基于UPLC-QE-HF-MS/MS技術(shù)分析紅涼傘化學(xué)成分及入血成分 Δ

石 慧 ，李 曉 周 英 丁晶鑫 劉 暢 劉雄偉 董 秀 ，陳 贇 俸婷婷 （.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴陽 55005；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)納米藥物技術(shù)研究中心，貴陽 55005；.貴州三力制藥股份有限公司，貴州 安順 5600）

紅涼傘是紫金?？谱辖鹋僦参锛t涼傘Ardisia crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根莖，是壯族、瑤族常用民間草藥[1—2]。紅涼傘具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、止咳平喘等功效，常用于治療跌打損傷、關(guān)節(jié)疼痛、扁桃體炎、咽喉腫痛、腰背痛等[3—4]。紅涼傘中主要化學(xué)成分有三萜皂苷類、黃酮類、香豆素類和酚酸類等多種成分[5—6]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗病毒、抗腫瘤、防治心腦血管疾病及抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移等作用[7—8]。但紅涼傘治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，且關(guān)于紅涼傘的化學(xué)成分研究較少?；谥兴幯逅幬锘瘜W(xué)理論，中藥真正發(fā)揮功效的活性成分與其所含的固有成分往往不同，只有從血中發(fā)現(xiàn)直接作用的活性物質(zhì)并追溯其前體化合物才能真正闡明中藥發(fā)揮臨床療效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。因此，本研究采用可以高效、快速得到目標(biāo)分析物的分子離子峰和碎片離子等信息的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-QE-HF-MS/MS）對紅涼傘的化學(xué)成分進(jìn)行分析，同時依據(jù)中藥血清藥物化學(xué)理論對其入血成分進(jìn)行分析，以期為紅涼傘藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考，為建立科學(xué)的用藥依據(jù)和質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Thermo Vanquish 型超高效液相色譜儀、Thermo Q-Exactive HF/MS 四極桿串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），JP2-160型萬分之一電子天平（日本Chyo公司），XS205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司），SB-600DTY 型超聲波清洗器（寧波新芝生科技股份有限公司），MTN-2800D 型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

紅涼傘藥材于2019年10月采集于貴州省凱里市雷山縣雷公山，并經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為紫金?？谱辖鹋偌t涼傘A.crenataSims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen 的干燥根及根莖。對照品巖白菜素（批號PS000991）、朱砂根皂苷A（批號PS011516）、丁香酸（批號D-019-180426）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜級，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康雄性清潔級SD 大鼠，共12只，體重（200±20） g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本研究動物實驗符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)要求（批準(zhǔn)號為20210169）。

2 方法

2.1 紅涼傘提取物的制備

稱取紅涼傘藥材250 g，加10 倍量水（mL/g）煎煮2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液。將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空干燥備用，得率為33.90%。

2.2 供試品溶液的制備

取相當(dāng)于0.2 g 生藥材質(zhì)量的提取物細(xì)粉，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲（功率180 W，頻率40 kHz）處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，收集續(xù)濾液。精密量取續(xù)濾液5 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜至進(jìn)樣杯中，供UPLC-QE-HF-MS/MS分析。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取巖白菜素、朱砂根皂苷A、丁香酸對照品約10 mg分別至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液各500 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得混合對照品溶液。

2.4 分組、給藥及取材

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用配對比較法將其隨機(jī)分為空白組和紅涼傘給藥組，每組6只。實驗期間，空白組大鼠自由攝食飲水，給藥組大鼠灌胃“2.1”項下制備的提取物（生藥質(zhì)量濃度為0.5 g/mL），給藥劑量為5 g/kg（約等于10倍成人臨床等效劑量），每天上、下午各給藥1次，連續(xù)3 d。第4天上午再次給藥1 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2.25 mL/kg）對大鼠進(jìn)行麻醉。腹主動脈取血，靜置30 min，低溫、低速離心（4 ℃，4 000 r/min，15 min），收集上清液，立刻凍存于－80 ℃冰箱中，供后續(xù)處理分析。

2.5 血清樣品處理

取空白組和紅涼傘給藥組大鼠血清各200 μL，分別加入3 倍量甲醇，渦旋混勻，在4 ℃下以10 000 r/min 離心15 min，取上清液至EP管中，以37 ℃氮?dú)獯蹈?。殘渣加?00 μL 甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，溶解，在4 ℃下以14 000 r/min 離心15 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得待測血清樣品。

光敏電阻，是利用半導(dǎo)體的光電效應(yīng)制成的一種電阻，其阻值隨入射光的強(qiáng)弱而改變，具有以下特點：光譜響應(yīng)寬；測試光強(qiáng)范圍寬，即可對強(qiáng)光響應(yīng)，也可對弱光響應(yīng)；無極性區(qū)分，使用方便，成本低，壽命長；靈敏度高，工作電流大，可達(dá)數(shù)毫安[2]。

2.6 檢測條件

2.6.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax Eclipse C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，5%A；2～7 min，5%A→30%A；7～12 min，30%A→78%A；12～14 min，78%A；14～18 min，78%A→95%A）；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；自動進(jìn)樣器溫度為4 ℃。

2.6.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子模式下檢測；加熱器溫度為325 ℃；鞘氣壓力為45 arb，輔助氣壓力為15 arb，吹掃氣壓力為1 arb；電噴霧電壓為3.5 kV；毛細(xì)管溫度為330 ℃；S-Lens RF Level 為55；掃描模式為一級全掃描（full scan，m/z100→1 500）與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2，Top N＝10）；分辨率為70 000（一級質(zhì)譜）、17 500（二級質(zhì)譜）；碰撞模式為高能量碰撞解離模式。

2.7 紅涼傘化學(xué)成分及入血成分分析

取紅涼傘供試品溶液、含藥血清樣品、空白血清樣品，按“2.6”項下條件進(jìn)行UPLC-QE-HF-MS/MS 分析，記錄圖譜信息。使用Compound Discoverer 3.0 軟件進(jìn)行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作，根據(jù)二級質(zhì)譜信息，利用Thermo mzCloud 在線數(shù)據(jù)庫、Thermo mz-Vault 本地數(shù)據(jù)庫，并參照有關(guān)文獻(xiàn)和對照品質(zhì)譜信息，初步鑒定紅涼傘化學(xué)成分及入血成分。

3 結(jié)果

3.1 紅涼傘提取物化學(xué)成分鑒定

對紅涼傘樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，從紅涼傘提取物中共鑒定出34個化合物，其中包括香豆素類化合物4個、黃酮類化合物5個、黃酮苷類化合物1個、有機(jī)酸類化合物3個、酯類化合物4個、酚類化合物3個、皂苷類化合物2個、氨基酸類化合物3個、脂肪酸類化合物3個、其他類化合物6 個，詳見表1。紅涼傘樣品的總離子流圖見圖1。

表1 紅涼傘提取物中化學(xué)成分鑒定結(jié)果

圖1 正、負(fù)離子模式下紅涼傘提取物的總離子流圖

3.2 主要化合物結(jié)構(gòu)解析

本研究以化合物8為例進(jìn)行鑒定分析。在負(fù)離子模式下，化合物8的保留時間為4.556 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z327.072 2[M－H]－，分子式為C14H16O9。二級質(zhì)譜信息中，首先，母離子丟失1分子－CH2O，得到碎片離子m/z297.332 8[M－H－OCH2]－，進(jìn)一步丟失1分子－CH2OH和1分子－OH，得到碎片離子m/z249.040 2[M－HOCH2－CH2OH－OH]－，再丟失2分子H2O，得到碎片離子m/z213.936 7[M－H－OCH2－CH2OH－OH－2H2O]－；或者在丟失1分子－CH2O的基礎(chǔ)上，丟失1分子－CH2OH和1分子－CHO，得到碎片離子m/z237.039 5[M－HOCH2－CH2OH－CHO]－，進(jìn)一步丟失1分子CO2，得到碎片離子m/z193.013 4[M－H－OCH2－CH2OH－CHOCO2]－。其中，最強(qiáng)的碎片離子峰是母離子丟失1分子－C4H8O4得到碎片離子m/z207.029 3[M－H－C4H8O4]－，進(jìn)一步丟失1分子－CH3得到碎片離子m/z192.005 9[M－H－C4H8O4－CH3]－，再通過內(nèi)酯環(huán)裂解與氫位移，得到碎片離子m/z154.388 5[M－H－C4H8O4－CH3－C2O+H]－。根據(jù)碎片信息、對照品比對及文獻(xiàn)報道[10]，推測該化合物為巖白菜素，其可能裂解途徑見圖2。

圖2 巖白菜素的質(zhì)譜裂解途徑

3.2.2 黃酮及其苷類化合物的鑒定

本研究從紅涼傘提取物中共鑒定了6個黃酮及其苷類化合物，主要結(jié)構(gòu)類型為黃酮醇類及糖苷類等，本研究分別以化合物19和化合物14為例進(jìn)行鑒定分析。

在負(fù)離子模式下，化合物19 的保留時間為6.663 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z301.035 4[M－H]－，分子式為C15H10O7。母離子分別通過黃酮類化合物的2 種經(jīng)典裂解途徑——RDA裂解和裂解途徑Ⅱ裂解，得到碎片離子m/z151.002 8[M－H－C8H6O3]－和m/z107.012 6[MH－C9H6O5]－，其均為黃酮類化合物的特征碎片離子。準(zhǔn)分子離子峰m/z301.035 4[M－H]－再丟失1分子－C8H3O5得到碎片離子m/z121.028 4[M－H－C8H3O5]－。根據(jù)碎片離子信息及文獻(xiàn)報道[11]，推測該化合物為黃酮類化合物槲皮素，其可能裂解途徑見圖3。

圖3 槲皮素的質(zhì)譜裂解途徑

在正離子模式下，化合物14 的保留時間為5.840 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z611.160 7[M+H]+，分子式為C27H30O16。母離子首先丟失1 分子鼠李糖（Rha）得到碎片離子m/z465.102 5[M+H－Rha]+，再丟失1分子葡萄糖（Glc）生成m/z303.049 6[M+H－Rha－Glc]+，再進(jìn)一步丟失1 分子－CO 和2 分子－OH 獲得碎片離子m/z242.102 1[M+H－Rha－Glc－CO－2OH]+。根據(jù)碎片信息及文獻(xiàn)報道[12]，推測其為黃酮苷類化合物槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷，其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖苷的質(zhì)譜裂解途徑

3.2.3 有機(jī)酸類化合物的鑒定

在紅涼傘提取物中找到較多有機(jī)酸類化合物，此類化合物結(jié)構(gòu)相對簡單，多為苯環(huán)連接－OH、－OCH3、－COOH等基團(tuán)。

本研究以化合物7為例進(jìn)行鑒定分析。在正離子模式下，化合物7 的保留時間為4.547 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z199.060 0[M+H]+，分子式為C9H10O5。母離子脫去1分子H2O生成碎片離子m/z181.049 4[M+H－H2O]+；或者失去1 分子CO2獲得碎片離子m/z155.070 1[M+HCO2]+，在此基礎(chǔ)上再失去1分子－CH3獲得碎片離子m/z140.046 7[M+H－CO2－CH3]+，繼續(xù)丟失1 分子－OH 獲得m/z123.044 2[M+H－CO2－CH3－OH]+，再丟失1 分子－CO生成碎片離子m/z95.049 6[M+H－CO2－CH3－OH－CO]+。根據(jù)碎片離子信息、對照品比對及文獻(xiàn)報道[8]，推測該化合物為丁香酸，其可能裂解途徑見圖5。

圖5 丁香酸的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 紅涼傘入血成分鑒定

本研究首先通過空白血清扣除大鼠血液中物質(zhì)對藥材入血成分分析的影響，然后通過對比含藥血清、空白血清以及紅涼傘藥材提取物的質(zhì)譜信息，根據(jù)色譜峰保留時間、質(zhì)譜裂解規(guī)律及與對照品的比較，共鑒定出5個入血成分，分別為L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A、麥考酚酸，詳見表2。正、負(fù)離子模式下大鼠空白血清及含藥血清的總離子流圖見圖6。

表2 紅涼傘提取物入血成分鑒定結(jié)果

圖6 正、負(fù)離子模式下大鼠空白血清及含藥血清的總離子流圖

3.4 對照品驗證

在紅涼傘提取物的化學(xué)成分及入血成分中，巖白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A這3個成分均有檢出。因此，本研究選擇巖白菜素、丁香酸和朱砂根皂苷A的對照品進(jìn)行化合物驗證。將紅涼傘提取物中這3個成分的二級質(zhì)譜圖與各相應(yīng)對照品的二級質(zhì)譜圖進(jìn)行鏡像比對，發(fā)現(xiàn)兩者的碎片離子大量重合，基本可以確定為同一化合物，驗證了本研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。本研究以巖白菜素的二級質(zhì)譜圖為例進(jìn)行結(jié)果展示，詳見圖7。

圖7 巖白菜素二級質(zhì)譜圖比對鏡像圖

4 討論

本研究采用UPLC-QE-HF-MS 技術(shù)結(jié)合中藥血清藥物化學(xué)理論，鑒定出了紅涼傘提取物中的34個化學(xué)成分，并鑒定出5個原型入血成分，分別為L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A、麥考酚酸。紅涼傘的化學(xué)成分及入血成分主要為香豆素類、黃酮類、酚酸類及皂苷類成分。其中，巖白菜素為香豆素類化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)睡眠等作用，同時其對呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)有一定影響[13]；丁香酸具有治療白內(nèi)障的作用[14]；麥考酚酸是有機(jī)酸類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗癌、抗炎等作用[15—16]；朱砂根皂苷A 等三萜皂苷類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫等藥理作用[17]；L-焦谷氨酸及其衍生物具有較好的抑菌、抗氧化及抗炎作用[18]。

綜上所述，L-焦谷氨酸、丁香酸、巖白菜素、朱砂根皂苷A 及麥考酚酸可以初步推測為紅涼傘的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。但中藥化學(xué)成分復(fù)雜，部分化合物響應(yīng)值較低，本研究檢測及鑒定出的成分并不完全，研究結(jié)果具有一定局限性，后續(xù)還需進(jìn)行深入研究。