3 種常用碳青霉烯類(lèi)抗生素血藥濃度UPLC-MS/MS 檢測(cè)方法的建立 Δ

秦 怡 ，張瑞霞 ，呂雅瑤 ，翁莉莉 ，張 弋 （.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津 3009）

碳青霉烯類(lèi)抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐藥率低的特點(diǎn)，已成為治療重癥感染的主要選擇。最佳的抗生素劑量、適當(dāng)?shù)目股貪舛群妥銐虻慕o藥療程是重癥感染治療成功的關(guān)鍵[1]。碳青霉烯類(lèi)抗生素多為親水性藥物，主要以原型形式通過(guò)腎臟排泄，故其易受腎臟清除率和分布容積的影響[2]。半數(shù)以上的重癥患者在使用與非重癥患者劑量相同的抗生素給藥時(shí)，會(huì)出現(xiàn)劑量不足的現(xiàn)象，造成抗生素耐藥和感染控制無(wú)效，從而增加患者的住院時(shí)間，甚至降低患者的生存質(zhì)量[3]。此外，碳青霉烯類(lèi)抗生素的蓄積還會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性[4]。目前，治療藥物監(jiān)測(cè)的目的已逐步從避免藥物毒性反應(yīng)轉(zhuǎn)移為確保療效和減少治療指數(shù)較寬藥物的不良反應(yīng)[5—6]。《重癥患者β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素治療的優(yōu)化指南（2019 版）》明確指出，使用治療藥物監(jiān)測(cè)可提高β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的達(dá)標(biāo)率，降低藥物處于次優(yōu)濃度和發(fā)生劑量相關(guān)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[7]。

目前，我國(guó)臨床用碳青霉烯類(lèi)抗生素主要為亞胺培南（imipenem，IPM）、美羅培南（meropenem，MEM）、厄他培南（ertapenem，ETP），通常為單一用藥。然而有研究表明，雙碳青霉烯聯(lián)合療法（ETP 聯(lián)合MEM）可以增強(qiáng)碳青霉烯類(lèi)藥物對(duì)耐藥腸桿菌/肺炎克雷伯菌的抗菌作用，用于多黏菌素類(lèi)抗生素導(dǎo)致腎功能受損的重癥感染患者[8—9]。由于臨床用藥方案的改進(jìn)及血漿中碳青霉烯類(lèi)抗生素的不穩(wěn)定性[10]，故需滿(mǎn)足臨床上重癥患者不同碳青霉烯類(lèi)抗生素血藥濃度定量需求，即定量方法應(yīng)達(dá)到同時(shí)快速定量多種藥物血藥濃度的要求。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法靈敏度和特異度高，操作簡(jiǎn)單快速，適用于多種藥物監(jiān)測(cè)。本研究建立了一種簡(jiǎn)單快速測(cè)定3種常用碳青霉烯類(lèi)抗生素（ETP、IPM、MEM）血藥濃度的UPLC-MS/MS法，用于監(jiān)測(cè)重癥患者的血藥濃度，以期為患者個(gè)體化給藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class 系統(tǒng)、Xevo TQD系統(tǒng)、Masslynx V4.2 工作站均購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；MX-F 型固定式渦旋混合儀購(gòu)自美國(guó)Scilogex 公司；BY-G20 型高速離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

ETP（純度98.16%，批號(hào)V-806800-NU1）、IPM（純度98.14%，批號(hào)V-804800-NU1）、MEM（純度86.80%，批號(hào)130506-202004）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；ETPD4（內(nèi)標(biāo)，同位素豐度99.00%，批號(hào)12-MRS-161-1）購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；IPM-D4（內(nèi)標(biāo)，同位素豐度99.50%，批號(hào)7-MMH-92-2）、3-嗎啉丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）緩沖劑購(gòu)自美國(guó)CFW公司；MEM-D6（內(nèi)標(biāo)，同位素豐度99.70%，批號(hào)5-JUZ-42-1）購(gòu)自譜析（上海）生物科技有限公司。甲醇、乙腈均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 人血漿

血漿為健康者未用藥的空白血漿。本研究獲天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院倫理委員會(huì)審批，倫理號(hào)為科研20240124-1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為98%水+2%乙腈+0.1%甲酸，流動(dòng)相B 為98%乙腈+2%水+0.1%甲酸，梯度洗脫（0～0.50 min，95%A；0.50～0.51 min，95%A→85%A；0.51～1.60 min，85%A→65%A；1.60～1.70 min，65%A→95%A；1.70～3.50 min，95%A）；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為8 μL；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣器為8 ℃。離子源為電噴霧離子源，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）方式，檢測(cè)模式為正離子模式。ETP、IPM、MEM及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 ETP、IPM、MEM及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.2 相關(guān)溶液與血漿樣品的配制

2.2.1 穩(wěn)定劑配制

精密稱(chēng)取MOPS 緩沖劑10.46 g，置于250 mL 容量瓶中，加純水溶解并定容，得0.2 mol/L MOPS緩沖液，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.8，即得穩(wěn)定劑，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2.2 ETP、IPM、MEM標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱(chēng)取ETP、IPM、MEM 各1.00 mg，分別置于EP管中，加“2.2.1”項(xiàng)下穩(wěn)定劑250 μL 溶解，配制成質(zhì)量濃度均為4 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將上述適量ETP、IPM、MEM 儲(chǔ)備液以2∶1∶1 比例混勻，得質(zhì)量濃度分別為2 000、1 000、1 000 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用穩(wěn)定劑倍比稀釋?zhuān)肊TP 質(zhì)量濃度分別為2 000、1 000、200、100、20、10、5、2 μg/mL，IPM、MEM質(zhì)量濃度分別均為1 000、500、100、50、10、5、2.5、1 μg/mL 的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時(shí)，用穩(wěn)定劑配制ETP質(zhì)量濃度為1 600、100、5 μg/mL，IPM、MEM質(zhì)量濃度分別均為800、50、2.5 μg/mL 的混合質(zhì)控樣品溶液。各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于－80 ℃避光保存，系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合質(zhì)控樣品溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制

精密稱(chēng)取ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6各1.00 mg，分別置于5 mL 棕色容器中，加穩(wěn)定劑溶解并定容，搖勻，配制成ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 質(zhì)量濃度均為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取適量?jī)?chǔ)備液，加穩(wěn)定劑稀釋得ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 質(zhì)量濃度分別為25、100、25 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，分裝后于－80 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品和質(zhì)控血漿樣品的配制

精密吸取180 μL空白血漿，置于1.5 mL離心管中，加入ETP、IPM、MEM 混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，渦旋15 s 混勻，得ETP 質(zhì)量濃度為200、100、20、10、2、1、0.5、0.2 μg/mL，IPM、MEM質(zhì)量濃度分別均為100、50、10、5、1、0.5、0.25、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。混合步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品，配制成ETP 質(zhì)量濃度為160、10、0.5 μg/mL，IPM、MEM質(zhì)量濃度分別均為80、5、0.25 μg/mL的高、中、低濃度的混合質(zhì)控血漿樣品溶液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

精密吸取100 μL 血漿樣品，與穩(wěn)定劑1∶1 混合，加入10 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液（ETP-D4 為25 μg/mL，IPM-D4為100 μg/mL，MEM-D6 為25 μg/mL），渦旋15 s；加入400 μL甲醇，渦旋30 s，以13 000 r/min離心10 min；取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液100 μL，加超純水300 μL，渦旋10 s，以13 000 r/min離心10 min后取上清液，進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專(zhuān)屬性

分別取健康者的空白血漿加入中濃度的混合質(zhì)控樣品溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，均按“2.3”項(xiàng)下方法處理，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，ETP、IPM、MEM與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)色譜峰峰形良好，完全分離。ETP 和ETP-D4 保留時(shí)間均為1.60 min；MEM和MEM-D6保留時(shí)間均為1.30 min；IPM和IPM-D4以雙峰存在，其中IPM雙峰保留時(shí)間為0.49、0.62 min，IPM-D4 雙峰保留時(shí)間為0.56、0.72 min。人血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，該方法專(zhuān)屬性良好。結(jié)果見(jiàn)圖1（空白血漿圖略）。

圖1 ETP、IPM、MEM及其內(nèi)標(biāo)的MRM圖譜

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與定量下限

取ETP、IPM、MEM混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品，每一質(zhì)量濃度各3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，記錄峰面積。分別以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），3種藥物與其內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），采用W＝1/X2進(jìn)行線(xiàn)性回歸運(yùn)算，得到ETP、IPM、MEM 在0.2～200、0.1～100、0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，線(xiàn)性方程分別為Y＝2.877 67X－0.082 915（r2＝0.997）、Y＝4.195 77X－0.167 327（r2＝0.993）、Y＝6.256 62X－0.074 893（r2＝0.994）。以最低濃度為定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）。取6 份ETP、IPM、MEM 質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后記錄實(shí)測(cè)濃度。實(shí)測(cè)濃度的相對(duì)誤差（relative error，RE）＜3.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜9.41%。

2.4.3 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取不同來(lái)源空白血漿配制低（ETP 為0.5 μg/mL，IPM、MEM分別均為0.25 μg/mL）、中（ETP為10 μg/mL，IPM、MEM 分別均為5 μg/mL）、高（ETP 為160 μg/mL，IPM、MEM 分別均為80 μg/mL）3 種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備6份，將對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值記為A。取6份不同來(lái)源的空白血漿按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入高、中、低3種質(zhì)量濃度混合質(zhì)控樣品溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值記為B。取6 份低（ETP 為5 μg/mL，IPM、MEM分別均為2.5 μg/mL）、中（ETP為100 μg/mL，IPM、MEM分別均為50 μg/mL）、高（ETP為1 600 μg/mL，IPM、MEM分別均為800 μg/mL）3種質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品溶液10 μL，與190 μL穩(wěn)定劑、400 μL甲醇混勻，以超純水適當(dāng)稀釋后上樣檢測(cè)，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值記為C。提取回收率（%）＝A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）＝B/C×100%。結(jié)果顯示，ETP、IPM、MEM 低、中、高3種質(zhì)量濃度混合質(zhì)控樣品內(nèi)標(biāo)歸一化的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)較一致，全部RSD≤12.99%，詳見(jiàn)表2。

表2 ETP、IPM、MEM 混合質(zhì)控樣品內(nèi)標(biāo)歸一化的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)（n＝6）

2.4.4 精密度和準(zhǔn)確度

配制ETP 質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、10、160 μg/mL，IPM、MEM 質(zhì)量濃度分別均為0.1、0.25、5、80 μg/mL 的LLOQ 和低、中、高質(zhì)量濃度的混合血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備5 份，連續(xù)3 d重復(fù)測(cè)定，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度。ETP、IPM、MEM的LLOQ和低、中、高質(zhì)量濃度的批內(nèi)、批間RE均≤5.14%、RSD均≤11.15%，詳見(jiàn)表3。

表3 ETP、IPM、MEM 在血漿中的批內(nèi)及批間精密度和準(zhǔn)確度（n＝5）

2.4.5 穩(wěn)定性

待測(cè)物低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品溶液與血漿混合后，分別在室溫放置4、8、12、24 h 和4 ℃放置4、8、12、24 h 考察血漿樣品短期穩(wěn)定性，在－80 ℃冰箱凍存60 d考察血漿樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性；凍融循環(huán)3次考察血漿樣品凍融穩(wěn)定性。血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后置于處理進(jìn)樣器（8 ℃）和室溫4、8、12、24 h，室溫放置4、8、12、24 h，考察處理后血漿樣品穩(wěn)定性。4 000 μg/mL的ETP、IPM、MEM 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分裝，置于－80 ℃凍存60 d，考察儲(chǔ)備液穩(wěn)定性。RE 和RSD 均＜15%視為穩(wěn)定性良好。結(jié)果顯示，ETP、IPM、MEM血漿樣品在室溫條件下分別可以穩(wěn)定8、4、8 h，在4 ℃下分別可以穩(wěn)定24、8、24 h，在－80 ℃冰箱凍存60 d、凍融循環(huán)3 次穩(wěn)定性良好。ETP、IPM、MEM 血漿樣品處理后在進(jìn)樣器（8 ℃）中分別可以穩(wěn)定24、4、24 h，室溫條件下分別可以穩(wěn)定8、4、8 h。ETP、IPM、MEM標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液在－80 ℃冰箱凍存60 d可以保持穩(wěn)定。

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

穩(wěn)定性同位素內(nèi)標(biāo)是UPLC-MS/MS 定量分析方法的首選，本實(shí)驗(yàn)選擇ETP-D4、IPM-D4、MEM-D6 這3 種同位素內(nèi)標(biāo)，分別與3種待測(cè)物ETP、IPM、MEM一一對(duì)應(yīng)。同位素內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物的理化性質(zhì)完全一致，不僅可以消除儀器進(jìn)樣的誤差，還在最大程度上消除了基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)調(diào)諧結(jié)果分別比較了4 對(duì)IPM-D4 離子對(duì)（304.14→107.01、304.14→141.98、304.07→97.91、304.07→106.96）的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)參數(shù)和響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，304.14→141.98、304.07→97.91 這2 組保留時(shí)間與IPM 一致，但其信噪比和響應(yīng)強(qiáng)度均不佳；304.14→107.01 雖與IPM 保留時(shí)間不一致，但其峰面積位于IPM線(xiàn)性范圍中段且線(xiàn)性范圍良好。

3.2 血漿樣品與前處理方法的選擇

研究顯示，與血清、檸檬酸鹽乙二胺四乙酸血漿樣品相比，肝素化血漿樣品中IPM 和MEM 質(zhì)量濃度超過(guò)標(biāo)稱(chēng)值的115%，低濃度尤其明顯，故本實(shí)驗(yàn)血樣采集選擇檸檬酸鹽乙二胺四乙酸抗凝管[4]。生物樣品前處理方法常用蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等，碳青霉烯類(lèi)抗生素較不穩(wěn)定，簡(jiǎn)單、高效的前處理方法可最大限度地縮短樣品周轉(zhuǎn)時(shí)間，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了操作簡(jiǎn)單的蛋白沉淀法。本實(shí)驗(yàn)前處理中比較了以甲醇（分別為3∶1、4∶1、5∶1）和乙腈（分別為2∶1、3∶1、4∶1）沉淀血漿樣品蛋白的6種方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈沉淀血漿樣品蛋白時(shí)，無(wú)論其比例如何，ETP 均出現(xiàn)裂峰，IPM、MEM 出現(xiàn)不同程度的分峰或拖尾。以甲醇3∶1 沉淀血漿樣品蛋白時(shí)，IPM分峰；以甲醇5∶1沉淀血漿樣品蛋白時(shí)，IPM 峰展寬，ETP 出現(xiàn)前沿峰；以甲醇4∶1 沉淀血漿樣品蛋白時(shí)，ETP、IPM、MEM 峰形和響應(yīng)強(qiáng)度均較好，同時(shí)蛋白沉淀效果良好，故本研究最終選擇甲醇4∶1沉淀血漿樣品蛋白。沉淀蛋白后上清液與流動(dòng)相初始梯度極性相差較大，直接上樣后ETP、IPM、MEM不同程度地出現(xiàn)拖尾峰。為確保分析物峰形良好并降低基質(zhì)效應(yīng)，上樣前應(yīng)加水稀釋上清液，且當(dāng)上清液與水的比例為1∶3時(shí)，化合物的峰形、線(xiàn)性范圍、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率均良好。

3.3 碳青霉烯類(lèi)抗生素穩(wěn)定性分析

碳青霉烯類(lèi)抗生素，尤其是IPM 在血漿中極不穩(wěn)定，并且會(huì)受到濃度與溫度的影響[10]。兼性離子緩沖液可延緩碳青霉烯類(lèi)抗生素的降解[11—12]，故本實(shí)驗(yàn)選擇0.2 mol/L MOPS 作為穩(wěn)定劑。但是MOPS 可能會(huì)損傷色譜柱，干擾方法穩(wěn)定性，并且會(huì)增加檢測(cè)成本[13]。所以本實(shí)驗(yàn)只在保存樣品與制備樣品時(shí)加入穩(wěn)定劑，不在流動(dòng)相中加入穩(wěn)定劑。此外，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)pH 敏感，當(dāng)pH＞6 時(shí)，會(huì)產(chǎn)生降解，且堿性越強(qiáng)降解越快。因此，本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相的水相和有機(jī)相中加入0.1%甲酸調(diào)節(jié)pH，使流動(dòng)相pH 為酸性，同時(shí)避免堿性物質(zhì)加入，減少藥物降解[14]。

臨床上若對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，應(yīng)重視取血到上機(jī)分析時(shí)的保存條件和溫度。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將IPM置于4 ℃保存12 h或凍融循環(huán)3次后，僅高濃度組不滿(mǎn)足穩(wěn)定性要求（RE＞15%）。以往研究表明，更高的溫度與藥物濃度會(huì)導(dǎo)致IPM注射液穩(wěn)定性降低，故臨床上檢測(cè)IPM 血藥濃度應(yīng)傾向選擇穩(wěn)態(tài)谷濃度[10]。

3.4 IPM雙峰現(xiàn)象

IPM 已被證明在水溶液中存在順式和反式兩種形式的構(gòu)象異構(gòu)體[4]。IPM的兩種構(gòu)象異構(gòu)體處于平衡狀態(tài)，可以通過(guò)UPLC 分離[15—16]。本實(shí)驗(yàn)中IPM 以穩(wěn)定的雙峰形式存在，未發(fā)生展寬或者合并現(xiàn)象，且基線(xiàn)未完全分離，因此根據(jù)雙峰的總面積進(jìn)行定量。此外，本實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)IPM-D4矯正了在測(cè)量濃度范圍內(nèi)IPM 的峰形變化及與IPM 共洗脫極性?xún)?nèi)源性化合物的基質(zhì)效應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了一種可以同時(shí)定量臨床3種常用碳青霉烯類(lèi)抗生素（ETP、IPM、MEM）血藥濃度的UPLC-MS/MS 法，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，所需樣品量少，可以滿(mǎn)足臨床上（尤其重癥患者）對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素血藥濃度的監(jiān)測(cè)需求。