正交實驗結合AHP和GA-BP神經網(wǎng)絡優(yōu)化益黃散醇提工藝 Δ

王 巍 ，楊武杰 ，韓 宇 ，安悅言 ，郝 季 ，張 強 ，鞠成國 （.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；.遼寧中醫(yī)藥大學醫(yī)學檢驗學院，遼寧 沈陽 0874）

益黃散出自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，又名補脾散，為補脾經典方劑。該方由陳皮、青皮、炮訶子、炙甘草、丁香組成，用于治療小兒脾胃虛弱、脾疳、腹大、身瘦[1]。方中陳皮用量獨大，為君藥，性溫，味辛、苦，專入脾胃，行氣健脾；青皮性溫，味苦，為臣藥，有疏肝破氣、消積化滯之效；訶子性溫，味酸、澀，為臣藥，炮制后澀腸止瀉效果更佳；炙甘草性平，味甘，為佐藥，補脾和胃，調和諸藥；丁香性溫，味辛，為使藥，入胃，溫中散寒降逆；諸藥合用，共奏健運脾氣、行氣化濕之功[2]。該方在現(xiàn)代臨床多用于治療小兒厭食癥及脾虛泄瀉，用法以湯劑為主，但以上5 味藥材水煎液苦澀味重，兒童服用依從性差，因此將其開發(fā)成適合兒童使用的現(xiàn)代劑型尤為重要。文獻研究表明，方中各味藥材所含化學成分（如橙皮苷、訶子酸、甘草酸、丁香酚）等均具有良好的醇溶性[3—6]，加上本課題組前期預實驗結果表明，方中各化學成分的水提取率較低。因此，為了充分提取該方中有效成分，本研究擬對該方醇提工藝進行優(yōu)化研究。

層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）是一種將定性與定量相結合的系統(tǒng)的層次化的分析方法，其通過將復雜問題分解成多個因素，再對多個因素進行兩兩比較，最終確定各因素的權重大小[7]。反向傳播神經網(wǎng)絡（back propagation neural network，簡稱BP 神經網(wǎng)絡）是按誤差逆?zhèn)鞑ニ惴ㄓ柧毜亩鄬忧梆伨W(wǎng)絡，通過梯度下降法的思想，使網(wǎng)絡預期值與實際值均方誤差最小，已在中藥提取工藝研究中得到廣泛應用[8]。但BP神經網(wǎng)絡存在收斂速度慢，易陷入局部最小值等缺點[9]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）是結合了進化論和遺傳學機理的全局尋優(yōu)算法[10]，能對BP神經網(wǎng)絡的初始權重和閾值進行優(yōu)化，提高其收斂速度，避免陷入局部最小值[11]。

基于以上理論分析，本研究擬采用正交實驗設計，利用AHP確定各指標權重并計算綜合評分，再對正交實驗結果和GA-BP神經網(wǎng)絡預測結果進行驗證，確定益黃散最佳醇提工藝參數(shù)，為新劑型開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-16 型高效液相色譜儀[島津儀器（蘇州）有限公司]、FA1004B 型萬分之一分析天平（上海精密科學儀器有限公司）、METTLER AE240型十萬分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、U3010型紫外-可見分光光度儀（日本Hitachi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

陳皮（批號2209007，產地四川）、青皮（批號2210002，產地江西）、訶子（批號2208002，產地廣西）、炙甘草（批號2208005，產地內蒙古）、丁香（批號2209001，產地廣西）均購自安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院宋慧鵬副教授鑒定分別為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco.的干燥成熟果皮和未成熟果實的果皮、使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制加工品、桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾。

對照品橙皮苷（批號MUST-16041806）、沒食子酸（批號MUST-13040103）、甘草苷（批號MUST-16032801）、甘草酸單銨鹽（批號MUST-16032110）、丁香酚（批號MUST-16040204）均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于98%；對照品川陳皮素（批號PCS-220412）、橘皮素（批號PCS-220402）均購自成都植標化純生物技術有限公司，純度均大于98%；對照品訶黎勒酸（批號PRF8112302）、訶子酸（批號PRF8071201）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 益黃散干浸膏的制備及干浸膏得率的測定

按處方配比稱取陳皮40 g、青皮20 g、炮訶子（取凈訶子置鍋內，文火加熱，炒至深黃色，取出，放涼，砸去果核，留取果肉，即得）20 g、炙甘草20 g、丁香8 g，共同置于粉碎機中粉碎，得處方樣品。取處方樣品加入一定量乙醇溶液，加熱回流提取，4 層200 目絹布過濾，濾液經減壓濃縮和60 ℃真空干燥，即得益黃散干浸膏。精密稱定干浸膏質量，計算干浸膏得率。

2.2 益黃散干浸膏中9種活性成分的含量測定

2.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加甲醇配制成含橙皮苷1 820.0 μg/mL、川陳皮素220.0 μg/mL、橘皮素180.0 μg/mL、沒食子酸860.0 μg/mL、訶黎勒酸1 220.0 μg/mL、訶子酸1 540.0 μg/mL、甘草苷820.0 μg/mL、甘草酸870.0 μg/mL、丁香酚340.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取“2.1”項下所得干浸膏0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入40%甲醇10 mL，超聲（功率240 W，頻率40 kHz）5 min 使完全溶解，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

分別稱取缺陳皮和青皮、缺炮訶子、缺炙甘草、缺丁香的益黃散處方，按“2.1”項下方法制備干浸膏，再按“2.2.2”項下方法制備各陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗及色譜峰的歸屬

色譜柱為菲羅門Titank C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸-5%甲醇溶液，梯度洗脫（0～8 min，5%A→6%A；8～12 min，6%A→12%A；12～30 min，12%A→17%A；30～58 min，17%A；58～68 min，17%A→30%A；68～80 min，30%A→50%A；80～90 min，50%A→60%A；90～95 min，60%A→80%A）；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長分別為283 nm（0～80 min）、250 nm（80～82 min）、283 nm（82～86 min）、330 nm（86～95 min）。取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項下各溶液，按上述色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果顯示，該色譜條件下各成分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。其中色譜峰5（橙皮苷）、8（川陳皮素）、9（橘皮素）來源于陳皮與青皮，色譜峰1（沒食子酸）、2（訶黎勒酸）、4（訶子酸）來源于炮訶子，色譜峰3（甘草苷）、6（甘草酸）來源于炙甘草，色譜峰7（丁香酚）來源于丁香。

圖1 混合對照品和各缺味陰性樣品的HPLC圖

2.2.5 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，用甲醇依次稀釋2、4、8、16、32、64、128倍，然后按“2.2.4”項下色譜條件進樣檢測，記錄各成分色譜峰峰面積，以各成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。所得線性回歸方程和線性范圍如下：橙皮苷Y＝12 559X－225.4（r＝0.999 9），線性范圍為56.9～1 820.0μg/mL；川陳皮素Y＝27 193X+200.65（r＝0.999 9），線性范圍為6.9～220.0 μg/mL；橘皮素Y＝32 786X+151.4（r＝0.999 6），線性范圍為5.6～180.0 μg/mL；沒食子酸Y＝24 286X+85.7（r＝0.999 7），線性范圍為26.9～860.0μg/mL；訶黎勒酸Y＝9 485.2X+14.8（r＝0.999 9），線性范圍為38.1～1 220.0 μg/mL；訶子酸Y＝11 410X+90.1（r＝0.999 8），線性范圍為48.1～1 540.0 μg/mL；甘草苷Y＝10 113X+78.8（r＝0.999 9），線性范圍為25.6～820.0μg/mL；甘草酸Y＝4 710.4X+46.6（r＝0.999 8），線性范圍為27.2～870.0 μg/mL；丁香酚Y＝3 367.1X－33.8（r＝0.999 7），線性范圍為10.6～340.0 μg/mL。結果表明，各成分在其進樣質量濃度范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次進行檢測，測得橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚峰面積的RSD分別為0.42%、0.63%、0.24%、1.12%、0.44%、0.39%、1.27%、0.82%、1.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并于制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.4”項下色譜條件進樣檢測，測得橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚峰面積的RSD 分別為0.53%、0.76%、0.71%、0.48%、1.05%、0.78%、1.26%、0.92%、0.74%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復性試驗

按“2.1”項下方法平行制備6 份益黃散干浸膏，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰峰面積，代入“2.2.5”項下線性回歸方程計算各成分含量。結果顯示，橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚的平均含量分別為4.44、0.33、0.17、1.33、8.54、10.29、1.41、1.47、1.69 mg/g，RSD 分別為0.36%、0.75%、0.52%、0.95%、1.06%、1.25%、0.78%、0.52%、0.93%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

取“2.1”項下已知待測成分含量的處方樣品6份，每份2 g，分別按1∶1的比例精密加入各對照品，按“2.1”項下方法制備益黃散干浸膏，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚的平均加樣回收率分別為98.16%、99.32%、101.47%、99.02%、97.25%、98.72%、101.24%、98.29%、99.22%，RSD分別為0.78%、1.32%、0.83%、0.68%、1.41%、0.87%、0.74%、1.06%、0.93%（n＝6），表明該方法準確度較好。

2.3 益黃散中各指標權重的確定及樣品綜合評分計算

2.3.1 AHP判斷矩陣的建立

采用SPSSPRO 在線數(shù)據(jù)分析平臺（https：//www.spsspro.com）進行分析。根據(jù)“君臣佐使”原則、主要活性成分的藥效作用及含量，設置各指標的重要程度依次為橙皮苷＞川陳皮素＝橘皮素＝沒食子酸＝訶黎勒酸＝訶子酸＞甘草苷＝甘草酸＞丁香酚≈干浸膏得率，再利用AHP 一致矩陣法，將各項指標進行兩兩比較，構建AHP指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，詳見表1。

表1 AHP指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

2.3.2 計算各指標權重系數(shù)

根據(jù)“2.3.1”項下所得的AHP 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，采用和積法計算各指標權重系數(shù)，得到橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚、干浸膏得率的權重系數(shù)（W1～W10）依次為20.631%、11.741%、11.741%、11.741%、11.741%、11.741%、6.449%、6.449%、3.884%、3.884%。

2.3.3 一致性檢驗

對矩陣進行一致性檢驗，所得一致性指標（consistency index，CI）為0.005，一致性比例（consistency ratio，CR）為0.004，均小于0.1，表明該矩陣具有一致性[7]。

2.3.4 綜合評分計算

根據(jù)“2.3.2”項下所得權重系數(shù)，按公式（1）計算單因素考察和正交實驗所得供試品的綜合評分。式中Y1～Y9依次為供試品中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸、甘草苷、甘草酸、丁香酚的含量，Y10為干浸膏得率，Y1MAX～Y9MAX依次為同一實驗的供試品中上述成分含量的最大值，Y10為同一實驗的供試品干浸膏得率的最大值。

2.4 正交實驗優(yōu)化益黃散醇提工藝

2.4.1 因素與水平的確定

本研究前期以乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以綜合評分為考察指標進行了單因素考察，并根據(jù)單因素考察結果確定了乙醇體積分數(shù)為50%～70%、液料比為10∶1～14∶1（mL/g）、提取時間為60～120 min、提取次數(shù)為2次。

2.4.2 正交實驗設計

按“2.1”項下方法放大制備處方樣品，取該處方樣品9 份，每份10 g，用于正交實驗。根據(jù)單因素考察結果，以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，以綜合評分為考察指標，設計3 因素3 水平的L9（34）正交實驗，因素與水平見表2。按“2.1”項下方法制得益黃散干浸膏，測定干浸膏得率，每個序號平行3次實驗；按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進樣檢測并代入線性回歸方程計算各成分含量，取平均值，計算綜合評分。

表2 正交實驗優(yōu)化益黃散醇提取工藝的因素與水平

2.4.3 正交實驗結果及分析

正交實驗安排與結果見表3，由直觀分析結果可知，各因素對綜合評分的影響作用強弱依次為B＞A＞C，各因素不同水平對綜合評分的影響作用強弱依次為A2＞A3＞A1、B3＞B1＞B2、C2＞C3＞C1。方差分析結果見表4，由結果可知，B因素對綜合評分有顯著影響（P＜0.05），A、C因素對綜合評分無顯著影響（P＞0.05）。因此，確定正交實驗所得益黃散最佳醇提工藝為A2B3C2，即乙醇體積分數(shù)為60%、液料比為14∶1（mL/g）、提取時間為90 min、提取2次。

表3 正交實驗安排與結果（n＝3）

表4 方差分析結果

2.5 GA-BP神經網(wǎng)絡建模預測益黃散最佳醇提工藝

2.5.1 GA-BP神經網(wǎng)絡建模

利用MATLAB R2021b 軟件構建3 層結構的BP 神經網(wǎng)絡，輸入層神經元個數(shù)設置為3，分別為乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）；輸出層神經元個數(shù)設置為1，即綜合評分；通過查閱文獻和試錯法確定隱藏神經元個數(shù)為5。以9 組正交實驗數(shù)據(jù)為訓練樣本進行GA-BP 神經網(wǎng)絡建模，選擇tansig 函數(shù)作為隱含層傳遞函數(shù)，purelin函數(shù)作為輸出層傳遞函數(shù)，采用GA全局搜索BP神經網(wǎng)絡的最佳初始權值和閾值，提高BP神經網(wǎng)絡收斂速度和預測精度。設置總體進化迭代次數(shù)為80、種群規(guī)模為10、交叉概率為0.4、變異概率為0.05，進行全局尋優(yōu)，確定BP 神經網(wǎng)絡最佳初始權值和閾值。設定網(wǎng)絡訓練參數(shù)值，最大訓練次數(shù)為 5 000 000次，訓練精度為0.001，學習率為0.5；采用sim仿真函數(shù)進行仿真輸出網(wǎng)絡預測，最終對構建好的GA-BP神經網(wǎng)絡模型進行驗證。驗證結果顯示，所構建的GA-BP神經網(wǎng)絡的均方誤差為0.000 12，預測值與真實值之間的相對誤差為0.82%，表明訓練后的GA-BP神經網(wǎng)絡預測性能良好。

2.5.2 益黃散最佳提取工藝預測

設置醇提工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)50%～70%（步長為5）、液料比10:1～14∶1（步長為1）、提取時間為60～120 min（步長為10），將各因素進行排列組合，共排列出150種組合。在訓練好的GA-BP神經網(wǎng)絡基礎上，輸入排列出的150 種醇提工藝參數(shù)進行預測。預測結果顯示，乙醇體積分數(shù)為65%、液料比為14∶1（mL/g）、提取時間為60 min時綜合評分最高，為84.45分，因此確定以上參數(shù)為最佳預測醇提工藝參數(shù)。

2.6 兩種方法所得最佳提取工藝的驗證實驗

分別對正交實驗以及正交實驗結合AHP 和GA-BP神經網(wǎng)絡預測得到的最佳提取工藝進行驗證。按“2.1”項下方法平行制備3份益黃散干浸膏，測定干浸膏得率；按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定各成分含量，計算綜合評分，驗證實驗結果見表5。結果顯示，GA-BP神經網(wǎng)絡預測的益黃散最佳醇提工藝綜合評分較高，因此確定益黃散最佳醇提工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)為65%，液料比為14∶1（mL/g），提取時間為60 min，提取2次。

表5 驗證實驗結果（n＝3）

3 討論

文獻研究表明，陳皮中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素是其發(fā)揮燥濕健脾的主要活性成分，常作為陳皮的質量標志物[12—13]。青皮、陳皮植物來源相同，采收時間不同，兩者化學成分相近但含量有所差異[14]。研究表明，陳皮與青皮中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素含量的明顯差異可用于解釋兩者功效的差異[15]，故筆者推測橙皮苷、川陳皮素、橘皮素同樣可作為青皮的質量標志物。趙鹿等[16]通過對訶子的化學成分、藥理作用等進行分析，推測沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸可作為訶子及其炮制品的質量標志物。孫媛等[17]結合指紋圖譜及網(wǎng)絡藥理學研究，推測甘草苷、甘草酸可作為甘草及其炮制品的質量標志物。丁香中的丁香酚是丁香揮發(fā)油的主要活性成分，占70%以上[18]，可作為丁香的質量標志物。本研究以各藥味的質量標志物為指標優(yōu)化益黃散醇提工藝，有利于保證復方藥效的發(fā)揮。另外，由于質量標志物與藥味的功效具有極高的相關性，以質量標志物為指標進行提取工藝優(yōu)化，所得提取物可代表該藥味的主要藥效成分群，亦可代表該藥味所發(fā)揮的功效。因此，可根據(jù)藥味在復方中“君臣佐使”的地位進行對應指標成分的權重設置。

正交實驗因其高效率、快速、經濟等優(yōu)點，已在中藥提取工藝研究中得到廣泛應用，但這種優(yōu)化方式所得結果具有一定局限性，而基于正交實驗結果所搭建的GABP 神經網(wǎng)絡能對任意提取工藝參數(shù)進行預測，可得到最佳預測提取工藝參數(shù)。本研究對正交實驗所得最佳工藝參數(shù)與GA-BP 神經網(wǎng)絡預測所得最佳工藝參數(shù)進行比較驗證，結果表明預測所得工藝的綜合評分高于正交實驗工藝，證明了GA-BP 神經網(wǎng)絡預測結果的可靠性。

綜上，采用正交實驗結合GA-BP神經網(wǎng)絡的尋優(yōu)方法較傳統(tǒng)的正交實驗尋優(yōu)方法效果更佳，其優(yōu)選出的益黃散最佳醇提工藝[乙醇體積分數(shù)65%、液料比14∶1（mL/g）、提取時間60 min、提取2次]穩(wěn)定可靠。