìn)樣，利用HPLC法測定乳酸、乙酸產(chǎn)量。

標(biāo)品配制：準(zhǔn)確稱取色譜級(jí)乳酸、乙酸，以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為溶劑，配制成1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、100 mg/L、10 mg/L梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃條件下保存。

色譜條件：色譜柱為Agilent 5 HC-C18；流動(dòng)相為甲醇∶0.1%磷酸緩沖液=95∶5（V，V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測波長214 nm；等度洗脫。

1.3.6 菌株產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

蛋白酶活力測定：將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，取活化后的菌液1%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，最適生長條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。1 000 r/min離心5 min，收集上清液。利用福林-酚法[29]測定酸性蛋白酶活力，以酪蛋白為底物，將40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U/g）。

菌株產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)：將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在不同發(fā)酵溫度（20 ℃、25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、培養(yǎng)時(shí)間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h）和接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）條件下培養(yǎng)，其他條件參考最適生長條件。離心收集上清液，測定菌株在不同條件下的蛋白酶活性，平行3組。

菌株產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)：以發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、培養(yǎng)時(shí)間（X3）為自變量，蛋白酶活性（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（每組試驗(yàn)3組平行，結(jié)果取平均值）。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 菌株產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for protease production conditions optimization of strain

1.3.7 葡萄球菌D-6在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

將活化后的菌液以2%的接種量接種于食醋固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，于最適生長條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d，測定培養(yǎng)基中pH、總酸和氨基酸態(tài)氮的含量[30-31]，以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基作對(duì)照。同時(shí)收集發(fā)酵液，處理后按1.3.5方法測定乳酸、乙酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及形態(tài)學(xué)觀察

樣品經(jīng)初篩得到3株有透明圈菌落，劃線于蛋白酶活性鑒定培養(yǎng)基，一株菌在蛋白酶活性鑒定培養(yǎng)基上形成白色沉淀，將其命名為D-6，后續(xù)試驗(yàn)中均以菌株D-6作為出發(fā)菌株。對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株D-6在平板上呈圓形，白色不透明，表面光滑；為革蘭氏陽性菌，菌體為球形。

圖1 菌株D-6的革蘭氏染色(a)及電鏡掃描(b)結(jié)果Fig.1 Results of Gram staining (a) and electron microscope scanning(b) of strain D-6

經(jīng)HPLC測定，菌株D-6發(fā)酵液中乙酸含量為157.2mg/L，乳酸含量為8 434.4 mg/L。表明菌株D-6可產(chǎn)乙酸、乳酸，對(duì)增加食醋中有機(jī)酸含量有積極作用。

2.2 菌株D-6的鑒定

由圖2可知，菌株D-6經(jīng)PCR擴(kuò)增得到堿基大小在1500bp左右的亮帶。測序結(jié)果用Contig Express拼接，去除兩端不準(zhǔn)的部分，將拼接好的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株D-6與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的進(jìn)化距離最近。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA序列分析的結(jié)果，將菌株D-6鑒定為表皮葡萄球菌。

圖2 菌株D-6 16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification product of strain D-6

2.3 菌株D-6安全性檢測

葡萄球菌可分為致病性和非致病性兩類，為保證菌株的安全性，對(duì)菌株D-6進(jìn)行安全性檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株D-6溶血實(shí)驗(yàn)、凝固酶實(shí)驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為為陰性，說明菌株無致病性。

表2 菌株D-6安全性檢測結(jié)果Table 2 Safety test results of strain D-6

2.4 菌株D-6生長特性研究

2.4.1 生長曲線

由圖4可知，菌株D-6在0～6 h 為生長延滯期，增長緩慢；6～20 h為對(duì)數(shù)生長期，活菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)快速升高；22～26 h處于穩(wěn)定生長期，菌群總數(shù)保持穩(wěn)定；26 h 后開始進(jìn)入衰亡期。因此，確定菌株D-6最適生長時(shí)間為22～26 h。

圖4 菌株D-6的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain D-6

2.4.2 菌株D-6最適生長條件

由圖5a可知，在最適培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，37 ℃時(shí)菌株D-6在波長600 nm處的吸光度值最大，且基本與菌株生長曲線穩(wěn)定期OD600nm值一致，因此菌株D-6生長的最適溫度為37 ℃。由圖5b可知，在pH 2.5～5.5的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，菌株D-6的OD600nm值逐漸增大；當(dāng)pH＞5.5時(shí)，OD600nm值開始下降，因此菌株D-6的最適生長pH值為5.5。由圖5c可知，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)＞0.5%會(huì)抑制菌株的生長，且抑制作用較為明顯，適當(dāng)濃度的乙醇溶液有利于菌株進(jìn)行合成代謝，乙醇溶液濃度過大，會(huì)對(duì)菌株的細(xì)胞膜造成破壞，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。由圖5d可知，初始葡萄糖含量為1%～3%時(shí)，菌株的OD600nm值隨葡萄糖含量的升高逐漸上升，葡萄糖含量為3%時(shí)，OD600nm值達(dá)到最大值；當(dāng)葡萄糖含量＞3%時(shí)，OD600nm值下降緩慢，菌液的濃度逐漸降低，因此菌株的最適生長葡萄糖含量為3%。綜合可知，菌株D-6的最適生長條件為培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH值為5.5，乙醇體積分?jǐn)?shù)0.5%，葡萄糖含量3%。

圖5 培養(yǎng)溫度（a）、初始pH值（b）、初始乙醇體積分?jǐn)?shù)（c）、初始葡萄糖含量（d）對(duì)菌株D-6生長的影響Fig.5 Effects of culture temperature (a), initial pH (b), initial ethanol volume fraction (c), initial glucose contents (d) on the growth of strain D-6

2.5 菌株D-6產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化

2.5.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)蛋白酶活性的影響

由圖6a可知，蛋白酶活力隨發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到34.88 U/g。發(fā)酵溫度高于35 ℃后，由于溫度過高導(dǎo)致蛋白酶失活，蛋白酶活力下降；因此選擇發(fā)酵溫度為35 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖6b可知，接種量1%～4%范圍內(nèi)時(shí)，蛋白酶活力大小隨接種量的升高而增大；接種量為4%時(shí)，蛋白酶活力為33.98 U/g；當(dāng)接種量＞4%時(shí)，蛋白酶活力呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于過多的菌體導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，且菌液的溶氧濃度有限，導(dǎo)致部分菌體死亡。此時(shí)再增加接種量，菌體也不會(huì)生長；由圖6c可知，在0～40 h發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌株蛋白酶活力逐漸升高，發(fā)酵時(shí)間到40 h時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最大值35.57 U/g，發(fā)酵時(shí)間＞40 h后，營養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致蛋白酶活力下降。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為40 h。

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of different culture conditions on protease activities

2.5.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到菌株D的蛋白酶活力Y對(duì)發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、培養(yǎng)時(shí)間（X3）的多項(xiàng)回歸方程Y=35.45+3.05X1-1.15X2+3.88X3-1.23X1X2+1.44X1X3-1.66X2X3-9.03X12-5.21X22-6.07X32。

中心組合試驗(yàn)的方差分析見表4。由表4可知，模型的F值為114.27，P＜0.01，說明該模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.100 5（P＞0.05），表現(xiàn)為不顯著，說明回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好。模型決定系數(shù)R2=0.993 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.984 5，說明利用該方程來代替實(shí)際試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析具有合理性。由P值可知，一次項(xiàng)X1、X3對(duì)蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01），X2對(duì)蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），X2X3對(duì)蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01）。通過比較F值，3個(gè)因素對(duì)蛋白酶活性的影響大小依次為培養(yǎng)時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的兩兩因素間交互作用對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖7。由圖7可知，培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間兩兩間交互作用的響應(yīng)面圖存在最高點(diǎn)，說明在選定的接種量、培養(yǎng)時(shí)間和發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，蛋白酶活性存在最大值，兩兩因素間交互作用對(duì)蛋白酶活力影響顯著，與表4方差分析結(jié)論一致。

圖7 兩因素間交互作用對(duì)蛋白酶活性影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between two factors on protease activity

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得出菌株D-6的最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度36.18 ℃，接種量4.08%，培養(yǎng)時(shí)間41.16 h，此條件下菌株D-6產(chǎn)蛋白酶活為36.21 U/g?？紤]到實(shí)際操作情況，將發(fā)酵條件修正為培養(yǎng)溫度36 ℃，接種量4%，培養(yǎng)時(shí)間41 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，蛋白酶活性為36.12 U/g，與預(yù)測值的相對(duì)誤差較小，說明該模型準(zhǔn)確可靠。優(yōu)化后相比優(yōu)化前（24.20 U/g）蛋白酶活力提高了49.25%。

2.6 葡萄球菌D-6在食醋生產(chǎn)中的應(yīng)用

固態(tài)發(fā)酵后測定pH、總酸、氨基酸態(tài)氮以及有機(jī)酸含量，結(jié)果見表5。

表5 固態(tài)發(fā)酵食醋理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical indexes of solid-state fermented vinegar

由表5可知，接種葡萄球菌D-6進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，體系中pH減小，總酸含量增大，氨基酸態(tài)氮含量增大，乙酸、乳酸含量較未加種子液均有增加。氨基酸態(tài)氮可以作為釀造醋發(fā)酵程度的特性指標(biāo)[32]，由此可見，葡萄球菌D-6應(yīng)用于食醋固態(tài)發(fā)酵可以增加pH、總酸、氨基酸態(tài)氮及有機(jī)酸含量，對(duì)食醋生產(chǎn)有積極作用。

3 結(jié)論

利用透明圈法和高效液相色譜法（HPLC）從麩醋醋醅中篩選得到一株產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶、無致病性的表皮葡萄球菌，最適生長條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH 5.5，初始葡萄糖含量3%，初始乙醇體積分?jǐn)?shù)0.5%；發(fā)酵后測定有機(jī)酸含量，乙酸含量為157.2 mg/L，乳酸含量為8 434.4 mg/L；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，該菌株在溫度36 ℃，接種量4%，培養(yǎng)時(shí)間41 h時(shí)蛋白酶活性最大。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，蛋白酶活性為36.12 U/g，較優(yōu)化前蛋白酶活力提高了49.25%。將其應(yīng)用于食醋固態(tài)發(fā)酵，總酸、氨基酸態(tài)氮以及乳酸、乙酸含量都有所增加。本研究對(duì)探究醋醅中產(chǎn)酸菌株、提高食醋風(fēng)味、豐富菌種資源具有積極作用，為釀醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供更多菌種選擇，也為之后醋的風(fēng)味改良提供一個(gè)新思路。