白酒釀造過程中微生物多樣性的研究進展

王一然，程 寒，孫 敏，曾 珊，沈才洪，楊雅瓊，敖 靈*

（1.南京師范大學 食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.四川省固態(tài)釀造技術創(chuàng)新中心，四川 瀘州 646000）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，經過幾千年的發(fā)展，它在社會、經濟、醫(yī)療、飲食等各個方面都發(fā)揮著不可替代的作用[1-2]。由于獨特的釀造工藝，中國白酒可以分為醬香型、濃香型、清香型、米香型等四大基本香型，其中濃香型是最受歡迎的香型之一，原名瀘州味白酒，因瀘州老窖的特點而聞名[3-4]。由于釀造原料、發(fā)酵劑、發(fā)酵容器、釀造工藝、釀造環(huán)境的差異，使得白酒的微量成分具有多樣性，從而產生出不同香型和口感的白酒[5-6]。

從知網上以“白酒”和“微生物”為主題，篩選了核心期刊和中文社會科學引文索引（Chinese Social Sciences Citation Index，CSSCI）的相關文獻，共計847篇（2023年4月13日為節(jié)點）。使用VOSviewer可視化軟件進行關鍵詞繪圖，得到“密度視圖”見圖1。圖1中節(jié)點愈大表明以該關鍵詞為重點的論文數量越多，可發(fā)現研究重點為醬香型/濃香型白酒、窖泥、中溫大曲、微生物功能等。相比于其他蒸餾酒，中國白酒發(fā)酵周期最長，且是唯一使用多菌株酒曲為發(fā)酵劑，其他多為酵母（單株）發(fā)酵[7]。白酒的風味物質包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分，由微生物發(fā)酵產生。在白酒的釀制過程中，發(fā)酵是一個復雜的過程，對酒的風味起著至關重要的作用。發(fā)酵過程涉及到微生物主要可分為窖泥微生物、大曲微生物、糟醅微生物和環(huán)境微生物。微生物的多樣性調控著酒釀造過程中微量成分的組成，決定著白酒的風味和口感，在整個發(fā)酵過程中各不相同[8-9]。

圖1 白酒微生物研究熱點和交互關系Fig.1 Research hotspots and interactions of microorganisms in Baijiu

本文重點綜述了白酒中微生物多樣性的研究方法，釀造過程中涉及的微生物的多樣性。此外，還介紹了微生物間的相互作用，以及微生物群落對酒風味的影響。本文為白酒釀造中涉及的微生物研究提供了較全面的概述，為白酒品質提升提供了理論數據支撐。

1 微生物多樣性的研究方法

傳統(tǒng)的研究方法多依賴于可培養(yǎng)技術從白酒發(fā)酵中分離進行物種鑒定，但是對酒中的微生物種群應用受限，自然界能夠實現純菌培養(yǎng)的占少數[10-11]。隨著分子生物技術的發(fā)展，廣泛利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應、基因克隆技術、組學技術，甚至和超高效液相色譜、質譜等高精儀器聯用來進行白酒中微生物多樣性的鑒定。組學技術包括宏基因組學技術、蛋白組學和代謝組學等，其中的宏基因組學技術通過高通量測序技術進行分析。

高通量測序技術又稱“下一代”測序技術（"Next-generation"sequencing technology，NGS），是第二代測序，一次可測序幾十萬至上百萬的核酸序列，是傳統(tǒng)的Sanger測序方法的巨大發(fā)展[12]。ZHAO W H等[13]采用第三代高通量測序技術，同時具有高通量、高效率、長讀長的優(yōu)勢，對不同發(fā)酵時間的酒曲和豉香型白酒中的微生物種群進行了鑒定，結果顯示，豉香型白酒中真菌的多樣性不及細菌，而發(fā)酵中的酵母菌（Yeast）、復膜孢酵母菌屬（Saccharomycosis）、絲孢酵母菌屬（Trichosporon）、假絲酵母菌屬（Candida）等優(yōu)勢菌屬則均來自酒曲。宏基因組學技術是基于NGS在特定環(huán)境下進行微生物基因組學分析的一種方法。TIAN N等[14]利用宏基因組學分析了不同發(fā)酵批次的十里香白酒大曲中細菌的多樣性，結果表明發(fā)酵30 d后，有四批十里香白酒大曲樣品中厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢門；確定了發(fā)酵溫度和時間等環(huán)境條件對微生物分布的影響；證實十里香白酒大曲中細菌有促進代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理的主要作用。

通過對基因組學（Genomics）、代謝組學、蛋白組學、轉錄組學（Transcriptomics）等數據整合，可以揭示白酒中的微生物種群組成和基因表達，從而優(yōu)化發(fā)酵過程，提高白酒的品質。田瑞杰等[15]利用宏轉錄組學（Macro-transcriptomics）對濃香型白酒酒醅中活性微生物群落及其空間異質性進行了研究，表明了酒醅中細菌和真菌的種屬組成，且空間異質性相差較小。單組學分析具有局限性，但利用兩種及以上的組學技術——多組學研究可以從多個層面揭示發(fā)酵微生物的多樣性，包括物種、基因和代謝產物等，進而實現白酒微量成分的調控。LIU X G等[16]采用擴增子測序（Amplicon Sequencing）、宏蛋白組學（Macroproteomics）和代謝組學等多組學技術，結合理化指標分析了瀘州老窖酒醅中的核心功能菌——乳酸桿菌（Lactobacillus）的“自我凈化”及在瀘州白酒風味中的關鍵作用，為分析發(fā)酵時長與原酒品質的關系提供了基礎數據。

盡管微生物多樣性的探究方法存在局限性，但隨著現代分子技術的不斷發(fā)展，各種現代分子技術的結合使研究結果具有高效性、準確性、靈敏性、可重復性等優(yōu)勢。利用多種技術對發(fā)酵微生物的揭示，可展現發(fā)酵過程的微生態(tài)軌跡，實現有效成分的控制。這些技術的應用不僅可以深入了解發(fā)酵過程中微生物群落的生態(tài)學特征，還能有效控制發(fā)酵過程中的微生物代謝，從而提高白酒的品質和風味。

2 微生物的多樣性

中國白酒釀造過程中，菌群與其生存所處的微環(huán)境共同組成了符合物質循環(huán)、能量流動和信息傳輸的微生態(tài)系統(tǒng)。源于窖泥、曲藥以及環(huán)境的各種微生物，通過持續(xù)的菌群遷移、演化和代謝物質傳遞，在糟醅中達到平衡，形成獨特的糟醅微生物區(qū)系，隨著平衡的產生，最終實現了固態(tài)白酒發(fā)酵生產的基本過程?？梢哉f，濃香型白酒微生態(tài)系統(tǒng)是由大曲、窖泥以及釀酒生產現場環(huán)境微生物共同演化而來的糟醅微生物區(qū)系所組成的。窖池中主要功能菌的存在狀態(tài)，尤其是曲藥微生物和窖泥微生物，是糟醅微生物生態(tài)形成的基礎。窖池中的所有微生物以及它們所處的特定的窖池環(huán)境，組成了相互作用、相互聯系的統(tǒng)一體，也就是窖池微生物生態(tài)系統(tǒng)。

2.1 窖泥微生物

濃香型白酒（strong-flavorBaijiu，SFB）如瀘州老窖、劍南春、五糧液等，采用固態(tài)發(fā)酵技術[17]。窖池的理化性質影響著窖泥的品質，而窖泥的品質和窖齡又決定著窖泥中微生物的組成，這些微生物與酒的品質密切相關[18]。窖泥中微生物種類組成豐富，為微生物的生長代謝提供了良好的環(huán)境。由于微生物組成的多樣性，其代謝途徑和代謝產物也具有豐富性，可為白酒提供良好的香氣組成。細菌和古菌是濃香型白酒窖泥中的主要微生物組成，其中厚壁菌門的梭狀芽孢桿菌（Clostridia）是最為豐富的細菌類型，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）中的擬桿菌綱（Bacteroidia）[19-20]。

采用測序技術對窖泥中的微生物群落進行分析可知，其豐富度不斷提高，組成也逐漸變化并趨于穩(wěn)定。不同窖齡的窖泥微生物組成見表1。在瀘州老窖的40年和400年發(fā)酵池的窖泥中，優(yōu)勢微生物屬組成未發(fā)生大改變，但在400年的窖泥中的甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、己酸菌屬（Caproiciproducens）平均相對豐度分別增加了117.07%和51.42%，其余優(yōu)勢微生物屬比例大都略有下降[21]。Methanobrevibacter和Caproiciproducens共同出現時窖泥樣品中有最高的己酸水平，可能表明較老的窖池中具有更多產己酸的菌，是影響SFB質量的關鍵成分己酸乙酯的重要來源[24]。在瀘州白酒中Caproiciproducens和產甲烷古菌（Methanosarcina）同樣隨著窖齡的增加豐度逐漸增加[19]。枝江白酒共鑒定出73個細菌屬，細菌總數不斷增加。與瀘州白酒不同，克氏梭菌（C.kluyveri）和ClostridiumclusterIV是產己酸菌，在10年、20年、30年的窖泥中數量也是遞增的，致使老窖池的窖泥中白酒中己酸乙酯含量升高[20，22]。

表1 不同窖齡和地區(qū)白酒窖泥優(yōu)勢微生物Table 1 Dominant microorganism in Baijiu pit mud with different ages and regions

分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）數量、Chao1和ACE指數是用于表示窖泥中微生物豐富度的常用指標。在窖池中，不論窖齡，隨著深度的增加，OTU數量、Chao1和ACE指數呈現先增后降的趨勢。具體而言，胡曉龍等[25]對河南某酒廠的窖泥采樣，自上而下，40年窖齡的窖泥α多樣性指數在中層達到最大值，微生物多樣性和豐富度最高，而4年窖齡的Shannon指數、ACE指數的最大值在底層，原核微生物主要生長在底層。同時，低層次的窖泥α多樣性指數低于高層次的窖泥。此外，胡曉龍等[26]在另一酒業(yè)的6年和12年窖池的不同深度的窖泥研究中發(fā)現，底層具有最高的物種多樣性，中層豐富度最高，同層次的物種多樣性相差不大。

2.2 大曲微生物

大曲是中國白酒糖化發(fā)酵的主要發(fā)酵劑，采用自然接種，對環(huán)境具有極強的依賴性[27-28]。大曲根據其形狀、工藝、風味特征、發(fā)酵溫度等特點具有不同的分類方式，如圖2所示，經過自然培養(yǎng)后，大曲富含豐富的微生物組成，為酒醅發(fā)酵提供微生物、功能酶系及風味物質[29]。大曲發(fā)酵處于開放的環(huán)境，因此細菌、霉菌（Moulds）、酵母等含量豐富?！疤腔棵咕l(fā)酵靠酵母，生香靠細菌”，完美闡釋了大曲中微生物的相互作用[30]。同時，放線菌（Actinomycestes）具有多種代謝活性，包括糖類物質的水解及產生各級代謝產物[31]，是大曲中微生物代謝的重要組成部分。

圖2 白酒大曲按不同特點的分類Fig.2 Classification of Baijiu Daqu according to different characteristics

由于不同地區(qū)的白酒大曲受到地理環(huán)境、發(fā)酵原料和方式的影響，其發(fā)酵過程中的微生物優(yōu)勢菌屬存在差異。根據不同的制曲溫度，可以分為高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲（表2）。乳酸是生成乳酸乙酯的重要物質，可以降低白酒的刺鼻口感，增加醇厚感和甜味，并提高白酒的品質[35]。在大曲發(fā)酵的初期，不同菌群中的乳酸菌和芽孢桿菌（Bacillus）等占據著主導地位，它們能夠將糖類轉化為乳酸，同時增加有機酸的含量，使總酸度上升，糖和淀粉含量下降。然而，隨著環(huán)境條件的變化，好氧菌的生長受到抑制，而厭氧菌、兼性厭氧菌和耐酸菌的生長代謝則得到刺激[36]。在杜康白酒的大曲[37]發(fā)酵前期，以泛菌屬（Pantoea）、葡萄球菌（Staphylococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、乳桿菌（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌屬；發(fā)酵后期，優(yōu)勢菌屬并未發(fā)生大改變，相對豐度提高，以融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、葡萄球菌（Staphylococcus）為優(yōu)勢菌。

表2 不同白酒大曲的優(yōu)勢微生物Table 2 Dominant microorganism of different Baijiu Daqu

在實際生產中，傳統(tǒng)大曲主要依靠自然網絡富集周圍環(huán)境微生物，其微生物群落具有一定的局限性，其糖化能力和酯化能力存在上限。因此，可以采用功能菌株強化大曲，通過改變初始微生物比例來實現大曲發(fā)酵品質的改善，進而影響微生物群落的演替進程。在茅臺大曲中接種功能酵母，如釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus），庫德里阿茲威畢赤酵母菌（Pichia kudriavzevii），扣囊復膜酵母菌（Saccha-romycopsis fibuligera），這些酵母菌可以增加腈水解酶的含量，并顯著降低大曲中氰化物的含量。此外，異常威克漢姆酵母菌具有良好的香氣和產酶特性，可以改善白酒的香氣[38-39]。

2.3 酒醅微生物

酒醅是白酒蒸餾的原料，其發(fā)酵階段可分為高溫堆積發(fā)酵和入窖密封發(fā)酵。其中，高溫堆積發(fā)酵是好氧發(fā)酵，入窖密封發(fā)酵是無氧發(fā)酵。堆積發(fā)酵需要滿足糖化、發(fā)酵和生香條件[40]，為入窖發(fā)酵提供必要的微生物和發(fā)酵前體物質。李喆等[41]研究發(fā)現，堆積發(fā)酵后，酒醅的表層具有數量巨大的微生物。在整個白酒的發(fā)酵過程中，酒醅是釀酒物料循環(huán)、能量流動以及釀酒微生物代謝的重要載體[42]。酒醅發(fā)酵過程中，來自大曲、窖泥、周圍環(huán)境的微生物起著關鍵作用，能夠分解谷物中的淀粉、纖維素、糖類和蛋白質，產生有機酸和香味。因此，酒醅中的微生物是釀造過程中產生香味物質的重要驅動力，其數量、群落結構、生態(tài)演替和相關的代謝活動直接影響著白酒的香味質量?；跀U增子測序、宏蛋白組學和代謝組學等多組學技術分析了瀘州白酒酒醅中的微生物多樣性，酒醅群落演替表明乳酸菌，魏斯氏菌（Weissella）和芽孢桿菌為主要細菌群，真菌群落結構的演替方向是以伊薩酵母屬（Issatchenkia），釀酒酵母屬（Saccharomyces），根霉屬（Rhizopus）和曲霉屬（Aspergillus）為主，以Kazachstania、釀酒酵母屬（Saccharomyces）和畢赤酵母屬為發(fā)酵過程中的主要替代者[43]。此外，在中國其他風味白酒中，乳酸菌也是主要的菌種，其原因可能在于發(fā)酵基質（高梁和小麥）以及類似的發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)。

3 微生物群落的相互作用

在白酒發(fā)酵過程中，微生物間的相互作用會致使微生物的動態(tài)變化，進而影響發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性。微生物與微生物及發(fā)酵環(huán)境間，經過長期馴化逐步形成一個持續(xù)變化又相對穩(wěn)定的微生物群落結構。發(fā)酵過程中，微生物群落的作用可以分為直接接觸的直接相互作用和通過引起環(huán)境物理化學性質變化觸發(fā)其他微生物反應的間接相互作用。微生物間的相互作用一般分為共生、拮抗作用，即正反相互作用。正相互作用主要發(fā)生在有利于發(fā)酵的微生物種屬之間，通常表現為微生物的代謝物對其他菌落產生正面影響，如酵母菌和乳酸菌。乳酸菌對營養(yǎng)的要求很高，需要氨基酸、不飽和脂肪酸和維生素，因此在營養(yǎng)較少的情況下，乳酸菌的繁殖會受到限制。然而，與酵母菌共存時，酵母菌可以分泌蛋白酶（Protease），并能有效分解蛋白質產生氨基酸和其他生長因子，彌補了乳酸菌僅靠乳糖代謝而成長緩慢的缺點[44]。乳酸菌由于缺乏過氧化氫酶（Catalase），因此對氧化環(huán)境非常敏感。而酵母菌則因含有過氧化氫酶，能夠緩解乳酸菌的氧化壓力，并通過消耗液體中的氧氣形成局部厭氧環(huán)境，為乳酸菌提供良好的生長條件。在發(fā)酵后期，酵母菌還會進行無氧呼吸生成CO2，從而阻礙了外界環(huán)境中的氧氣進入發(fā)酵液，為乳酸菌創(chuàng)造了良好的生長環(huán)境，促進乳酸菌生長繁殖[45]。乳酸菌產生乳酸，降低反應液的酸度，促進酵母菌的生長。同時，多種酵母存在時也會產生互相促進的效果。在酵母營養(yǎng)競爭的過程中，可能是由于酵母之間對營養(yǎng)物質的非特異性競爭和釀酒酵母產生的代謝物（如乙醇）的抑制，對非酵母微生物具有拮抗作用，酵母菌的活性會得到加強，從而可以產生大量乙酸和乙醇，生成乙酸乙酯等風味物質[46]。

拮抗作用一般是通過代謝產物的累積而影響微生物的生長，如乳酸菌產生的乳酸會逐漸降低發(fā)酵液的酸度，進而對一些雜菌產生拮抗作用，減少發(fā)酵液中因雜菌污染而引起的安全問題[47]。另外，酵母菌在發(fā)酵過程中產生的乙醇和其他代謝產物，如乙酸等，也可以對雜菌產生拮抗作用，減少雜菌的生長。

4 微生物群落對酒風味品質的影響

微生物的代謝活動賦予白酒獨特的口感和香氣。乳酸桿菌在生長發(fā)育過程中會消耗糖類，通過己糖磷酸途徑產生乳酸。乳酸和乙醇在酯化酶的作用下生成乳酸乙酯，而己酸和乙醇脂肪酶的作用下生產己酸乙酯。此外，紅曲霉屬（Monascus）和畢赤酵母屬（Pichia）也是具有酯化能力的功能真菌。乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯是酒醅中酯類物質的主要組成[48]，是白酒中主要揮發(fā)性香味物質，在提高白酒的醇度和香味方面扮演著重要角色。高級醇又是酒中不可或缺的香氣和口感成分，是酯類物質的合成前體，可以提高白酒口感的協調性和酒體的飽滿度。異常威克漢姆酵母（W.anomalus）可產生高級醇，而地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）可降低高級醇含量，解決了小曲白酒中高級醇含量高對品質的影響[49-50]。在中國白酒中，有機酸含量是微量的，卻是白酒中的一類重要的香味成分，對酒的風味與風格有著決定作用，同時也是酯的前驅物。酸是隨著酒精發(fā)酵產生的，適量的酸可以促進酯的形成，使白酒更醇厚，回味更長。畢赤酵母屬和釀酒酵母屬與乳酸呈現正相關，乳酸片球菌（Pediococcus）與乙酸呈現正相關[51]。此外，白酒中生產的各個階段都伴有功能性成分四甲基吡嗪的生成，主要來自微生物枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的代謝[52]。四甲基吡嗪是白酒重要風味物質的組成成分，賦予白酒一定的健康功效。

白酒中酒精和各種風味物質的產生都是以微生物代謝為基礎的。微生物在白酒的釀制過程中發(fā)揮著至關重要的作用，它們通過不同的代謝途徑，將原料中的糖類分解成酒精和其他香味物質。酒精和其他香味物質的存在以一定的方式對白酒的香味、口感、風格和品質產生著決定性的影響。窖泥微生物群落、大曲微生物群落以及糟醅微生物群落是白酒釀制過程中三個重要的微生物群落類型，它們各司其職，相互作用，將原料進行發(fā)酵，分解糖類，通過不同的代謝途徑，產生不同的香氣物質，賦予白酒醇厚感和回味感[53]。

5 結論與展望

白酒微生物多樣性十分豐富，這種多樣性體現在不同發(fā)酵階段的同一性菌種和差異性菌種上。這些微生物在白酒的發(fā)酵過程中具有豐富的功能性，其代謝產物也表現出良好的風味。目前，對于白酒微生物多樣性的研究已經涵蓋了多個領域，包括微生物群落結構的變遷、豐富的風味成分和有益代謝物動態(tài)變化的鑒定。深入了解白酒中復雜的微生物區(qū)系以及微生物與微生物、發(fā)酵環(huán)境之間的相互作用也是當前研究的熱點。從白酒的微生物多樣性中篩選出生產所需要的菌株，研究其功能特性，并進行功能性接種，實現強化作用也是研究的熱點之一。