桑果中非釀酒酵母的分離鑒定及混菌發(fā)酵果酒研究

王香君，蒲 軍，夏文銀，吳勁軒，夏川林，殷 浩*，張 帆，張 濤

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000；2.四川上嘉農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 南充 637000；3.南充市綠盛農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 南充 637978）

桑果（Morusspp.）是衛(wèi)生部公布的首批“藥食同源”農(nóng)產(chǎn)品之一，富含花青素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)功能成分，具有抗氧化、抗炎等作用[1-2]?！侗静菥V目》曾記載“桑椹搗汁飲，解酒中毒；釀酒服，利水氣，消腫”，桑果酒具有桑果和生物發(fā)酵的雙重營養(yǎng)成分[3]。

新鮮桑果轉(zhuǎn)化為桑果酒是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)和生化過程，其涉及酵母菌、細(xì)菌、霉菌等多種微生物，它們對果酒風(fēng)味的復(fù)雜性起著重要作用[4]。國外研究認(rèn)為由酵母菌引起的酒精發(fā)酵是釀酒的關(guān)鍵，多年來一直集中分離、選擇本地傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)酵母來提高葡萄酒質(zhì)量[5]。目前我國果酒發(fā)酵多數(shù)仍使用商業(yè)葡萄酒活性干酵母，但桑果與葡萄在營養(yǎng)成分上差異較大，僅使用活性干酵母嚴(yán)重抑制桑果中非釀酒酵母的活性，導(dǎo)致不同類型果酒產(chǎn)品同質(zhì)化，不能有效突出桑果特有風(fēng)味[6]。

大量研究表明，葡萄酒釀制過程中非釀酒酵母通過與釀酒酵母共同發(fā)酵來控制酒體不理想的風(fēng)味或者降低酒精度來賦予葡萄酒復(fù)雜的香氣，并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生高級醇、低級脂肪酸和酯類等芳香化合物，突出果酒酒體的典型性[7]。ZHAO Y等[8]分析了葡萄酒自然發(fā)酵過程中非釀酒酵母的多樣性，發(fā)現(xiàn)地區(qū)獨(dú)有7種非釀酒酵母，它們可能在區(qū)域葡萄酒特征中發(fā)揮重要作用。BINATI R L等[9-10]用桿狀世達(dá)梅樂酵母（Starmerella bacillaris）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）等非釀酒酵母純種發(fā)酵葡萄汁，得出非釀酒酵母不能進(jìn)行完整的酒精發(fā)酵，需要與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發(fā)酵。研究也得出接種多種非釀酒酵母有助于提高工業(yè)葡萄酒的香氣多樣性和品質(zhì)[11]。因此，多位學(xué)者在葡萄自然發(fā)酵過程中篩選優(yōu)質(zhì)非釀酒酵母，并運(yùn)用非釀酒酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵改善葡萄酒感官特性[12-16]。VARELA C等[17]用美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母混菌發(fā)酵生產(chǎn)低酒精度的葡萄酒（比單一釀酒酵母發(fā)酵的低1.7%vol）。LEE S B等[18]將釀酒酵母和非釀酒酵母通過鼓風(fēng)干燥制作成復(fù)合發(fā)酵劑。越來越多的本地非釀酒酵母用于增加葡萄酒的復(fù)雜性和地域性。針對桑果酒中的酵母菌也開展了多項(xiàng)研究，孫時(shí)光等[19]從桑果中分離出一株產(chǎn)高級醇的釀酒酵母，產(chǎn)高級醇312.41 mg/L；趙祥杰等[20]從桑果、桑葉及桑果園土壤中篩選出一株優(yōu)良釀酒酵母，但鮮有從本地桑果資源中分離野生非釀酒酵母的研究。

本研究從桑果資源中分離產(chǎn)香優(yōu)良的野生非釀酒酵母，采用嗅覺識別、形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合18S rRNA基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進(jìn)行鑒定，并對菌株進(jìn)行耐受性和桑果酒發(fā)酵性能分析，以期為本地酵母在桑果酒發(fā)酵中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與培養(yǎng)基

新鮮桑果（品種“嘉陵30”、“粵椹大十”）：四川省南充市嘉陵區(qū)新廟鄉(xiāng)；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

細(xì)菌/真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：ZYMO RESEARCH生物科技公司：果膠酶（＞22 500 AJDU/g）：煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司；乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司；磷酸（分析純）：茂名市雄大化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LZ-0.5螺旋榨汁機(jī)：溫州揚(yáng)名機(jī)械有限公司；BSA224S電子分析天平：德國賽多利斯公司；上海雷磁PHS-25臺式精密酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；Verity 96well聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；FR-980A凝膠成像儀：上海復(fù)日科技有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)液與模擬桑果汁的制備

菌種培養(yǎng)液：新鮮桑果（品種“粵椹大十”）破碎后去渣留汁，分別分裝200 mL汁于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌15 min。

模擬桑果汁：新鮮桑果（品種“粵椹大十”）破碎，加二氧化硫（90 mg/L）混勻，2 h后添加果膠酶（20 mg/L）混勻，6 h后過濾得桑果汁，用白砂糖調(diào)節(jié)桑果汁的葡萄糖質(zhì)量濃度至220 g/L，再分別分裝2 L汁于3 L于發(fā)酵瓶中，100 ℃滅菌10 min，冷卻至室溫備用。高糖桑果汁調(diào)整葡萄糖質(zhì)量濃度至330 g/L。

1.3.2 非釀酒酵母的篩選

課題組前期已采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）測序技術(shù)得出不同處理桑果表面的真菌群落結(jié)構(gòu)，得出-1 ℃貯藏4 d、常溫貯藏4 d的桑果樣品中非釀酒酵母的相對豐度較高。因此，分別取-1 ℃貯藏4 d、常溫貯藏4 d的桑果樣品10 g置于YPD液體培養(yǎng)基中24 ℃培養(yǎng)，分別取發(fā)酵0 d、2 d的菌種培養(yǎng)液及發(fā)酵6 d菌種培養(yǎng)液的酒泥作為各非釀酒酵母菌屬的篩選樣品。將-1 ℃貯藏4 d的菌種培養(yǎng)液各階段取樣進(jìn)行10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋；將常溫貯藏4 d的菌種培養(yǎng)液各階段取樣進(jìn)行10-8、10-9、10-10、10-11梯度稀釋。涂布于YPD固體培養(yǎng)基（含10%葡萄糖）上，28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取具有酵母菌菌落形態(tài)特征的菌落經(jīng)2～3次分離純化，直至鏡檢為純種并編號。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定：通過形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行菌株的鑒定[21-22]。挑取單菌落進(jìn)行制片和草酸銨結(jié)晶紫染色，顯微鏡鏡檢觀察。

（2）生化鑒定：選擇具有各酵母菌細(xì)胞形態(tài)和生殖方式的單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h，通過嗅聞法[23-24]判斷培養(yǎng)基產(chǎn)氣和氣味情況，篩選產(chǎn)氣、有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。

（3）分子生物學(xué)鑒定：用細(xì)菌/真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA，-18 ℃儲藏備用。用通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS6（5'-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3'）對菌株的18S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考馬文錦等[25]的方法，再電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。將測序結(jié)果在NCBI上的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，用MEGA7.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 篩選菌株的耐受性研究

對篩選菌株進(jìn)行糖度、SO2、酸度、酒精度及溫度耐受性試驗(yàn)。分別制備不同葡萄糖質(zhì)量濃度（150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L），SO2質(zhì)量濃度（50 mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L），pH（2、3、4、5），酒精度（5%vol、10%vol、15%vol、20%vol）的滅菌YPD液體培養(yǎng)基，分別接種篩選菌株，使培養(yǎng)基中各菌株生物量達(dá)106CFU/mL，再分別置于10℃、20℃、30℃、40℃條件下靜置培養(yǎng)4d，在波長600nm處測定菌懸液的吸光度值，平行重復(fù)3次，并做空白對照。

1.3.5 高糖條件菌株的發(fā)酵性能

研究篩選菌株在葡萄糖質(zhì)量濃度330 g/L（參考市面自然發(fā)酵果酒的最高酒精度換算得出）的桑果汁中的發(fā)酵性能。菌株按照葡萄汁有孢漢遜酵母∶釀酒酵母=105∶107CFU/mL（發(fā)酵液2），克魯維畢赤酵母∶釀酒酵母=105∶107CFU/mL（發(fā)酵液3），葡萄汁有孢漢遜酵母∶克魯維畢赤酵母∶釀酒酵母=105∶105∶107CFU/mL（發(fā)酵液4）接種于葡萄糖質(zhì)量濃度330 g/L的桑果汁中，24 ℃發(fā)酵6 d分離酒腳，取上清液測定理化指標(biāo)，以接種107CFU/mL釀酒酵母（發(fā)酵液1）為空白對照[26]。

1.3.6 桑果酒的制備

將葡萄汁有孢漢遜酵母∶克魯維畢赤酵母∶釀酒酵母=105∶105∶107CFU/mL（HJ）接種于模擬桑果汁中，24 ℃發(fā)酵6 d分離酒腳，過濾得桑果酒，測定桑果酒理化指標(biāo)，以釀酒酵母接種量107CFU/mL（DY）為空白對照。

1.3.7 分析檢測

（1）理化指標(biāo)

pH值的測定采用pH計(jì)法；干浸出物、總糖（以葡萄糖計(jì)）、總酸（以酒石酸計(jì)）、揮發(fā)酸、酒精度的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酯的測定參照GB/T 27588—2011《露酒》。

（2）甲醇及乳酸含量

甲醇含量的測定：參照GB/T 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》中氣相色譜法；乳酸含量的測定：參照GB/T 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測定》中高效液相色譜法。

（3）揮發(fā)性風(fēng)味成分

采用固相微萃?。╯olid-phase micro extraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法。準(zhǔn)確稱取樣品5 g于頂空進(jìn)樣瓶中。將SPME針管插入樣品瓶中進(jìn)行萃取，萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間30 min，后取出萃取頭，立即插入色譜儀進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸3 min后進(jìn)行色譜和質(zhì)譜分析。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃。升溫程序：起始溫度60 ℃，保持2min，以5℃/min上升至110℃，保持2min，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：5975C型四極桿質(zhì)譜儀，采用電子轟擊離子源（electron impact ionization，EI），電子能量為70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍：45～550 m/z。

定性定量方法：將采集的質(zhì)譜圖利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.L譜庫進(jìn)行檢索定性，用氣相色譜峰面積歸一法計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

測定和分析結(jié)果采Excel 2007和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式，P＜0.05認(rèn)為具有顯著差異。采用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

從-1℃貯藏4d桑果樣品中篩選菌株2株，編號為S006-01、S006-02；從常溫貯藏4 d桑果樣品中篩選菌株3株，編號為S007-01、S007-02、S007-03。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定及生化鑒定

篩選菌株中代表菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖1，嗅聞結(jié)果見表1。

表1 篩選菌株的嗅聞結(jié)果Table 1 Sniffing results of the screened strains

圖1 代表菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of the representative strains

菌株S006-01、S006-02在YPD固體培養(yǎng)基上菌落均為乳白色、有光澤、邊緣整齊、凸起、表面濕潤；染色均顯示細(xì)胞呈檸檬形，無性繁殖，細(xì)胞兩極性出芽（見圖1 A1、B1）。菌株S007-01、S007-02、S007-03在YPD固體培養(yǎng)基上菌落白色、表面不光滑無光澤、菌落圓形但邊緣不整齊有小齒狀（見圖1 A2），染色顯示細(xì)胞均為卵圓形或橢圓形，有性生殖，產(chǎn)生子囊，每個(gè)子囊內(nèi)含1～4枚形狀不一的子囊孢子（見圖1 B2）。由表1嗅聞鑒定結(jié)果可知，5株菌均產(chǎn)氣，有酒味，其中菌株S007-01、S007-02、S007-03在培養(yǎng)液表面形成一層白色浮膜，有較濃酯香；而菌株S006-01、S006-02酯香味較淡。通過菌落形態(tài)和嗅聞法初步得出，篩選菌株具有酵母菌的細(xì)胞形態(tài)和生理生化特性，均能產(chǎn)生酒香，且多數(shù)菌株能產(chǎn)生特征香氣成分。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，菌株S006-01、S006-02與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）在同一分支上，菌株S007-01、S007-02、S007-03與克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）在同一分支上。結(jié)合形態(tài)學(xué)、嗅聞、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可鑒定S006-01、S006-02為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），S007-01、S007-02、S007-03為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）。

圖2 基于18S rDNA基因序列篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of screened strains based on the 18S rDNA gene sequences

2.3 篩選菌株的耐受性研究

對篩選的5株菌進(jìn)行溫度、糖度、SO2、pH、酒精度耐受性試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 篩選菌株的耐受性分析結(jié)果Fig.3 Results of tolerance analysis of screened strains

由圖3A可知，溫度對菌株S006-01、S006-02影響較大，高低溫均會抑制其生長，其在30 ℃生長較好；菌株S007-01、S007-02可耐40 ℃高溫，但不耐10 ℃低溫，而S007-03耐高低溫，3株菌在20～30 ℃均生長旺盛。由圖3B可知，5株菌在400g/L的葡萄糖質(zhì)量濃度下仍能生長，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度增加，菌株的OD600nm值與其呈負(fù)相關(guān)，高糖對菌株S006-01、S006-02的影響較大。由圖3C可知，5株菌在含50～200 mg/L SO2的培養(yǎng)基中均能生長，其中菌株S007-01、S007-02、S007-03耐SO2的能力較強(qiáng)，而菌株S006-01、S006-02耐SO2的能力較弱，以S006-01的耐受性最弱。由圖3D可知，5株菌均能在低pH值環(huán)境下生長，其中菌株S007-01、S007-02、S007-03耐低pH的能力較強(qiáng)，而菌株S006-01、S006-02不耐低酸，以菌株S006-01在低酸環(huán)境中生長最弱。由圖3E可知，菌株S007-03耐酒精能力最強(qiáng)，能在酒精度5%vol的培養(yǎng)液中旺盛生長，其余4株菌對酒精具有不耐受性，這充分說明多數(shù)非釀酒酵母對酒精敏感，只存在于發(fā)酵的早期階段[27]。因此如果在桑果酒發(fā)酵過程中采用葡萄酒用活性干酵母快速提升桑果汁的酒精度，會大量抑制桑果資源中非釀酒酵母的生長。

綜上所述，菌株S007-03能在酒精度5%vol的培養(yǎng)液中旺盛生長，且對溫度、糖、SO2、酸具有很好的耐受性，而菌株S007-01、S007-02隨著酒精度的增加，其生長受到抑制；菌株S006-02耐SO2、耐酸能力顯著高于菌株S006-01，故菌株S006-01不適合桑果酒酸性、含SO2的發(fā)酵環(huán)境。因此選擇菌株S006-02、S007-03作為優(yōu)良酵母菌進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 不同組合菌株在高糖桑果汁中發(fā)酵性能研究

在高糖桑果汁中接種菌株S006-02、S007-03，研究其是否促進(jìn)桑果酒的發(fā)酵，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株S006-02、S007-03能在葡萄糖質(zhì)量濃度330 g/L的桑果汁中生長發(fā)酵，且其均能促進(jìn)桑果酒乙醇的生成，果酒酒精度均在13%vol以上，比單一釀酒酵母發(fā)酵（發(fā)酵液1）的高2%vol。經(jīng)方差分析得出，相較發(fā)酵液1，發(fā)酵液4在酒精度、總酯增加方面有顯著差異（P＜0.05），相較發(fā)酵液2和發(fā)酵液3，發(fā)酵液4在干浸出物、總酯增加方面有顯著差異（P＜0.05），而發(fā)酵液2、發(fā)酵液3中總糖、乳酸含量顯著高于其他樣品（P＜0.05），可推測菌株S006-02與S007-03具有協(xié)同發(fā)酵作用。WEI J P等[28]得出不同非釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)，克魯維畢赤酵母和葡萄園有孢漢遜酵母的生長相互影響，葡萄園有孢漢遜酵母比克魯維畢赤酵母消耗更多糖分，LIU S X等[29]也得出混菌發(fā)酵生產(chǎn)的越桔葡萄酒酒精度更高，與本研究結(jié)果一致。因此該研究表明，在高糖含量下，S006-02、S007-03可與釀酒酵母混菌發(fā)酵促進(jìn)果酒發(fā)酵，且在降低揮發(fā)酸和生成酒精方面優(yōu)于S006-02單一非釀酒酵母與酵母混菌發(fā)酵以及釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵。

表2 高糖桑果汁中篩選菌株的發(fā)酵性能分析Table 2 Analysis of fermentation performance of selected strains from mulberry juice with high sugar content

2.5 桑果酒指標(biāo)的測定

2.5.1 理化指標(biāo)測定

在模擬桑果汁中接種菌株S006-02、S007-03和釀酒酵母，與單一釀酒酵母發(fā)酵的酒樣進(jìn)行對比，分析非釀酒酵母發(fā)酵對桑果酒成分的影響，結(jié)果見表3。

表3 模擬桑果汁接種發(fā)酵后各成分變化Table 3 Changes of components of simulated mulberry juice after inoculation and fermentation

由表3可知，單一釀酒酵母發(fā)酵酒樣（DY）中總糖、總酸顯著高于接種S006-02、S007-03和釀酒酵母混菌發(fā)酵酒樣（HJ）（P＜0.05），而酒精度低于HJ，但不顯著（P＞0.05），可知多種非釀酒酵母發(fā)酵利于總酸的降低和乙醇的生成。HJ酒樣中揮發(fā)酸＜1 g/L，總酸＜8.85 g/L，遠(yuǎn)低于表2中各發(fā)酵液的揮發(fā)酸和總酸，可知高糖會促使釀酒酵母產(chǎn)生高質(zhì)量濃度的總酸和揮發(fā)酸，推測可能是酵母為適應(yīng)高糖濃度引起的高滲透壓環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)酶外溢發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致果酒總酸和揮發(fā)酸增加。

2.5.2 桑果酒揮發(fā)性成分測定

對篩選菌株發(fā)酵的酒樣中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 酵母菌株發(fā)酵桑果酒揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of volatile components of mulberry fruit wine fermented by yeast strain analyzed by GC-MS

由表4可知，經(jīng)GC-MS分析和鑒定，2個(gè)酒樣中共檢出揮發(fā)性成分76種，接種菌株S006-02、S007-03和釀酒酵母混菌發(fā)酵酒樣（HJ）中有揮發(fā)性成分60種，而單一釀酒酵母發(fā)酵酒樣（DY）中僅有53種。酯類、醇類是2個(gè)酒樣中最主要的揮發(fā)性組分，酯類的相對含量最高，達(dá)83%以上。2個(gè)酒樣共有酯類19種，HJ中酯類比DY多7種，相對含量提高0.75%；共有醇類2種，HJ中醇類比DY多3種，相對含量提高0.08%；共有酸類2種，相對含量降低0.53%；其他共有烴類13種，醛類1種。可見，多種非釀酒酵母和釀酒酵母混菌發(fā)酵可增加桑果酒酯類、醇類物質(zhì)種類和相對含量。

酯類物質(zhì)是果酒的重要香氣成分，大多數(shù)酯類具有花果香氣，對酒體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[30]。2個(gè)酒樣中酯類物質(zhì)中相對含量較高的是辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯，HJ酒樣中酯類物質(zhì)相對含量分布較均勻，月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯相對含量比DY的高，這些酯類感官表現(xiàn)為酯香、果香、奶油香，使桑果酒香氣更濃郁飽滿[31]。新增酯類主要是乙基9-癸烯酸酯、丁酸異戊酯等呈果香、乳香的酯類。

2個(gè)酒樣中醇類物質(zhì)主要集中在苯乙醇，苯乙醇具有玫瑰花香。HJ酒樣中新增醇類主要是（-）-4-萜品醇等帶有壤香、木香的高級醇，少量的高級醇可增加果酒香氣復(fù)雜性，有協(xié)調(diào)平衡作用，以構(gòu)成酒的不同風(fēng)格[32]。

雖然2個(gè)酒樣中檢出的烴類物質(zhì)種類較多（共檢出烴類物質(zhì)29種），但每種烴類的相對含量均較低，相對含量＞1%的烴類物質(zhì)主要集中在烷烴類，其中HJ酒樣中獨(dú)有（乙酰氧基乙基）三甲基硅烷、植烷，植烷被認(rèn)為是構(gòu)成茅臺醬香型酒糟香氣的主要成分之一[33]。酸類、醛類、酮類物質(zhì)的相對含量較低，僅HJ酒樣中檢測出酮類物質(zhì)?？傻贸鯤J酒樣中香氣豐富度優(yōu)于DY。

3 結(jié)論

本研究從本土桑果資源中篩選出產(chǎn)香優(yōu)良的非釀酒酵母5株，編號為S006-01、S006-02、S007-01、S007-02、S007-03，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株S006-01、S006-02為有葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），菌株S007-01、S007-02、S007-03為克魯維畢赤酵母（Pichiakluyveri）。菌株耐受性研究表明，2株葡萄汁有孢漢遜酵母中，菌株S006-01對SO2、酸具有不耐受性，而3株克魯維畢赤酵母對溫度、糖度、SO2、酸具有耐受性，其中菌株S007-03在耐酒精方面較突出，其能在酒精度5%vol的培養(yǎng)液中旺盛生長，其余菌株對酒精具有不耐受性。葡萄糖質(zhì)量濃度330 g/L的桑果汁中，菌株S006-02、S007-03與釀酒酵母按照105∶105∶107CFU/mL混菌發(fā)酵能促進(jìn)桑果酒的發(fā)酵，顯著提高桑果酒酒精度（P＜0.05）。模擬桑果汁中，酯類和醇類是其最主要的兩類揮發(fā)性組分，菌株S006-02、S007-03與釀酒酵母混菌發(fā)酵能促進(jìn)酯類、醇類相對含量和種類的提高。因此，篩選菌株葡萄汁有孢漢遜酵母S006-02、克魯維畢赤酵母S007-03與釀酒酵母混菌發(fā)酵能豐富果酒香氣，使桑果酒香氣更濃郁飽滿。