護肝布祖熱方聯(lián)合奧沙利鉑對肝細胞癌荷瘤裸鼠的減毒增效作用及機制 Δ

孟小藝 ，楊建華 ，文麗梅 ，阿依孜巴·圖爾洪 胡君萍 （.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 83007；.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，烏魯木齊 830054）

肝細胞癌是目前與癌癥相關死亡的第三大原因[1]。目前，肝癌的治療方法主要包括肝切除、肝移植等外科療法和放療及化療等，但由于這些療法的毒副作用和耐藥性，導致肝癌的預后不好[2]。目前，以奧沙利鉑為主的FOLFOX4 方案被廣泛用于肝癌的治療，且治療效果良好[3]。研究表明，奧沙利鉑可以通過下調肝癌細胞中B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表達和上調Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達來誘導肝癌細胞凋亡[4]。另有研究表明，奧沙利鉑也可以誘導自噬體增加，進而增強HepG2肝癌細胞的自噬功能[5]。但隨著奧沙利鉑臨床用量的增加，其不良反應引起了人們的廣泛關注，主要有神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)不良反應和血液毒性及肝腎毒性等[6]。

中藥復方多年來一直被用于肝細胞癌的治療，可有效改善患者的臨床癥狀。比如，槐耳清膏可以激活人肝癌細胞SK-HEP-1 自噬，從而發(fā)揮抑制癌細胞增殖的作用[7]；小柴胡湯可以上調凋亡相關蛋白Bax的表達、下調Bcl-2 的表達，從而促進人肝癌細胞Huh7 的凋亡[8]。中藥復方聯(lián)合化療藥物用于腫瘤的治療，不僅可以增強化療藥物的療效，還可以延緩耐藥性的產生，減輕其毒副反應。如貞芪扶正顆粒具有增強奧沙利鉑抑制肝癌移植瘤生長的作用[9]，槐耳顆粒可通過調控氧化還原平衡緩解奧沙利鉑所引起的肝臟損傷[10]。

護肝布祖熱方是新疆地區(qū)的保肝經典方，由芹菜根（Apii Radix）、芹菜子（Apii Semen）、菊苣根（Cichorii Radix）、菊苣子（Cichorii Semen）、菟絲子（Cuscutae Semen）、茴香根皮（Foeniculi Cortex）、小茴香（Foeniculi Fructus）7種藥味組成，具有補益肝胃、散氣止痛、利膽和利水等功效，在臨床上主要用于治療急、慢性乙型肝炎和急、慢性膽囊炎，并可聯(lián)合化療藥物用于治療肝癌等。本課題組前期研究證實了護肝布祖熱方在體外可通過調控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路誘導肝癌細胞凋亡和自噬，進而抑制肝癌細胞增殖[11]。在此基礎上，本研究擬從抗凋亡和自噬角度探討護肝布祖熱方聯(lián)合奧沙利鉑對荷瘤裸鼠的減毒增效作用，以期為拓展護肝布祖熱方的臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：AE240型分析天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]、H1750R型高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀動力測試儀器有限公司）、MultiskanGO型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、PL-200 型熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）、BC5000vet 型全自動血液分析儀（深圳邁瑞醫(yī)療器械有限公司）、Eclipse Ni-U型顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

菊苣子（批號JJZ-YP-200527）、菊苣根（批號JJZYP-191209）、茴香根皮（批號HXGP-YP-210115）藥材均購自新疆安薩爾維吾爾藥業(yè)有限公司；芹菜根（批號G30131002）、芹菜子（批號Z30142203）藥材均購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院；小茴香（批號191023）、菟絲子（批號150701）藥材均購自新疆和濟中藥飲片有限公司。以上藥材由新疆醫(yī)科大學藥學院胡君萍教授鑒定均為真品，藥材標本保存于新疆醫(yī)科大學生藥學教研室。

奧沙利鉑對照品（批號100584-202005，純度≥99%）購自中國食品藥品檢定研究院；兔抗微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（批號14600-1-AP）、鼠抗選擇性自噬接頭蛋白p62抗體（批號66184-1-lg）、鼠抗胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體（批號66470-2-lg）、鼠抗Bax 抗體（批號60267-1-lg）、鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號66009-1-lg）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號20000275）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號20000758）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗Bcl-2抗體（批號32124）購自英國Abcam公司；天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）測試盒（批號C010-2-1）和肌酐測試盒（批號C011-2-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 細胞株及動物

人肝癌Huh7 細胞株（批號CL-0120）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究所用動物為SPF 級雄性BALB/c裸鼠，共40只，體重（22±2） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0006。本研究所涉及的動物實驗均符合新疆醫(yī)科大學動物倫理委員會的相關要求，倫理批準號為IACUC-20180222-62。

2 方法

2.1 藥物制備

根據(jù)護肝布祖熱原方組成，稱取菊苣子40 g、芹菜根40 g、茴香根皮40 g、菊苣根20 g、芹菜子20 g、小茴香20 g、菟絲子10 g，混合粉碎，加水煎煮3次，煎煮時間分別2、1.5、1 h，合并3次煎液，過濾，濃縮干燥濾液得干浸膏，得率為18.82%。稱取適量護肝布祖熱方浸膏或奧沙利鉑，用無菌超純水稀釋至給藥濃度。

2.2 建模、分組與給藥

將人肝癌Huh7細胞復蘇后接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度為80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次。按照隨機數(shù)字表法選取8只裸鼠作為空白組，其余32只裸鼠復制荷瘤模型。用磷酸鹽緩沖液調整細胞密度為5×107個/mL，取0.1 mL 接種于裸鼠右側腋下，待裸鼠右側腋下出現(xiàn)黃豆粒大小的腫瘤即視為造模成功[12]。本研究造模成功率為100%。

將造模成功的32 只裸鼠按完全隨機數(shù)字表法分為模型組、護肝布祖熱方組、奧沙利鉑組和聯(lián)合用藥組，每組8只?？瞻捉M和模型組裸鼠每天灌胃生理鹽水0.1 mL；奧沙利鉑組裸鼠每周腹腔注射奧沙利鉑（10 mg/kg）[13]1次，即于實驗第0、7、14、21、28天各注射1次，每只裸鼠注射0.2 mL；護肝布祖熱方組裸鼠灌胃0.69 g/kg護肝布祖熱方浸膏溶液（根據(jù)成人臨床用量換算而得）；聯(lián)合用藥組裸鼠每周按上述劑量腹腔注射奧沙利鉑1次，同時每天灌胃護肝布祖熱方浸膏溶液。護肝布祖熱方共給藥32 d，每天給藥1次。

在給藥第1天，空白組、模型組和奧沙利鉑組裸鼠由于操作原因各死亡1 只，給藥第4 天模型組和護肝布祖熱方組裸鼠由于操作原因各死亡1 只，給藥第8 天聯(lián)合用藥組裸鼠由于操作原因死亡1只。由于裸鼠損耗，最終每組取6只裸鼠用于后續(xù)實驗。

2.3 一般狀況及腫瘤體積觀察

實驗期間觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動量、飲食、排泄等一般情況，分別在給藥第0、4、8、12、16、20、24、28、32 天觀察并記錄裸鼠體重及腫瘤體積變化，其中腫瘤體積（V）＝1/2腫瘤最長直徑（a）×腫瘤最短直徑（b）2。

2.4 熱刺激縮足潛伏期檢測

給藥第30 天，將裸鼠放入熱刺痛儀，待裸鼠穩(wěn)定后將熱刺痛儀紅外加熱中心置于裸鼠后腳掌中心，打開電源，儀器開始加熱并計時，等裸鼠因疼痛抬足后，儀器暫停加熱并停止計時，此時記錄的時間為裸鼠的熱刺激縮足反應潛伏期。

2.5 樣本取材及處理

末次給藥24 h 后，眼球取血0.7～1 mL，取出全血0.1 mL用于血常規(guī)指標檢測；剩余全血以3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，于－80 ℃下保存，用于肝、腎功能指標檢測。采用頸椎脫臼法處死裸鼠，剝離出腫瘤、脾臟組織，用生理鹽水清洗干凈，并用吸水紙吸去組織多余水分，稱重，然后分別固定在4%多聚甲醛中，用于組織病理形態(tài)學觀察。

2.6 血常規(guī)指標檢測

取“2.5”項下全血，使用血細胞分析儀測定全血中紅細胞、白細胞和血小板數(shù)量。

2.7 抑瘤率及脾臟系數(shù)檢測

稱定“2.5”項下腫瘤、脾臟組織質量，并計算抑瘤率和脾臟系數(shù)。抑瘤率＝（模型組平均瘤重－實驗組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%；脾臟系數(shù)＝脾臟質量（mg）/裸鼠體重（g）。

2.8 血清中肝、腎功能指標檢測

取“2.5”項下凍存的血清樣品，按照對應的試劑盒說明書，采用酶標儀檢測血清中AST和肌酐水平。

2.9 腫瘤組織病理形態(tài)學觀察

采用蘇木素-伊紅（HE）染色法進行觀察。將“2.5”項下腫瘤組織放入4%甲醛中固定、脫水、包埋、切片（切片厚度5 μm）后，行常規(guī)HE染色，然后在顯微鏡下觀察組織病理學變化。

2.10 腫瘤組織中自噬和凋亡相關蛋白的表達水平檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.9”項下裸鼠腫瘤組織切片浸泡于不同濃度的二甲苯中脫蠟，使用不同濃度的乙醇浸泡進行水化，檸檬酸微波修復，滴加內源性過氧化物阻斷劑后室溫孵育，然后加入血清進行封閉。封閉結束后，分別滴加Bax（稀釋比例為1∶500）、Bcl-2（稀釋比例為1∶500）、Caspase-3（稀釋比例為1∶150）、LC3（稀釋比例為1∶300）、p62（稀釋比例為1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜；滴加二抗，使用DAB 顯色、蘇木素染核、分化、脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察腫瘤組織抗原表達情況。每張切片在顯微鏡下選取3個視野進行觀察，以棕黃色為陽性表達。采用Image J 軟件計算蛋白的平均光密度值，平均光密度值越大說明蛋白表達水平越高。

2.11 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8 軟件作圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 一般狀況觀察結果

空白組和護肝布祖熱方組裸鼠在給藥期間活動正常，皮膚呈健康粉色，四肢溫度正常，飲食正常；奧沙利鉑組裸鼠在給藥第20 天后出現(xiàn)四肢冰冷、皮膚顏色發(fā)白、軟便、精神萎靡、少食、少活動等情況；聯(lián)合用藥組裸鼠上述癥狀明顯改善，其四肢溫度正常，皮膚呈健康粉色，精神和活動尚可。

3.2 腫瘤體積測定結果

給藥32 d 后，與模型組比較，各給藥組裸鼠腫瘤體積均顯著減?。≒＜0.01）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤體積顯著減小（P＜0.01）。結果見圖1。

圖1 給藥不同時間后各組裸鼠的腫瘤體積測定結果（±s，n＝6）

3.3 熱刺激縮足潛伏期測定結果

與空白組[（2.31±0.32） s]比較，模型組裸鼠熱刺激縮足潛伏期[（3.03±0.08） s]有所延長，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，護肝布祖熱方組、奧沙利鉑組裸鼠熱刺激縮足潛伏期[分別為（3.13±0.27）、（6.74±1.11） s]均不同程度延長，其中奧沙利鉑組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠熱刺激縮足潛伏期[（3.83±0.20） s]顯著縮短（P＜0.01）。

3.4 抑瘤率測定結果

與模型組比較，各給藥組裸鼠的瘤重均顯著降低（P＜0.01）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠瘤重顯著降低（P＜0.05），其抑瘤率超過了80.00%。結果見表1。

表1 各組裸鼠的抑瘤率測定結果（±s，n＝6）

表1 各組裸鼠的抑瘤率測定結果（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.01；b：與奧沙利鉑組比較，P＜0.05。

組別模型組奧沙利鉑組護肝布祖熱方組聯(lián)合用藥組抑瘤率/%－68.19 54.61 81.68瘤重/g 0.46±0.05 0.14±0.04a 0.21±0.05a 0.08±0.03ab

3.5 脾臟系數(shù)測定結果

與空白組[（3.95±0.82） mg/g]比較，模型組裸鼠的脾臟系數(shù)[（5.50±0.73） mg/g]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，奧沙利鉑組裸鼠的脾臟系數(shù)[（1.77±0.28）mg/g]顯著降低（P＜0.01），護肝布祖熱方組裸鼠的脾臟系數(shù)[（5.93±1.14） mg/g]差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠脾臟系數(shù)[（6.77±1.15） mg/g]顯著升高（P＜0.01）。

3.6 血常規(guī)指標測定結果

與空白組比較，模型組裸鼠全血中白細胞和血小板數(shù)量均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，奧沙利鉑組裸鼠全血中白細胞和紅細胞數(shù)量均顯著減少（P＜0.01），而護肝布祖熱方組裸鼠上述血常規(guī)指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠全血中白細胞、紅細胞、血小板數(shù)量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組裸鼠的血常規(guī)測定結果（±s，n＝6）

表2 各組裸鼠的血常規(guī)測定結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與空白組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與奧沙利鉑組比較，P＜0.05；e：與奧沙利鉑組比較，P＜0.01。

血小板/（109 L－1）479.67±144.79 856.50±260.82b 609.00±271.44 1 056.00±91.12 1 370.83±262.00e組別空白組模型組奧沙利鉑組護肝布祖熱方組聯(lián)合用藥組白細胞/（109 L－1）1.78±0.32 3.20±0.67a 1.18±0.39c 4.58±1.28 7.01±3.30d紅細胞/（1012 L－1）10.81±0.83 9.83±0.85 7.67±1.07c 10.04±0.26 8.89±1.25d

3.7 血清中肝、腎功能指標測定結果

與空白組比較，模型組裸鼠血清中AST和肌酐水平均有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，奧沙利鉑組裸鼠血清中AST和肌酐水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而護肝布祖熱方組裸鼠血清中上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠血清中AST和肌酐水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組裸鼠血清中肝、腎功能指標測定結果（±s，n＝6）

表3 各組裸鼠血清中肝、腎功能指標測定結果（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與奧沙利鉑組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組奧沙利鉑組護肝布祖熱方組聯(lián)合用藥組AST/（U/g prot）23.09±4.93 26.27±3.00 31.49±4.63a 21.66±2.77 22.72±5.28c肌酐/（μmol/L）29.50±12.33 32.69±8.94 46.22±7.11b 24.60±4.94 27.20±4.94c

3.8 腫瘤組織病理形態(tài)學觀察結果

模型組裸鼠腫瘤細胞排列緊密，細胞密度高，細胞核形狀規(guī)則；護肝布祖熱方組裸鼠腫瘤細胞數(shù)量減少，部分腫瘤細胞變性、破裂；奧沙利鉑組裸鼠腫瘤細胞核質不清晰，部分腫瘤細胞破裂；聯(lián)合用藥組裸鼠大部分腫瘤細胞破裂壞死，出現(xiàn)大片染紅。結果見圖2。

圖2 各組裸鼠腫瘤組織的病理形態(tài)學觀察結果（HE染色）

3.9 腫瘤組織中自噬和凋亡相關蛋白表達水平測定結果

與模型組比較，護肝布祖熱方組、奧沙利鉑組裸鼠腫瘤組織中LC3、Bax、Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），p62、Bcl-2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤組織中LC3、Bax、Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），p62、Bcl-2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖3、表4。

表4 各組裸鼠腫瘤組織中自噬和凋亡相關蛋白的表達水平測定結果（±s，n＝6）

表4 各組裸鼠腫瘤組織中自噬和凋亡相關蛋白的表達水平測定結果（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與奧沙利鉑組比較，P＜0.01。

Caspase-3 0.08±0.01 0.18±0.01a 0.10±0.01a 0.20±0.01c組別模型組奧沙利鉑組護肝布祖熱方組聯(lián)合用藥組LC3 0.08±0.01 0.15±0.00a 0.10±0.01a 0.18±0.01c p62 0.23±0.01 0.13±0.01a 0.19±0.00a 0.08±0.01c Bax 0.10±0.00 0.14±0.01a 0.11±0.01b 0.19±0.01c Bcl-2 0.19±0.01 0.12±0.01a 0.14±0.01a 0.10±0.01c

圖3 各組裸鼠自噬和凋亡蛋白表達檢測的免疫組化圖

4 討論

肝癌惡性程度高、預后差，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內一直呈上升趨勢。目前，以奧沙利鉑為主的FOLFOX4方案是治療肝癌的主要手段之一。但奧沙利鉑在用藥過程中不可避免地出現(xiàn)了一系列毒性反應，如外周神經毒性、血液毒性[14]、免疫毒性[15]和肝、腎毒性[16]。中藥復方的整體協(xié)同作用與化學藥局部治療理論互補，聯(lián)合使用可以達到優(yōu)勢互補、標本兼治的效果，在增強化學藥療效的同時還可以降低其毒副作用。因此，本研究以荷瘤裸鼠為模型，分析護肝布祖熱方聯(lián)合奧沙利鉑的增效減毒作用。本研究結果顯示，奧沙利鉑和護肝布祖熱方聯(lián)用可以增強奧沙利鉑抑制腫瘤生長的療效，提高抑瘤率。

在使用奧沙利鉑過程中80%～90%的患者會出現(xiàn)不同程度的外周神經毒性癥狀，主要體現(xiàn)在末端肢體感覺異常[17]。在本研究中，奧沙利鉑組裸鼠在給藥后，其四肢冰冷無血色、熱刺激縮足潛伏期顯著延長，而聯(lián)合用藥組裸鼠上述癥狀得到緩解，這說明護肝布祖熱方可以改善奧沙利鉑引起的外周神經毒性。此外，奧沙利鉑還具有一定的血液毒性和免疫毒性。本研究結果顯示，奧沙利鉑會造成模型裸鼠全血中白細胞、紅細胞、血小板數(shù)量減少，并可使脾臟系數(shù)降低；而與護肝布祖熱方聯(lián)合處理后，可以增加模型裸鼠全血中白細胞、紅細胞、血小板的數(shù)量，并可升高其脾臟系數(shù)。這說明護肝布祖熱方可以改善模型裸鼠造血功能及免疫功能，拮抗奧沙利鉑所造成的血液毒性和對免疫功能的影響。本研究通過檢測裸鼠血清中AST和肌酐水平變化，發(fā)現(xiàn)護肝布祖熱方聯(lián)合奧沙利鉑處理后可以顯著降低模型裸鼠血清中AST和肌酐水平，表明護肝布祖熱方可以減輕奧沙利鉑所引起的肝、腎毒性。

細胞凋亡和細胞自噬均是細胞程序性死亡的表現(xiàn)形式，大多數(shù)藥物都可以通過調節(jié)癌細胞的凋亡達到治療癌癥的目的。細胞凋亡途徑分為死亡受體介導的外源性凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑，這2條途徑均通過激活下游凋亡蛋白酶Caspase 誘發(fā)凋亡[18]?？沟蛲黾易宄蓡TBcl-2蛋白和促凋亡家族成員Bax蛋白是調節(jié)凋亡的關鍵因素，Bcl-2 和Bax 相互作用，使線粒體膜通透性改變，最終激活下游的Caspase-3，引發(fā)細胞凋亡[19]。自噬是一種依賴溶酶體的分解代謝途徑，在維持細胞內環(huán)境質量方面至關重要[20]。LC3是一種被廣泛認可的自噬標記物，當自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ會轉化為LC3-Ⅱ；p62 是一種自噬標記蛋白，能夠與LC3 結合，在自噬-溶酶體系統(tǒng)的作用下，使自身進行降解[21]。本研究結果顯示，與奧沙利鉑組比較，聯(lián)合用藥組模型裸鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3 和LC3 蛋白表達上調，Bcl-2 和p62 蛋白表達下調。以上結果表明，聯(lián)合用藥后可以促進細胞凋亡和自噬。

綜上所述，護肝布祖熱方可增強奧沙利鉑對荷瘤裸鼠的抑瘤作用，緩解奧沙利鉑產生的外周神經毒性、血液毒性、免疫器官毒性和肝腎毒性等；進一步探討其作用機制發(fā)現(xiàn)，護肝布祖熱方可能是通過誘導細胞凋亡和自噬從而起到減毒增效作用。