小檗堿誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞鐵死亡的作用及機(jī)制 Δ

姬健鈞，邱文奎 （開封市中心醫(yī)院骨科二病區(qū)，河南 開封 475000）

骨肉瘤具有局部侵襲、快速浸潤轉(zhuǎn)移和組織特異性等特性，是青少年和兒童中最為常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，給患者生命健康和生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重威脅。目前，臨床上針對(duì)骨肉瘤的治療方式仍以常規(guī)的手術(shù)切除、放療和化療為主，但骨肉瘤患者易耐受并且其5年總體生存率較低[1]。因此，亟須尋找高效的輔助藥物或者替代療法。

小檗堿是從中藥黃連以及其他小檗屬植物里面分離出來的異喹啉類生物堿，能夠用于多種疾病的治療，如代謝、消化、神經(jīng)和心血管系統(tǒng)疾病以及腫瘤[2—3]。有研究指出，小檗堿能夠通過誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡、自噬來抑制其增殖[4—5]。鐵死亡（ferroptosis）是一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，其特征是鐵離子依賴的脂質(zhì)過氧化物大量蓄積，與骨肉瘤細(xì)胞生長、耐藥等密切相關(guān)[6]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小檗堿可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，但采用凋亡或自噬抑制劑并不能有效緩解小檗堿誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞死亡，這提示可能存在其他的細(xì)胞死亡方式。基于此，本研究以人骨肉瘤細(xì)胞MG63為研究對(duì)象，初步探討鐵死亡在小檗堿抑制MG63細(xì)胞中的作用及其可能機(jī)制，以期為臨床上骨肉瘤的防治提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Nanodrop 2000 型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Spectra Max iD型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），DM2500 型熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司），JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司），5200型化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），1658003-Mini-Protean?Tetra 小型垂直電泳裝置、1703930-Mini Trans-Blot?型電泳槽（美國Bio-Rad 公司），5452 型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 主要藥品與試劑

小檗堿對(duì)照品（批號(hào)BWB50137，純度≥98%）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司；兔源信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）、磷酸化STAT3（phosphated STAT3，p-STAT3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)分別為bs-20382R、bsm-33058、bs-1658R、bs-41373R、bs-80295G）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000（批號(hào)11668500）購自美國Invitrogen公司；過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-STAT3（批號(hào)分別為172281、111934）均購自美國Addgene 公司；CCK-8試劑盒和細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67（nuclear proliferation associated-antigen Ki-67，Ki67）一抗（批號(hào)分別為G4103、GB111499）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Fe2+檢測(cè)熒光探針FerroOrange（批號(hào)F374）購自日本同仁化學(xué)研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）探針H2DCFDA（批號(hào)HY-D0940）購自美國MCE公司；免疫染色通透液、免疫染色封閉液、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）試劑盒、生物素標(biāo)記EMSA 探針、Alexa Fluor 647 標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗、四甲基羅丹明乙酯（TMRE）線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為P0096、P0102、S0131M、S0052、P0011、P0027、GS002、GS083B、A0468、C2001S）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p53 小干擾RNA（siRNA）和陰性對(duì)照siRNA（negative control siRNA，NC siRNA）套裝（批號(hào)A10001）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔源溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）一抗（批號(hào)D2M7A）購自美國Cell Signa- ling Technology公司。

1.3 細(xì)胞株

本研究所用人骨肉瘤細(xì)胞MG63 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將MG63 細(xì)胞接種于含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳至第5 代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 小檗堿對(duì)MG63 細(xì)胞鐵死亡和STAT3/p53/SLC7A11信號(hào)通路的影響

2.1.1 細(xì)胞分組及處理

參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）小檗堿處理組。除對(duì)照組不作干預(yù)外，其余各組MG63細(xì)胞分別加入含上述藥物的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行以下檢測(cè)。

2.1.2 MG63細(xì)胞存活率的檢測(cè)

將細(xì)胞按照5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔）、給藥和培養(yǎng)。處理結(jié)束后，每孔中加入CCK-8工作液10 μL，隨后繼續(xù)培養(yǎng)30 min。以不加細(xì)胞和藥物的空白培養(yǎng)基為空白組，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測(cè)定各孔細(xì)胞的吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝（A實(shí)驗(yàn)組－A空白組）/（A對(duì)照組－A空白組）×100%。

2.1.3 MG63細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

將細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）、給藥和培養(yǎng)，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；以免疫染色通透液透化10 min后，加入免疫染色封閉液封閉1 h；加入Ki67 一抗（稀釋比例為1∶200），4 °C 孵育過夜；加入Alexa Fluor 647 標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（稀釋比例為1∶200），室溫下避光孵育2 h；DAPI 染核10 min 后用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，采用Image J 軟件計(jì)算其相對(duì)熒光強(qiáng)度來表示蛋白表達(dá)水平。

2.1.4 MG63細(xì)胞中線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

將細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。處理結(jié)束后，用2.5%戊二醛在4 °C 下固定過夜，之后加入1%鋨酸，放置2 h 后用乙醇和丙酮進(jìn)行脫水；待包埋固化后進(jìn)行切片（切片厚度50 nm），用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛進(jìn)行雙染色，最后用透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

2.1.5 MG63細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的檢測(cè)

將細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。處理結(jié)束后，用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌3次，加入1 μmol/L的FerroOrange熒光探針工作溶液避光孵育30 min，之后用DAPI染核5 min。采用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度來表示Fe2+水平。

2.1.6 MG63細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè)

將細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于12 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。處理結(jié)束后加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的H2DCFDA 探針（10 μmol/L），繼續(xù)孵育30 min。DAPI染核后用熒光顯微鏡拍照，采用Image J 軟件測(cè)定ROS的平均熒光強(qiáng)度來表示ROS水平。

2.1.7 MG63細(xì)胞內(nèi)MDA含量和GSH水平的檢測(cè)

將細(xì)胞按照2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀分別在530、410 nm波長條件下測(cè)定A，計(jì)算MDA含量和GSH水平。

2.1.8 MG63細(xì)胞內(nèi)STAT3與DNA結(jié)合活性的檢測(cè)

采用EMSA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞按照2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。按照試劑盒說明書方法提取細(xì)胞核蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。按照EMSA試劑盒說明書要求配制反應(yīng)體系，加入生物素標(biāo)記的STAT3探針，室溫靜置25 min。進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，最后與鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶（streptavidin-HRP）反應(yīng)后經(jīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行成像，采用Image J軟件檢測(cè)STAT3與DNA的結(jié)合活性。

2.1.9 MG63 細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞按照2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、給藥與處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞并充分裂解，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（起始電壓80 V，待樣品基本平齊后將電壓轉(zhuǎn)為120 V，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)終止電泳），轉(zhuǎn)膜（恒流250 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h），封閉（5%脫脂奶粉）；加入p-STAT3、p53、SLC7A11、GAPDH一抗（除GAPDH一抗的稀釋比例為1∶4 000 外其余一抗的稀釋比例均為1∶1 000），4 °C 孵育過夜；漂洗結(jié)束后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像后，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

2.2 p53在小檗堿誘導(dǎo)MG63細(xì)胞鐵死亡中的作用

2.2.1 p53 siRNA轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分組

將細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按轉(zhuǎn)染試劑說明書配制p53 siRNA 和NC siRNA 的轉(zhuǎn)染體系，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組（細(xì)胞經(jīng)NC siRNA 處理）、p53 siRNA 組（細(xì)胞經(jīng)p53 siRNA 處理）、小檗堿組（細(xì)胞經(jīng)NC siRNA 處理后再用10 μmol/L 的小檗堿處理）、p53 siRNA+小檗堿組（細(xì)胞經(jīng)p53 siRNA處理后再用10 μmol/L的小檗堿處理），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入空白培養(yǎng)基/含藥培養(yǎng)基孵育24 h。

2.2.2 p53 siRNA對(duì)細(xì)胞中p53和SLC7A11蛋白表達(dá)的影響

取細(xì)胞按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行接種、分組與處理。培養(yǎng)結(jié)束后，按“2.1.9”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平。p53、SLC7A11 和GAPDH 一抗的稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000 和1∶4 000。以p53、SLC7A11 與內(nèi)參蛋白GAPDH 條帶的灰度值比值表示p53、SLC7A11蛋白的表達(dá)水平。

2.2.3 p53 siRNA對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

取細(xì)胞按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行接種、分組與處理。培養(yǎng)結(jié)束后，加入TMRE 染色工作液，放置在培養(yǎng)箱中孵育30 min；采用熒光顯微鏡觀察，采用Image J軟件分析線粒體膜電位變化。

2.2.4 p53 siRNA 對(duì)細(xì)胞中MDA 含量和GSH 水平的影響

取細(xì)胞按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行接種、分組與處理。培養(yǎng)結(jié)束后，按“2.1.7”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量與GSH水平。

2.3 過表達(dá)STAT3 對(duì)經(jīng)小檗堿處理的MG63 細(xì)胞中p53/SLC7A11信號(hào)通路的影響

2.3.1 STAT3過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分組

將MG63 細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，向每孔中加入800 μL完全培養(yǎng)基（不含抗生素），待轉(zhuǎn)染。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度。取pEGFP-N1和pEGFP-N1-STAT3質(zhì)粒各4 μg，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 質(zhì)粒）、小檗堿組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 質(zhì)粒后再用10 μmol/L 小檗堿處理）、STAT3組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-STAT3 質(zhì)粒）、STAT3+小檗堿組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-STAT3 質(zhì)粒后再用10 μmol/L 小檗堿處理），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入空白培養(yǎng)基/含藥培養(yǎng)基孵育24 h后進(jìn)行以下檢測(cè)。

2.3.2 過表達(dá)STAT3 對(duì)細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11蛋白表達(dá)的影響

按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞接種、分組與處理。培養(yǎng)結(jié)束后，按照“2.1.9”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平。p-STAT3、STAT3、p53 和SLC7A11 一抗的稀釋比例均為1∶1 000，GAPDH 一抗的稀釋比例為1∶4 000。以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.01 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 小檗堿對(duì)MG63 細(xì)胞鐵死亡和STAT3/p53/SLC7A11信號(hào)通路的影響結(jié)果

3.1.1 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組[（100.00±1.75）%，n＝6]比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L 小檗堿處理組細(xì)胞24 h 的存活率[分別為（81.62±1.94）%、（68.58±1.62）%、（56.96±1.80）%，n＝6]均顯著降低（P＜0.01）。

3.1.2 小檗堿對(duì)細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組[（100.00±2.09）%，n＝3]比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L 小檗堿處理組細(xì)胞中Ki67 蛋白表達(dá)水平[相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（71.36±2.23）%、（45.58±1.75）%、（34.92±1.44）%，n＝3]均顯著降低（P＜0.01），且Ki67 蛋白的表達(dá)水平有隨著藥物濃度增加而逐漸降低的趨勢(shì)。結(jié)果見圖1。

圖1 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)Ki67蛋白表達(dá)影響的熒光染色圖

3.1.3 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)不同濃度的小檗堿處理后，MG63 細(xì)胞線粒體體積逐漸變小，線粒體膜破裂，線粒體嵴減少或消失。結(jié)果見圖2。

圖2 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)影響的透射電鏡圖

3.1.4 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿各濃度處理組細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平均顯著升高（P＜0.01），且有隨著藥物濃度增加而逐漸升高的趨勢(shì)。結(jié)果見圖3、表1。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+和ROS 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組Fe2+熒光強(qiáng)度9.58±1.04 16.13±1.76a 30.74±2.91a 43.26±3.15a ROS熒光強(qiáng)度7.36±1.19 13.54±1.35a 22.41±2.07a 29.87±2.42a

圖3 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平影響的熒光顯微圖

3.1.5 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿各濃度處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著升高（P＜0.01），且有隨著藥物濃度增加而逐漸升高的趨勢(shì)。結(jié)果見表1、圖4。

圖4 小檗堿對(duì)MG63 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響的熒光顯微圖

3.1.6 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)MDA含量和GSH水平的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿各濃度處理組細(xì)胞內(nèi)MDA含量均顯著升高（P＜0.01），GSH 水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞內(nèi)MDA 含量和GSH 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表2 各組細(xì)胞內(nèi)MDA 含量和GSH 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組GSH/%100.00±1.86 81.35±2.52a 46.17±3.04a 34.63±2.39a MDA/（μmol/mg）1.24±0.11 2.09±0.16a 3.53±0.23a 4.62±0.36a

3.1.7 小檗堿對(duì)MG63 細(xì)胞內(nèi)STAT3 與DNA 結(jié)合活性的影響

與對(duì)照組（1.00±0.08，n＝3）比較，2.5、5.0、10.0 μmol/L小檗堿處理組細(xì)胞中STAT3與DNA的結(jié)合活性（分別為0.71±0.05、0.28±0.02、0.13±0.01，n＝3）均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 各組細(xì)胞內(nèi)STAT3與DNA結(jié)合活性的檢測(cè)結(jié)果

3.1.8 小檗堿對(duì)MG63細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p53和SLC7A11蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿各濃度處理組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p53 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且具有一定的濃度依賴性趨勢(shì)。結(jié)果見圖6和表3。

表3 各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與對(duì)照組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組2.5 μmol/L小檗堿處理組5.0 μmol/L小檗堿處理組10.0 μmol/L小檗堿處理組SLC7A11/GAPDH 0.71±0.05 0.60±0.06a 0.36±0.03b 0.28±0.03b p-STAT3/GAPDH 0.32±0.01 0.27±0.02a 0.15±0.01b 0.11±0.01b p53/GAPDH 0.39±0.02 0.54±0.04b 0.82±0.05b 1.10±0.08b

圖6 各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)的電泳圖

3.2 p53 在小檗堿誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞鐵死亡中的作用考察結(jié)果

3.2.1 p53 siRNA 對(duì)各組MG63 細(xì)胞內(nèi)p53 和SLC7A11蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿組細(xì)胞內(nèi)p53 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），SLC7A11 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細(xì)胞中p53 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），SLC7A11 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖7和表4。

表4 各組細(xì)胞內(nèi)p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組細(xì)胞內(nèi)p53 和SLC7A11 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組p53 siRNA組小檗堿組p53 siRNA+小檗堿組p53/GAPDH 0.27±0.03 0.05±0.01 0.84±0.06a 0.12±0.02b SLC7A11/GAPDH 1.19±0.11 1.13±0.08 0.35±0.03a 0.80±0.07 b

圖7 各組細(xì)胞內(nèi)p53和SLC7A11蛋白表達(dá)的電泳圖

3.2.2 p53 siRNA對(duì)MG63細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿組細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.01）；與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖8和表5。

表5 各組細(xì)胞的線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)GSH 水平、MDA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各組細(xì)胞的線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)GSH 水平、MDA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組p53 siRNA組小檗堿組p53 siRNA+小檗堿組MDA/（μmol/mg）1.37±0.12 1.40±0.16 3.75±0.34a 2.53±0.22b線粒體膜電位1.00±0.07 0.98±0.05 0.29±0.02a 0.71±0.05b GSH/%100.00±2.36 98.45±1.93 45.67±1.74a 74.02±2.59b

圖8 各組細(xì)胞線粒體膜電位的熒光顯微圖

3.2.3 p53 siRNA 對(duì)MG63 細(xì)胞內(nèi)GSH 水平和MDA 含量的影響

與對(duì)照組比較，小檗堿組細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著降低（P＜0.01），MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與小檗堿組比較，p53 siRNA+小檗堿組細(xì)胞內(nèi)GSH 水平顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表5。

3.3 過表達(dá)STAT3 對(duì)MG63 細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53和SLC7A11蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果

與對(duì)照組比較，小檗堿組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3和SLC7A11蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），p53蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與小檗堿組比較，STAT3+小檗堿組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3和SLC7A11蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），p53蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖9、表6。

表6 各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53、SLC7A11蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表6 各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3、p53、SLC7A11蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與小檗堿組比較，P＜0.01。

分組對(duì)照組小檗堿組STAT3組STAT3+小檗堿組SLC7A11/GAPDH 1.07±0.10 0.36±0.05a 1.09±0.12 0.73±0.06b p-STAT3/GAPDH 0.41±0.05 0.04±0.01a 0.57±0.06 0.30±0.04b STAT3/GAPDH 0.38±0.04 0.17±0.02a 0.82±0.07 0.65±0.07b p53/GAPDH 0.35±0.04 0.89±0.09a 0.33±0.03 0.51±0.04b

圖9 各組細(xì)胞內(nèi)STAT3/p53/SLC7A11 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

4 討論

近年來，小檗堿因其低毒與抗腫瘤特性受到了廣泛關(guān)注，其對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有良好的抑制作用。本研究結(jié)果表明，小檗堿能夠降低MG63骨肉瘤細(xì)胞的存活率。Ki67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，僅在處于分裂期的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖活性、侵襲能力的重要指標(biāo)。有研究指出，Ki67表達(dá)水平的升高與骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展呈正相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，小檗堿處理后細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)下調(diào)，這也進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

相關(guān)研究已證實(shí)，鐵死亡在骨肉瘤的治療、預(yù)后以及降低耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用[8]。細(xì)胞內(nèi)Fe2+過載是細(xì)胞鐵死亡的重要標(biāo)志，ROS 和脂質(zhì)過氧化物MDA的蓄積以及GSH的過度消耗則是細(xì)胞鐵死亡的必要條件[9]。在本研究中，小檗堿處理MG63細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS 水平和MDA 含量均升高，而GSH 水平降低。此外，透射電鏡結(jié)果顯示，小檗堿處理后出現(xiàn)了細(xì)胞線粒體體積變小、膜密度增加、線粒體嵴減少甚至消失等鐵死亡特征。這些結(jié)果表明，小檗堿能夠誘導(dǎo)MG63細(xì)胞鐵死亡。

SLC7A11可以將細(xì)胞外胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)部將胱氨酸還原為半胱氨酸，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)重要抗氧化物GSH的合成。GSH在抑制細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物累積方面有著重要作用，可防止細(xì)胞中鐵死亡程序的啟動(dòng)[10]。p53 作為一種腫瘤抑制蛋白，越來越多的證據(jù)指出，p53可通過抑制SLC7A11蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞鐵死亡[11]。本研究結(jié)果顯示，小檗堿處理后MG63 細(xì)胞內(nèi)p53 蛋白表達(dá)水平升高，而SLC7A11 蛋白表達(dá)水平降低；抑制p53 的表達(dá)能夠提高小檗堿處理組細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 蛋白表達(dá)水平，改善GSH、MDA 和線粒體膜電位等鐵死亡特異性指標(biāo)。這些結(jié)果表明，小檗堿誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞鐵死亡的作用可能與調(diào)節(jié)p53/SLC7A11信號(hào)通路有關(guān)。

STAT3的磷酸化在STAT3信號(hào)活化中起關(guān)鍵作用，p-STAT3 蛋白表達(dá)水平也與細(xì)胞鐵死亡有著密切關(guān)系[12]。研究指出，p53 作為鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，STAT3 對(duì)于p53 的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。磷酸化后的STAT3 能夠轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，通過與p53 的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來抑制p53 的表達(dá)[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，STAT3 信號(hào)失活引起的p53表達(dá)水平上調(diào)參與了糖饑餓誘導(dǎo)的腎腫瘤細(xì)胞鐵死亡[14]。骨肉瘤細(xì)胞中過度活化的STAT3 信號(hào)與骨肉瘤細(xì)胞增殖和耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[15]。這提示STAT3 可能是骨肉瘤治療的一個(gè)重要潛在靶標(biāo)。本研究結(jié)果表明，小檗堿處理后，MG63 細(xì)胞中p-STAT3、STAT3 表達(dá)水平均降低，表明小檗堿抑制了MG63 細(xì)胞中STAT3 的活化；而過表達(dá)STAT3 則減弱了小檗堿對(duì)MG63 細(xì)胞p53/SLC7A11 信號(hào)通路的影響。這些研究結(jié)果表明，小檗堿可通過抑制STAT3 活化對(duì)p53/SLC7A11信號(hào)通路起調(diào)控作用。但需要注意的是，活化的STAT3能夠下調(diào)促凋亡因子，同時(shí)促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)，來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的目的[16]。未來還需要進(jìn)一步通過不同細(xì)胞系和體內(nèi)研究，探究STAT3在小檗堿抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖中的具體作用。

綜上所述，小檗堿可誘導(dǎo)MG63 骨肉瘤細(xì)胞鐵死亡，其作用機(jī)制可能是通過作用于STAT3/p53/SLC7A11信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。