骨形成蛋白7對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的作用研究*

李峰，謝方，王雪，孫兆煒，錢令嘉，趙云

（中國人民解放軍軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

應(yīng)激是機(jī)體應(yīng)對生存環(huán)境中多種不良因素刺激時(shí)所產(chǎn)生的身心緊張狀態(tài)及其反應(yīng)[1]，是抑郁癥、成癮癥、心血管疾病、潰瘍和癌癥等多種疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[2-4]。慢性應(yīng)激誘導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生與下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenal axis, HPA）的過度激活密切相關(guān)[5]。HPA軸過度激活誘導(dǎo)血清皮質(zhì)醇水平升高，高水平糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid, GC）能夠使海馬神經(jīng)元凋亡和再生失衡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞萎縮和丟失，造成海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而影響認(rèn)知功能[6-7]。因此，研究如何保護(hù)海馬神經(jīng)元免受GC誘導(dǎo)的損傷十分重要。骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷恢復(fù)過程中發(fā)揮了良好的神經(jīng)保護(hù)作用[8-9]，但其對慢性應(yīng)激中GC誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用尚不明確。PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，是一個(gè)特征良好的神經(jīng)元模型。該細(xì)胞系被廣泛用作神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)研究的模型系統(tǒng)[10]。本研究旨在觀察GC對PC12細(xì)胞凋亡的影響，以及BMP-7對GC誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），微量紫外分光光度計(jì)（中國臺灣Ulabx公司），PCR基因擴(kuò)增儀（英國Techne公司），LightCycler 96熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司），NovoCyte TM流式細(xì)胞儀（美國安捷倫科技公司）。過表達(dá)和敲低BMP7病毒、陰性對照病毒（上海和元生物股份有限公司），RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國Gibco公司），GC和二甲基亞砜（DMSO）（美國Selleck公司），TRIzol試劑（美國Sigma公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），細(xì)胞凋亡試劑盒（Annexin V Binding Buffer，Annexin VAPC，7-AADsolution）（美國Protein Simple公司），ABScriptⅡ RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)分子生物學(xué)試劑（武漢愛博泰克生物科技有限公司），TB Green Premix Ex TaqTMⅡ PCR相關(guān)分子生物學(xué)試劑（日本TaKaRa公司），RIPA裂解液和Cocktail（中國碧云天科技公司），BMP-7、Cleaved-Caspase-3、β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（武漢愛博坦克生物科技有限公司），高分化大鼠PC12細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) PC12細(xì)胞采用含10%FBS和1%青/鏈霉素雙抗的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（簡稱完全培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%二氧化碳、加濕環(huán)境。選取生長良好的大鼠PC12細(xì)胞，將PC12細(xì)胞接種至新的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、10、20、50和100 μmol/L的GC溶液（GC溶于DMSO后加入細(xì)胞中），將培養(yǎng)皿放入細(xì)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需時(shí)程。

1.2.2 慢病毒感染實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞接種至24孔板中，約0.5×105個(gè)/孔，按照0、10、20、40和80的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）計(jì)算每孔需要的病毒量。待細(xì)胞貼壁后更換新鮮完全培養(yǎng)基，按照計(jì)算好的病毒量加入到培養(yǎng)基中，混勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12～16 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基。72 h可在熒光顯微鏡下觀察病毒感染狀態(tài)，確定最佳MOI，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳MOI感染細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將PC12細(xì)胞消化重懸后清洗2遍，加入流式管中，800 r/min離心3 min后棄去上清液，每管中加入500 μL Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞。然后加入Annexin V-APC和7-AAD solution各5 μL，混勻后室溫避光孵育20 min。將DMSO或等體積50 μmol/L GC分別加入到感染了陰性對照病毒的細(xì)胞和過表達(dá)BMP-7細(xì)胞中進(jìn)行處理，分別記為DMSO-NC組、DMSO-oe BMP-7組、GC-NC組和GC-oe BMP-7組；將DMSO或等體積50 μmol/L GC分別加入到感染了陰性對照病毒的細(xì)胞和敲低BMP-7細(xì)胞中進(jìn)行處理，分別記為DMSO-NC組、DMSO-shBMP-7組、GC-NC組和GC-shBMP-7組。反應(yīng)完成后立即上機(jī)檢測。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白表達(dá) PC12細(xì)胞經(jīng)勻漿、裂解、離心后提取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。25 μg總細(xì)胞蛋白提取物在10% SDSPAGE上分離，并通過硝化纖維膜電轉(zhuǎn)移。將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，然后分別用BMP7（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）或β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃下孵育過夜，洗凈后HRP標(biāo)記二抗（1∶5 000）孵育2 h。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影后，使用Image J軟件對條帶的像素點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的數(shù)據(jù)可間接反映蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR） 采用TRIzol試劑說明書提取大鼠海馬和PC12細(xì)胞總RNA，利用分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，按照ABScriptⅡ RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將每個(gè)樣品中總共1 000 ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：cDNA樣品、正、反向引物、TB Green Ⅱ和DEPC水分別為1.0、0.2、0.2、5.0和3.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。內(nèi)參基因β-actin，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。Bax引物序列：正向5'-CTGCAGAGGATGATT GCTG-3'，反向5'-GTCTGCAAACATGTCAGCT-3'，引物長度19 bp；β-actin引物序列：正向5'-CTTCCTGG GTATGGAATCCT-3'，反向5'-TCTTTACGGATGTCAA CGTC-3'，引物長度20 bp。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8和SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用方差分析或秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度GC誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞凋亡率升高

0、10、20、50和100 μmol/L GC處理后PC12細(xì)胞凋亡率分別為（6.52±1.63）%、（14.54±3.19）%、（17.87±3.01）%、（18.96±5.15）%、（25.97±2.44）%。經(jīng)單因素方差分析，不同濃度GC處理組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.400，P=0.000）；與0 μmol/L GC比較，當(dāng)GC濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），并且隨著GC濃度的升高，細(xì)胞凋亡率升高（見圖1）。

圖1 不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.2 不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的Cleaved-Caspase-3蛋白和Bax基因表達(dá)比較

不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.350，P=0.000）。不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的Bax mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=11.230，P=0.002）。與0 μmol/L GC比較，GC濃度為50 μmol/L時(shí)，Cleaved-Caspase-3蛋白和Bax基因表達(dá)顯著增加。見表1和圖2。

表1 不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的Cleaved-Caspase-3蛋白和Bax mRNA相對表達(dá)量比較

圖2 不同濃度GC處理后PC12細(xì)胞的Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

2.3 過表達(dá)和敲低BMP-7細(xì)胞系結(jié)果

感染預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MOI=20時(shí)PC12細(xì)胞感染慢病毒達(dá)到最佳感染效率（見圖3）。LV-NC組和LV-oe BMP-7組PC12細(xì)胞BMP-7蛋白相對表達(dá)量分別為（1.000±0.076）和（3.789±0.455），經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.470，P=0.001）；LV-oe BMP-7組較LV-NC組明顯升高（見圖4）。構(gòu)建3個(gè)靶點(diǎn)的敲低BMP-7慢病毒，選擇MOI=20對PC12細(xì)胞感染3種敲低慢病毒及對照病毒。Western blotting結(jié)果顯示，LV-NC組、LV-sh1組、LV-sh2組、LV-sh3組BMP-7蛋白相對表達(dá)量分別為（1.000±0.076）、（0.342±0.062）、（0.508±0.026）、（0.969±0.016），各組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=124.900，P=0.000）；與LV-NC組比較，LV-sh1和LV-sh2PC12細(xì)胞BMP-7蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且LV-sh1組BMP-7蛋白降低效果最顯著（見圖5）。因此，本研究選擇LV-sh1作為敲低BMP-7慢病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 LV-NC組和LV-oe BMP-7組PC12細(xì)胞BMP-7蛋白表達(dá)

圖5 LV-NC組、LV-sh1組、LV-sh2組、LV-sh3組BMP-7蛋白表達(dá)

2.4 過表達(dá)BMP-7可以拮抗GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加

DMSO-NC組、DMSO-oe BMP-7組、GC-NC組和GC-oe BMP-7組細(xì)胞凋亡率分別為（6.71±1.94）%、（6.10±1.14）%、（14.57±4.91）%、（7.61±0.65）%，4組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.430，P=0.001），GC-NC組細(xì)胞凋亡率較DMSO-NC組顯著升高（P＜0.05），而GC-oe BMP-7組細(xì)胞凋亡率較GC-NC組顯著減少（P＜0.05），與DMSO-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖6）。DMSO-NC組細(xì)胞Bax mRNA相對表達(dá)量為（1.001±0.073）、DMSO-oe BMP-7組為（0.676±0.141）、GCNC組為（3.186±0.659）、GC-oe BMP-7組為（1.114±0.169），4組比較，經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=9.667，P=0.001）。GC-oe BMP-7組細(xì)胞Bax mRNA相對表達(dá)量較GC-NC組明顯下降（P＜0.05），與DMSO-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DMSO-NC組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為（1.000±0.265）、DMSO-oe BMP-7組為（0.846±0.031）、GC-NC組為（1.992±0.066）、GCoe BMP-7組為（1.101±0.005），4組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.110，P=0.000）。GC-oe BMP-7組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量較GC-NC組明顯下降（P＜0.05），且與DMSO-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。以上結(jié)果表明過表達(dá)BMP-7可以拮抗GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。

圖6 DMSO-NC、DMSO-oe BMP-7、GC-NC和GC-oe BMP-7組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖

圖7 DMSO-NC組、DMSO-oe BMP-7組、GC-NC組和GC-oe BMP-7組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

2.5 敲低BMP-7誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡增加，并加重GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平

DMSO-NC組、DMSO-sh BMP-7組、GC-NC組和GC-sh BMP-7組細(xì)胞凋亡率分別為（11.22±0.56）%、（19.27±1.30）%、（23.37±2.09）%、（33.63±2.77）%。4組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.970，P=0.000），DMSO-sh BMP7組細(xì)胞凋亡率較DMSO-NC組顯著增加（P＜0.05），GCsh BMP-7組細(xì)胞凋亡率較GC-NC組顯著增加（P＜0.05）（見圖8）。DMSO-NC組細(xì)胞Bax mRNA相對表達(dá)量為（1.016±0.224）、DMSO-sh BMP-7組為（1.818±0.172）、GC-NC組為（2.828±0.569）、GC-sh BMP-7組為（3.535±0.068），4組Bax mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=10.380，P=0.000）。DMSO-NC組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為（1.000±0.265）、DMSO-sh BMP-7組為（1.480±0.058）、GCNC組為（1.526±0.064）、GC-sh BMP-7組為（2.134±0.053），4組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.090，P=0.000）。與DMSO-NC組比較，DMSO-sh BMP-7組細(xì)胞Bax mRNA相對表達(dá)量和Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。與GC-NC組比較，GC-sh BMP-7組細(xì)胞Bax mRNA相對表達(dá)量和Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）（見圖9）。以上結(jié)果表明，敲低BMP-7表達(dá)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡水平增加，并加重GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。

圖8 DMSO-NC組、DMSO-sh BMP-7組、GC-NC組和GC-sh BMP-7組的流式細(xì)胞圖

圖9 DMSO-NC組、DMSO-sh BMP-7組、GC-NC組和GC-sh BMP-7組的Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明，慢性應(yīng)激會誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不可逆性凋亡[11]，應(yīng)激反應(yīng)的核心是HPA軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)的活化，當(dāng)機(jī)體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)隨著HPA軸的過度激活，糖皮質(zhì)激素分泌增多，導(dǎo)致海馬細(xì)胞凋亡水平增加，從而出現(xiàn)抑郁癥狀，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力下降和認(rèn)知障礙[6，12]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期處于高強(qiáng)度應(yīng)激下的人群，罹患輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病、抑郁癥等認(rèn)知相關(guān)疾病的概率明顯增加[13-15]。海馬作為第一個(gè)被認(rèn)為是應(yīng)激靶標(biāo)的高級大腦中心，主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知和情感，由于糖皮質(zhì)激素受體在海馬內(nèi)富集，極易受到糖皮質(zhì)激素的影響[7]。研究顯示，海馬原代神經(jīng)元暴露于濃度大于10 μmol/L糖皮質(zhì)激素后細(xì)胞凋亡水平明顯增加[16]，本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖皮質(zhì)激素濃度大于10 μmol/L時(shí)PC12細(xì)胞凋亡水平顯著增加。隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)社會的快速發(fā)展，越來越多的人群承受著高強(qiáng)度的工作負(fù)荷、復(fù)雜的工作環(huán)境以及睡眠不良等帶來的精神和社會壓力，加之頻繁的自然災(zāi)害和社會突發(fā)公共事件的影響，機(jī)體長期處于應(yīng)激源的刺激之下，罹患應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生幾率明顯升高。因此，積極探尋一種神經(jīng)保護(hù)劑以拮抗糖皮質(zhì)激素的負(fù)性作用顯得十分必要。

BMP-7是TGF-β超家族的一員，在全身各個(gè)組織中均有存在，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能[17]。BMP主要通過BMP受體激活Smad信號通路發(fā)揮效應(yīng)，此外，BMP還激活不依賴于Smad的信號通路，如MAP激酶通路[18]。研究表明，BMP-7可以保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞免受腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的凋亡[19]，在針對Aβ的一項(xiàng)神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)中，BMP-7可以明顯改善Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，改善Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低[20]。此外，BMP-7可以顯著減弱過氧化氫誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶活性增加和神經(jīng)元密度降低[21]。在腦缺血、腦卒中以及脊髓損傷等模型中，BMP-7均發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用[22-23]。因此，BMP-7作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子，其在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷過程中的潛力值得進(jìn)一步挖掘。

本研究結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞凋亡水平與糖皮質(zhì)激素呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡的發(fā)生一般通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡級聯(lián)反應(yīng)來介導(dǎo)，包括海馬神經(jīng)元中的Caspase-3和Bax基因激活[24]。為了探究BMP-7對GC誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，本研究使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，采用qRT-PCR測定細(xì)胞Bax基因表達(dá)，Western blotting測定Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)。Bax基因是Bcl-2相關(guān)X蛋白的基因，有報(bào)道稱Bax可促進(jìn)Caspase活化，而Caspase-3則是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[25]，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被廣泛用作細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物[26]。Caspase-3經(jīng)切割活化后就會變成Cleaved-Caspase-3，后者可以繼續(xù)激活Caspase-6、Caspase-7和Caspase-9，形成凋亡級聯(lián)反應(yīng)[27]。本研究結(jié)果顯示，BMP-7可以降低Bax基因，進(jìn)而降低下游的Caspase-3蛋白活化，阻止凋亡級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，部分逆轉(zhuǎn)GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。而敲低BMP-7表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)Bax基因表達(dá)增加，導(dǎo)致下游Caspase-3活化形成Cleaved-Caspase-3增多，細(xì)胞凋亡反應(yīng)增多，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡水平增加，并加重GC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。

綜上所述，本研究觀察了不同濃度糖皮質(zhì)激素對PC12細(xì)胞凋亡水平的影響，發(fā)現(xiàn)BMP-7可以拮抗GC誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而為防治GC誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷提供新的思路和方法。鑒于GC激素對神經(jīng)細(xì)胞的影響是多方面的，BMP-7是否可以從其他方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用仍需要進(jìn)一步研究。