陳富章,院珍珍,2*,金蘇宇,李雅倩,宋曉凡,孫康娜,韓麗娟,葉 英
(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)
地皮菜(Nostoc commune)為念珠藻屬[1],又名地衣,呈現(xiàn)藍(lán)墨色;通常在雨后大量出現(xiàn),喜歡潮濕的環(huán)境,全國各地均有分布[2]。且其抗干旱能力較強(qiáng),干旱情況下可以長期休眠[3]。地皮菜維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)元素含量豐富[4],氨基酸種類較多,易于被人體吸收利用。其不僅能為人體提供日常所需能量,還有清熱明目、通便潤腸[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抑菌[8]、抗氧化[9]等作用,可作為一種潛在的天然功能性食品資源[4]。地皮菜屬于固氮藍(lán)藻,不僅能進(jìn)行光合作用,還能將大氣中的氮固定,為其他生物提供肥料,疏松土質(zhì),促進(jìn)植物生長[10]。地皮菜在環(huán)境修復(fù)、污水處理方面也有良好的應(yīng)用,可以用來吸收重金屬和放射性元素[11],改善被破壞的土壤[12]。
由于外界及自身因素,人體內(nèi)不斷產(chǎn)生自由基,這對(duì)人體造成很大危害,而且可能會(huì)引發(fā)許多并發(fā)癥,研究抗氧化可以有效克服其所帶來的危害[13-14]。地皮菜中含有多糖[15]、黃酮[16]、多酚[17]、三萜[18]等生物活性物質(zhì),具有一定的抗氧化功效。王迎進(jìn)等[19]研究表明,地皮菜提取液具有抗氧化和抑菌作用。目前,對(duì)于抑菌活性的檢測主要是通過濾紙片法[20]來實(shí)現(xiàn)的,如趙雷等[21]通過濾紙片法得出,藜麥麩皮的正丁醇萃取層的抑菌活性最高,并得出其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度;蔡依等[22]通過濾紙片法得出陽荷的不同極性部位萃取物對(duì)于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌能力,分析得出了陽荷對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜抑菌活性;廖金梅等[23]通過濾紙片法研究了黃皮等23種植物的甲醇提取物對(duì)8種植物病原真菌和9種動(dòng)物病原細(xì)菌的抑制作用,得出黃皮葉在植物源抑菌劑方面具有較好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的結(jié)論。本研究對(duì)地皮菜不同極性部位活性成分含量及抗氧化活性進(jìn)行測定和比較,為進(jìn)一步研究地皮菜活性成分提供參考,并為開發(fā)利用地皮菜提供科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 材料和菌株
地皮菜:青海海東市綠品源商貿(mào)有限公司。大腸埃希式菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis):廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.1.2 試劑
無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(均為分析純):天津市富宇精細(xì)化工有限公司;沒食子酸、維生素C(vitamin C,VC)(純度均>98%):上海展云化工有限公司;2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、Na2HPO4、NaH2PO4、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、三氯乙酸、三氯化鐵(均為分析純)、蘆丁、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>95%):上海阿拉丁生物科技股份有限公司;體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限公司:LB固體培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂。培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃滅菌30 min。
固體培養(yǎng)基制備:與液體培養(yǎng)基相似,取LB肉湯2.0 g溶于100 mL水中,加入1.5 g的瓊脂,混勻后放入滅菌鍋中121 ℃下滅菌30 min,取出放在無菌臺(tái)中備用。
200T多功能粉碎機(jī):永康市鉑歐五金制品有限公司;HH6數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州市金坦友聯(lián)儀器研究所;KQ-300E超聲波清洗機(jī):東莞市科橋超聲波清洗器;FA2004B電子天平:上海佑科儀器儀表有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;UV1780紫外可見分光光度計(jì):島精儀器有限公司;H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī):湖南赫西儀器裝備有限公司;FSP120-AAAN2光吸收酶標(biāo)儀:全漢企業(yè)股份有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YM50立式壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司。
1.3.1 地皮菜不同極性部位樣品
將地皮菜于45 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量,研磨成粉,過60目篩,裝入紗布袋中,在溫度60 ℃、料液比1∶25(g∶mL)條件下,用3種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(95%、80%、65%)在超聲功率320 W狀態(tài)下超聲提取2次,每次提取時(shí)間為1 h。將2次提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀合并濃縮至浸膏狀,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇常溫下進(jìn)行萃取,萃取時(shí)間為0.5 h,得到不同極性部位萃取樣品,剩余為水相樣品。
1.3.2 活性成分含量的測定
(1)總?cè)?/p>
按照宋曉凡等[24]的方法繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度值(Y)與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X,mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=75.26X+0.007 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>
總?cè)频寐?總?cè)坪?樣品質(zhì)量×100%。
(2)總黃酮
按照宋曉凡[16]等的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度值(Y)與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X,mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得線性回歸方程Y=12.39X+0.000 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮含量。
總黃酮得率=總黃酮含量/樣品質(zhì)量×100%。
(3)總多酚
參考景炳年等[25]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值(Y)與質(zhì)量濃度(X,mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=249.64X+0.043 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多酚含量。
總多酚得率=總多酚含量/樣品質(zhì)量×100%。
1.3.3 體外抗氧化活性測定方法
ABTS+、DPPH自由基清除能力、還原能力:按宋曉凡等[16]的方法測定;超氧陰離子自由基清除率按尼格爾熱依·亞迪卡爾等[26]的方法測定。
1.3.4 體外抑菌活性測定方法
(1)菌種活化及菌懸液制備
用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精擦拭存放大腸埃希式菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試劑瓶,從中取出少量干燥菌種于LB液體培養(yǎng)基中,振蕩混勻后取少量菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h。
取3個(gè)100 mL用超凈臺(tái)紫外燈滅菌30 min的錐形瓶,裝入30 mL無菌的LB液體培養(yǎng)基,分別用接菌環(huán)在LB固體培養(yǎng)基均勻刮取一環(huán)已經(jīng)活化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置于錐形瓶中,封口放入搖床,160 r/min振蕩培養(yǎng),制成1×108CFU/mL的菌懸液。培養(yǎng)完成后,放在4 ℃冰箱中備用。
(2)濾紙片制備
取四個(gè)極性萃取部位的浸膏于試管中,用無菌蒸餾水配制成質(zhì)量濃度64 mg/mL的溶液,再利用二倍稀釋法[21]將地皮菜的不同極性部位配制為8個(gè)質(zhì)量濃度。將已滅菌的6 mm藥敏片分別放入8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的地皮菜不同極性部位樣液中浸泡1 h,備用。
(3)抑菌試驗(yàn)
移液槍取100 μL上述制備的菌懸液均勻涂布在瓊脂平板表面,制成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌含菌平板。取浸泡過地皮菜不同極性部位樣液的6 mm藥敏片貼在含菌平板上,每個(gè)培養(yǎng)皿各3片浸過同一種濃度樣液的濾紙片。以無菌蒸餾水為空白對(duì)照組。將處理過的含菌平板置于恒溫培養(yǎng)箱中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測量并記錄抑菌圈的直徑;再將培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,測量并記錄抑菌圈直徑。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用SPSS 26軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;作圖采用Origin 9.9.0軟件繪制。
地皮菜不同極性萃取部位總?cè)?、總黃酮、總多酚得率如表1所示。
表1 地皮菜不同極性萃取部位總?cè)?、總黃酮及總多酚得率比較Table 1 Total triterpenes, total flavonoids, and total polyphenols yields of different polar extracts of Nostoc commune
由表1可知,地皮菜提取物各極性萃取部位均含有三萜、黃酮和多酚,其中乙酸乙酯相的總?cè)啤⒖傸S酮、總多酚含量最高,分別為0.33%、2.40%、0.67%???cè)坪涂傸S酮含量在不同極性萃取部位從高到低依次均為乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相;乙酸乙酯相和石油醚相總?cè)坪恐g差異顯著(P<0.05),總多酚含量在不同極性萃取部位從高到低依次為乙酸乙酯相>水相>正丁醇相>石油醚相。朱萱萱等[27-28]的研究也表明,乙酸乙酯相提取得到的活性成分含量最高,總?cè)?、總黃酮在水相中的含量最低;石油醚相中總多酚含量最少,為0.24%。李芳龍等[29]的研究中,總多酚石油醚相含量同樣最低。利用不同極性部位提取不同原材料中活性成分時(shí),乙酸乙酯相活性成分含量最高,這可能是乙酸乙酯相的極性大小最適合用于提取活性成分;而活性成分含量最低的萃取相不同原材料是不一樣的。
2.2.1 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)ABTS+·的清除能力
由圖1可知,當(dāng)?shù)仄げ瞬煌瑯O性萃取部位提取物質(zhì)量濃度為0.09~3.00 mg/mL時(shí),對(duì)ABTS+·清除能力隨著提取質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL時(shí),石油醚相清除率為64.66%,乙酸乙酯相清除率為83.08%,正丁醇相清除率為62.31%,水相清除率為56.28%。地皮菜不同極性萃取部位提取物不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的抗氧化活性也具有較大差別,在0.09~0.188 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相的ABTS+·清除率低于石油醚相和水相,VC清除率由30.15%增加至81.57%;在0.188~0.38 mg/mL時(shí),正丁醇相和乙酸乙酯相ABTS+·清除率快速增加,石油醚相和水相清除率增速較為緩慢,VC的ABTS+·清除率達(dá)到99.77%;提取物質(zhì)量濃度在0.38~3.00 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相清除ABTS+·的能力逐漸增大,超過石油醚相和水相,表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力,VC的清除率也保持在98%以上,這與黃小鳳等[30]的研究相似。在質(zhì)量濃度為0.09~1.50 mg/mL時(shí),正丁醇相的ABTS+·清除率較石油醚相、乙酸乙酯相、水相均低,表明在此濃度范圍內(nèi),正丁醇相較其他三種極性萃取部位ABTS+·清除能力最弱。綜上所述,表明地皮菜對(duì)ABTS+·有一定的清除能力。不同極性萃取部位對(duì)ABTS+·的清除能力總體從強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯相>石油醚相>水相>正丁醇相。
圖1 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)ABTS+·的清除能力的影響Fig.1 Effect of different polar part extracts of Nostoc commune on ABTS+·scavenging activity
2.2.2 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)DPPH·的清除能力
由圖2可知,當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為1.50 mg/mL時(shí),石油醚相DPPH·清除率為88.82%,乙酸乙酯相的清除率為97.22%,正丁醇相的清除率為62.9%,水相的清除率為51.76%。提取物質(zhì)量濃度在0.09~0.375 mg/mL,石油醚相的DPPH·清除率高于其他三相的清除率;提取物質(zhì)量濃度在0.375~1.50 mg/mL時(shí),隨著質(zhì)量濃度逐漸增大,石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相的樣品對(duì)DPPH·的清除能力也大幅增強(qiáng),其中乙酸乙酯相增幅最為明顯,當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到1.50 mg/mL時(shí),其清除率與VC基本相似,表明此時(shí)乙酸乙酯相的樣品有極強(qiáng)的DPPH·的清除能力。提取物質(zhì)量濃度在0.09~1.50 mg/mL時(shí),VC的DPPH·清除率均在95%以上。陳石梅等[31]的研究中關(guān)于DPPH·的清除率,除石油醚相清除率較低,其他萃取相結(jié)果與本研究相似。
圖2 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)DPPH·的清除能力的影響Fig.2 Effect of different polar part extracts of Nostoc commune on DPPH·scavenging activities
2.2.3 地皮菜不同極性萃取部位提取物還原能力
由圖3可知,地皮菜石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相4種不同極性萃取部位的樣品在質(zhì)量濃度為0.19~3.00 mg/mL范圍內(nèi),還原能力較弱,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組VC的還原能力,與李莎莉等[32]研究中的還原能力相似,整體偏低。在樣品質(zhì)量濃度為0.188~0.75 mg/mL時(shí),隨著質(zhì)量濃度的增大,4個(gè)極性萃取部位樣品的還原能力都有不同程度的增大,VC的還原能力由1.25增加至2.46;在0.75~3 mg/mL濃度范圍內(nèi),乙酸乙酯相還原能力遠(yuǎn)大于其他三相,VC的還原能力都在2.46以上。在質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL時(shí),石油醚相還原能力為0.50,乙酸乙酯相還原能力為0.72,正丁醇相還原能力為0.42,水相還原能力為0.23。還原能力總體效果不太顯著,但是不同萃取相之間,還是乙酸乙酯相還原能力最強(qiáng)。各極性部位樣品還原能力的強(qiáng)弱依次為:乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相。
圖3 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)還原能力的影響Fig.3 Effect of different polar part extracts of Nostoc commune on reducing power
2.2.4 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)O2-·的清除能力
由圖4可知,當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí),地皮菜石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相的O2-·清除率均為100%,水相清除率為82.45%。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.75~3.00 mg/mL時(shí),石油醚相清除率高于其他三相,正丁醇相清除率高于VC;質(zhì)量濃度為3.00~12.00 mg/mL時(shí),對(duì)O2-·有較強(qiáng)的清除作用,其清除率均>55%,其中石油醚相最為突出,始終保持在96%左右,VC與乙酸乙酯相清除率與石油醚相近。隨著不同極性部位樣品濃度逐漸增大,各極性部位樣品的清除率也有不同程度的升高,水相的清除率變化幅度最大,乙酸乙酯相、正丁醇相次之,石油醚相變化幅度最小。
圖4 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)O2-·的清除能力的影響Fig.4 Effect of different polar part extracts of Nostoc commune on O2-·scavenging activity
2.3.1 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用
由圖5可知,地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)于大腸桿菌均有抑菌作用。樣品質(zhì)量濃度為0.5~2.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相有較高的抑菌活性,這與郭菡等[33]的研究相似;而在質(zhì)量濃度為2.0~32.0 mg/mL時(shí),石油醚相有較高的抑菌活性;在質(zhì)量濃度為32.0~64.0 mg/mL時(shí),石油醚相抑菌活性降低,正丁醇相抑菌活性沒有發(fā)生變化。與陽性對(duì)照組相比,地皮菜不同極性部位提取物的抑菌活性相對(duì)較弱。地皮菜乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相提取物質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL、4 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好。
圖5 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)大腸桿菌抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of different polar extracts of Nostoc commune on Escherichia coli
2.3.2 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用
由圖6可知,四種極性萃取部位對(duì)于枯草芽孢桿菌均有抑菌作用,質(zhì)量濃度為0.5~4 mg/mL時(shí),四個(gè)極性部位對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制作用相對(duì)較弱,當(dāng)質(zhì)量濃度為4~16 mg/mL時(shí),除正丁醇相外,其他三相對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制作用均達(dá)到最高;在質(zhì)量濃度為16.0~64.0 mg/mL時(shí),正丁醇相抑菌活性增加,其他三相都有所降低。同時(shí),與陽性對(duì)照組相比地皮菜不同極性部位的抑菌活性相對(duì)較弱。由圖6亦可知,乙酸乙酯相對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制效果最好的質(zhì)量濃度為16 mg/mL,正丁醇相對(duì)于枯草芽孢桿菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為8 mg/mL,石油醚相對(duì)于枯草芽孢桿菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為4 mg/mL,水相對(duì)于枯草芽孢桿菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為8 mg/mL。
圖6 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of different polar extracts of Nostoc commune on Bacillus subtilis
2.3.3 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用
由圖7可知,四種極性萃取部位對(duì)于金黃色葡萄球菌均有抑菌作用,且在質(zhì)量濃度為0.5~1.0 mg/mL時(shí),四種極性萃取部位對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制效果均較差,相較于其他兩相來說,乙酸乙酯相和水相的抑菌效果對(duì)于濃度的變化更加敏感;在質(zhì)量濃度為1.0~4.0mg/mL時(shí),乙酸乙酯相抑菌活性大于其他三相;在質(zhì)量濃度為4.0~64.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相抑菌活性逐漸降低。同時(shí),與陽性對(duì)照組相比地皮菜不同極性萃取部位的抑菌活性相對(duì)較弱。由圖7亦可知,乙酸乙酯相對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制效果最好的質(zhì)量濃度為2 mg/mL,正丁醇相對(duì)于金黃色葡萄球菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為4 mg/mL,石油醚相對(duì)于金黃色葡萄球菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為8 mg/mL,水相對(duì)于金黃色葡萄球菌抑制效果最好的質(zhì)量濃度為1 mg/mL。
圖7 地皮菜不同極性萃取部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of different polar extracts of Nostoc commune on Staphylococcus aureus
地皮菜石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相的樣品中都含有活性物質(zhì)成分,且活性成分含量與抗氧化活性具有一定差異。且乙酸乙酯相較其他三個(gè)極性萃取部位活性物質(zhì)含量最高,說明乙酸乙酯相是地皮菜抗氧化主要的極性部位。通過對(duì)抗氧化活性的測定可知地皮菜石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相的樣品對(duì)ABTS+·、DPPH·、O2-·均具有較好的清除能力和一定的還原能力,在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性增長,且乙酸乙酯相抗氧化能力高于其他相。乙酸乙酯相總黃酮含量較高,而且每個(gè)極性部位總黃酮含量普遍高于總?cè)坪涂偠喾?,推斷由于乙酸乙酯相總黃酮含量高,從而導(dǎo)致乙酸乙酯相抗氧化活性也均高于其他相。
通過地皮菜不同極性萃取部位對(duì)同一菌種抑菌效果比較發(fā)現(xiàn),石油醚相對(duì)于大腸桿菌的抑制效果最好,乙酸乙酯相對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,而四種極性部位對(duì)于枯草芽孢桿菌抑制作用相當(dāng),且在較低濃度時(shí),乙酸乙酯相對(duì)于三種菌的抑制作用均比其極性部位要好。綜上所述,乙酸乙酯相提取物的抗氧化活性和抑菌活性都較好,可以用乙酸乙酯相作為地皮菜相關(guān)功能性產(chǎn)品研發(fā)的主要成分。同時(shí)也為以后地皮菜相關(guān)方面的研究奠定基礎(chǔ)。