GW0742對凝血酶誘導的體外血腦屏障破壞的保護作用*

汪朝云，陳琴，王筱雅，熊英，張金娟，張晴，馮占輝，葉蘭

（貴州醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院藥理學教研室，2.基礎醫(yī)學院多媒體機能學實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經內科，貴州 貴陽 550025）

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是指原發(fā)非創(chuàng)傷性腦實質內血管破裂，是臨床較為常見的腦血管疾病，其主要特點表現(xiàn)為病情危重、救治難度大、致殘率及致死率較高[1-3]。據(jù)研究報道，全球每10萬人中就有10～20人會發(fā)生ICH，中國ICH患者占所有住院腦卒中患者的18.8%～47.6%[4-5]。在ICH的病理后遺癥中，因血腫引起的血腦屏障（blood brain barrier, BBB）破壞是主要問題之一，在該病的病理生理改變中起著至關重要的作用。受到外界刺激時，血腦屏障損傷的標志性蛋白基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9, MMP-9）表達增加，進一步降解基底膜，促使血腦屏障緊密連接相關蛋白ZO-1、Occludin表達降低，使血腦屏障受到破壞?；谠摬〉膬措U性及目前仍缺乏有效降低病死率和殘疾率的治療方案，本研究探索新型治療靶點和新藥物，對ICH的預防及治療具有重要的醫(yī)學意義。

GW0742是一種脂溶性高易透過血腦屏障的PPARβ/δ特異性激動劑。近年來GW0742常用于多種中樞系統(tǒng)疾病的基礎研究。有研究報道，GW0742對缺氧缺血大鼠[6-7]、孤獨癥小鼠[8]、ICH模型小鼠[9]均有保護作用?；谝陨涎芯勘尘?，本文旨在探討GW0742對凝血酶誘導體外血腦屏障破壞產生的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取新生3～7日齡的SPF級SD大鼠若干（由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供），每提取1次原代細胞取5只，雌雄均可。實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001。

1.2 主要材料與試劑

胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（美國Thermo Fisher公司，2335473CP），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher公司，8121756），牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）（北京索萊寶科技有限公司，1218Q0511），胰蛋白酶（美國Thermo Fisher公司，8122140），磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司，20210821），D-Hank's緩沖液（美國Thermo Fisher公司，20210416），青霉素-鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司，20211120），Ⅱ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，525Z023），明膠（北京索萊寶科技有限公司），嘌呤霉素（北京索萊寶科技有限公司，1221S0435），兔抗大鼠Ⅷ因子相關抗原單克隆抗體（美國Thermo Fisher公司，337E3A24），抗兔熒光二抗（上海愛必信生物科技有限公司，A23D26），凝血酶（上海Sigma公司，SLBW2056），GW0742（美國MCE公司，20371），GFAP（美國Thermo Fisher公司，WI3380251），MMP-9抗體、ZO-1抗體、Occludin抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號分別為：A0289、A11417、DF7504），高效RIPA裂解液(組織/細胞)（北京索萊寶科技有限公司，20210908），Pierce BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo Fisher公司，VK316403），PageRuler預染蛋白Marker（美國Thermo Fisher公司，00864849），PVDF微孔轉移膜（美國Millipore公司，R0BB23468）。

1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（日本尼康，TS100），正置熒光顯微鏡（蘇州世達普通信設備有限公司，RX50），臺式大容量離心機（常州朗越儀器制造有限公司，TDL-40B），恒溫搖床（山東歐萊伯儀器有限公司，THZ-82A），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司，2001HY-6003）。

1.4 方法

1.4.1 腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelium cell, BMEC）的原代培養(yǎng) 取5只新生7日齡的SD大鼠，斷頭處死后浸泡于75%無水乙醇殺菌消毒5 min，置于超凈工作臺，剪開顱骨，取出大腦半球，置于裝有4 ℃預冷的D-Hank's緩沖液的培養(yǎng)皿中，去除小腦、間腦（包括海馬組織），保留大腦皮質部，并將其置于無菌濾紙上來回滾動，以除去軟腦膜及腦膜大血管等雜質，保留大腦皮質，依次用預冷的D-Hank's液、含雙抗的培養(yǎng)基、D-Hank's緩沖液洗滌1次，期間用巴氏吸管或移液槍反復吹打以除去部分血細胞、血凝塊及軟腦膜，再將大腦皮質部轉移至5 mL離心管中剪至約1 mm×1 mm×1 mm的白色肉泥狀，過100目細胞篩，收集網下濾液，1 000 r/min離心10 min，收集沉淀并滴加8 mL 0.1 % Ⅱ型膠原酶于37 ℃搖床下消化25 min，1 000 r/min離心5 min，去除上清液后，底部沉淀加入8 mL 20 % BSA，1 000 r/min離心10 min，收集上清液再次離心，離心3次，混合3次離心后所得沉淀，并用完全培養(yǎng)基混勻后接種于未處理的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1 h，后換用1 %明膠包被的50 mL培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，其后全量換用含2 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并每隔2 d換液1次，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，貼壁細胞為BMEC。

1.4.2 星形膠質細胞（Astrocyte, AC）的原代培養(yǎng) 取新生3日齡SD大鼠5只，使用酒精消毒，在超凈臺下取出大鼠腦組織置于D-Hank's緩沖液中，使用眼科鑷輕輕去除大腦表面膜后，將大腦皮層分離出，放入DMEM/F12培養(yǎng)基中，使用剪刀將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊；將組織塊轉移至離心管中，加入0.125%胰酶37 ℃消化15 min，每隔5 min輕輕搖晃促進消化，消化結束后使用移液器輕輕將大腦皮層組織吹散，靜置30 s，上清用100目細胞篩過濾，1 500 r/min離心5 min；使用DMEM+10% FBS重懸細胞將細胞種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，每隔3 d半量換液；培養(yǎng)7 d后，在搖床上200 r/min搖晃4 h，去除上清液，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，貼壁細胞為AC。

1.4.3 原代AC的鑒定 胰酶消化提取原代AC 5 min后，重懸細胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成為單細胞懸液，計數(shù)。根據(jù)需要選擇合適的細胞密度種于培養(yǎng)板內，滴加細胞懸液時，需依據(jù)爬片大小，先在每個孔里準備放爬片的位置上滴加1滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)板的張力黏合在一起，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片。在培養(yǎng)板中培養(yǎng)好細胞后，吸出培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗細胞3次，5 min/次，然后加入預冷的4 %多聚甲醛，常溫固定10 min；除去多聚甲醛后，用預冷的PBS洗細胞3次，5 min/次；加入含適量Triton X-100的封閉液，封閉30 min，封閉結束后不用洗，直接上一抗；將GFAP抗體按1∶200比例稀釋在一抗稀釋液中，去除封閉液后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；去除一抗，加入預冷的PBS，洗3次，5 min/次；將熒光二抗分別按照1∶400比例稀釋在二抗稀釋液中，去除PBS后，加入二抗，室溫避光孵育1 h，加入預冷的PBS，洗3次，5 min/次；加入DAPI溶液，室溫避光孵育10 min；去除DAPI，加入預冷的PBS，洗3次，5 min/次；加入防熒光淬滅溶液，于正置熒光顯微鏡下拍照，鑒定細胞。

1.4.4 體外BBB的構建 分別構建BMEC單層培養(yǎng)模型和BMEC+AC共培養(yǎng)模型，分為BMEC單層培養(yǎng)模型組、BMEC+AC共培養(yǎng)組及Blank組（只加培養(yǎng)基）。取原代培養(yǎng)傳至第2代的BMEC胰酶消化后，于Transwell小室上室接種BMEC，接種密度為5×106個/mL，下室只加培養(yǎng)基，構建單層培養(yǎng)模型；取原代培養(yǎng)傳至第2代的BMEC和AC胰酶消化后，于Transwell小室上室接種BMEC，接種密度為5×106個/mL，下室接種AC，接種密度為5×106個/mL，構建共培養(yǎng)模型；于Transwell小室上室、下室加入培養(yǎng)基，構建Blank組；期間每2 d換液1次，培養(yǎng)5～8 d后檢測體外血腦屏障的通透性。

1.4.5 體外BBB通透性的檢測 ①4 h滲漏試驗：取構建好的體外BMEC單層培養(yǎng)模型、BMEC+AC共培養(yǎng)模型及只加培養(yǎng)基的Blank組，將Transwell小室上室及下室的培養(yǎng)基吸盡，并用PBS沖洗3次后，分別于上室和下室加入0.5和1.5 mL的完全培養(yǎng)基，使上室和下室存在一定的液面差，并將其放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于4 h后觀察液面變化情況。②熒光素鈉通透性試驗：配置不同濃度（0、0.2、2.0和20.0 μg/mL）熒光素鈉，于多功能酶標儀下536 nm波長處測定OD值，繪制標準曲線；取構建好的體外BMEC單層培養(yǎng)模型、BMEC+AC共培養(yǎng)模型及只加培養(yǎng)基的Blank組，將Transwell小室的上室及下室的培養(yǎng)基吸盡，并用PBS沖洗3次后，于BBB單層培養(yǎng)、共培養(yǎng)及Blank組的上室加入含20 μg/mL熒光素鈉基礎培養(yǎng)基0.5 mL，下室加入不含熒光素鈉的基礎培養(yǎng)基1.5 mL，并分別于培養(yǎng)0.5、1.0、2.0 h吸取下室培養(yǎng)基各100 μL備用，每組設3個復孔，實驗重復3次，于多功能酶標儀下536 nm波長處測定OD值，繪制標準曲線，并根據(jù)所得標準曲線計算熒光素鈉透過BBB的量。

1.4.6 體外ICH模型的構建 取體外BBB共培養(yǎng)模型，分為Control組與ICH組，Control組加入完全培養(yǎng)基處理，ICH組加入40 u/mL凝血酶處理，分別處理12 h后，檢測通透性變化，方法同1.4.5。

1.4.7 給藥 取體外BBB共培養(yǎng)模型，將其分為Control組、ICH組，以及GW0742低、中、高劑量組（1.25、2.50、5.00 μmol/L）5個組，Control組加入完全培養(yǎng)基，ICH組、GW0742低、中、高劑量組中均加入40 u/mL的凝血酶，各組分別培養(yǎng)12 h后，Control組、ICH組加入完全培養(yǎng)基，低、中、高劑量組給予相應劑量的GW0742，分別培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.4.8 Western blotting檢測蛋白ZO-1、MMP-9、Occludin的表達 提取各組細胞總蛋白，BCA法定量各組蛋白，制膠，上樣，電泳，轉膜，室溫下快速封閉液封閉20 min后，加入β-actin一抗（1∶1 000）、ZO-1一抗（1∶1 000）、MMP-9一抗（1∶1 000）、Occludin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗2 h，TBST清洗3次，5 min/次，使用ECL曝光顯影，分析各組條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，用Graphpad Prism 8.0軟件進行繪圖。計量資料行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組計量資料的比較用獨立樣本t檢驗，多組計量資料的比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代細胞的培養(yǎng)

2.1.1 BMEC的原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的BMEC呈短梭型和多角形生長，當長至第5天后長成其典型的“鋪路石”狀。見圖1。

圖1 原代培養(yǎng)BMEC的生長情況（倒置相差顯微鏡×100）

2.1.2 AC的原代培養(yǎng)及鑒定結果 原代培養(yǎng)AC 7 d，第7天去除小膠質細胞，原代AC的形態(tài)呈星形發(fā)散生長，從胞體發(fā)出許多突起和分支；原代培養(yǎng)的AC經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫熒光鑒定結果顯示，所提原代細胞確為AC，且其純度達到實驗要求（見圖2、3）。

圖2 原代培養(yǎng)AC的生長情況（倒置相差顯微鏡×100）

圖3 原代AC的GFAP免疫熒光鑒定（正置熒光顯微鏡× 200）

2.2 體外BBB通透性的檢測結果

2.2.1 4 h滲漏試驗 與Blank組比較，BMEC單層培養(yǎng)組能維持一定的液面差；與BMEC單層培養(yǎng)組比較，BMEC+AC共培養(yǎng)組能維持較好的液面差。通透性為：Blank組＞ BMEC單層培養(yǎng)組＞ BMEC+AC共培養(yǎng)組。見圖4。

圖4 4 h滲漏試驗

2.2.2 熒光素鈉通透性試驗 Blank組、BMEC單層培養(yǎng)組及BMEC+AC共培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度在0.5、1.0和2.0 h時比較，經單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果顯示，與Blank組比較，BMEC單層培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度降低，通透性降低（P＜0.05）；與BMEC單層培養(yǎng)組比較，BMEC+ AC共培養(yǎng)組熒光素鈉滲透濃度降低，通透性降低（P＜0.05）。見表1和圖5。

表1 培養(yǎng)0.5、1.0和2.0 h時各組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

表1 培養(yǎng)0.5、1.0和2.0 h時各組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

注：①與Blank組比較，P＜0.05；②與BMEC單層培養(yǎng)組比較，P＜0.05。

0.5 h 10.0±0.178 6.88±0.368①2.33±0.933②129.000 0.000組別Blank組BMEC單層培養(yǎng)組BMEC+AC共培養(yǎng)組F 值P 值1.0 h 11.0±0.611 8.67±0.254①4.58±1.04②63.300 0.000 2.0 h 11.9±0.149 9.93±0.855①7.51±0.892②29.100 0.000

圖5 熒光素鈉標準曲線及熒光素鈉滲透濃度比較

2.3 體外ICH模型的通透性評價

2.3.1 4 h滲漏試驗 與Control組比較，ICH組液面差降低，通透性增加（見圖6）。

圖6 體外BBB雙層模型及體外ICH模型的滲漏性試驗

2.3.2 熒光素鈉通透性試驗 Control組的熒光素鈉的滲透濃度與ICH組比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Control組比較，ICH組在0.5、1.0和2.0 h時，熒光素鈉滲透濃度增加，通透性增加。見表2和圖7。

表2 兩組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

表2 兩組熒光素鈉的滲透濃度比較 （μg/mL，±s）

注：?與Control組比較，P＜0.05。

組別Control組ICH組t 值P 值2 h 7.51±0.89 10.3±0.61?20.100 0.011 0.5 h 2.33±0.93 4.74±0.57?14.500 0.018 1 h 4.58±1.04 9.29±0.49?50.600 0.002

圖7 Control組與ICH模型組通透性比較

2.3.3 形態(tài)學觀察 培養(yǎng)12 h后，與Control組比較，ICH組的緊密連接結構明顯被破壞，細胞形態(tài)改變（紅色箭頭所示）。見圖8。

圖8 Control組與ICH組細胞形態(tài)學觀察（倒置相差顯微鏡×100）

2.4 藥效研究結果

2.4.1 形態(tài)學觀察 細胞形態(tài)學觀察結果顯示，與Control組比較，ICH組內皮細胞形態(tài)明顯皺縮、拉長；與ICH組比較，給藥組內皮細胞形態(tài)未見明顯皺縮、拉長，呈劑量依賴。見圖9。

圖9 給藥后細胞形態(tài)學觀察 （倒置相差顯微鏡×100）

2.4.2 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對表達量比較 Control組、ICH組、GW0742低、中、高劑量組的ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果顯示，與Control組比較，ICH組MMP-9蛋白相對表達量升高（P＜0.05），ZO-1、Occludin蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與ICH組比較，GW0742高劑量組MMP-9蛋白相對表達量降低（P＜0.05），ZO-1、Occludin蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表3和圖10。

表3 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與Control組比較，P＜0.05；②與ICH組比較，P＜0.05。

組別Control組ICH組GW0742低劑量組GW0742中劑量組GW0742高劑量組F 值P 值Occludin蛋白1.02±0.054 0.579±0.082①0.610±0.073 0.718±0.041 0.801±0.070②22.400 0.000 ZO-1蛋白0.833±0.142 0.429±0.140①0.541±0.086 0.697±0.025②0.734±0.103②6.610 0.007 MMP-9蛋白0.515±0.079 0.779±0.069①0.754±0.076 0.738±0.025 0.533±0.023②13.200 0.001

圖10 各組ZO-1、MMP-9、Occludin蛋白表達

3 討論

ICH是一種較為嚴重的腦血管疾病，致殘率和致死率均較高[10]。而在ICH的幾種病理后遺癥中，血腫引起B(yǎng)BB的破壞是主要問題之一，在該病的病理生理改變中起著至關重要的作用。ICH發(fā)生后，血液成分進入大腦，激活先天和獲得性免疫反應，導致各種細胞因子、趨化因子、自由基及其他潛在有毒化學物質的釋放[11]；在這些分子共同作用下，導致繼發(fā)性腦損傷，表現(xiàn)為BBB完整性受損、鄰近組織破壞，以及細胞死亡[12]；而血腦屏障的破壞又導致組織滲出、神經元壞死和細胞凋亡，進一步加重腦水腫[13]。因此，深入探討并研究ICH后血腦屏障破壞的繼發(fā)性損傷機制及相關治療藥物可能為ICH的防治提供新的思路。

血腦屏障主要由腦微血管內皮細胞、周細胞及星形膠質細胞組成，其中腦微血管內皮細胞是血腦屏障的主要組成部分，而腦微血管內皮細胞與其他外周血管內皮細胞不同的是腦微血管內皮細胞主要由緊密連接蛋白將腦微血管內皮細胞緊密連接在一起，形成了這一特殊屏障，因此，當血腦屏障受到破壞時，血腦屏障打開，緊密連接蛋白會相應發(fā)生改變，如ZO-1、Occludin、Claudin蛋白會相應下調，血腦屏障損傷的標志蛋白MMP-9會相應上調。

凝血酶是ICH后凝血瀑布被激活所釋放的一種酶，凝血酶可以參與ICH所致的損傷，同時也可作用于多種類型的細胞，包括腦內皮細胞、神經元和星形膠質細胞、小膠質細胞，并能導致血腦屏障破壞和腦水腫形成；凝血酶在ICH后除參與凝血外，同時也是一種促炎因子和神經毒性介質，體外高濃度可抑制神經元和星形膠質細胞生長繁殖，將大劑量凝血酶直接注入腦內會引起炎癥細胞浸潤、間充質細胞增殖、瘢痕形成、腦水腫形成和癲癇發(fā)作。因此為模擬ICH的病理生理過程，選擇在體外血腦屏障模型構建成功后加入40 u/mL凝血酶來模擬體外ICH細胞模型。

GW0742是一種特異性的PPARβ/δ激動劑，近年來其在多種中樞疾病中均有研究，如缺氧缺血、孤獨癥、ICH動物疾病模型中均有報道。因此更為深入地研究探討其對ICH的作用是必要的，本研究旨在利用原代提取的腦微血管內皮細胞及星形膠質細胞于體外構建血腦屏障模型，待血腦屏障模型構建成功后以40 u/mL凝血酶處理12 h模擬體外ICH模型，后給予GW0742，研究GW0742是否對ICH所致血腦屏障破壞具有保護作用，以期為后續(xù)ICH研究治療提供依據(jù)。通過體外試驗結果顯示，ICH后血腦屏障損傷的標志蛋白MMP-9表達升高，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達下降；給予GW0742后，血腦屏障損傷的標志蛋白MMP-9表達下降，Occludin、ZO-1蛋白表達升高，改善了由凝血酶誘導的血腦屏障破壞情況；因此推測GW0742能對ICH所致血腦屏障破壞具有保護作用，其保護作用可能與其抑制MMP-9的過度表達及促進了緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達有關。

綜上所述，本文通過原代腦微血管內皮細胞及星形膠質細胞構建體外血腦屏障，并以40 u/mL凝血酶模擬體外ICH模型促使血腦屏障破壞，后給予GW0742治療，結果表明GW0742對ICH所致血腦屏障破壞具有保護作用，其保護作用可能與其抑制MMP9的過度表達及促進緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達有關。