凝固酶陰性葡萄球菌在發(fā)酵食品中的應(yīng)用

葉圣雨，吳佳佳*，屈 炯，戴志遠(yuǎn)

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 湖州海關(guān) 浙江湖州 313000）

葡萄球菌（Staphylococcus）是一類革蘭氏陽性球菌，因其在顯微鏡下呈現(xiàn)出堆積的葡萄狀而得名。葡萄球菌在自然界分布廣泛，是人類和溫血動物體表或體表黏液正常菌群中的一部分，同時也棲息于土壤、水、空氣，甚至一些食品中[1-3]。根據(jù)產(chǎn)生凝固酶能力的不同，葡萄球菌屬成員可被分為凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase positive staphylococci，CPS）和凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococci，CNS）兩大類。一般而言，凝固酶陽性葡萄球菌（CPS）多具有致病性或產(chǎn)毒性，甚至兩者兼具，能引起人和動物的多種感染性炎癥[4]，其腸毒素是引起食物中毒的重要原因。臨床常見的金黃色葡萄球菌（S.aureus）、中間型葡萄球菌（S.intermedius）均為CPS 中的代表[5]。而凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）除表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、溶血葡萄球菌（S.haemolyticus）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）等少數(shù)與臨床感染有關(guān)的條件致病菌外，絕大多數(shù)CNS 不具備致病風(fēng)險。

CNS 在自然界中分布廣泛，多棲息于人和動物的皮膚、口腔及腸道以及動物來源的食物、環(huán)境中。分離自鮮肉、鮮奶、魚體的CNS，如肉葡萄球菌（S.carnosus）、木糖葡萄球菌（S.xylosus）、馬胃葡萄球菌（S.equorum）、腐生葡萄球菌等，通常是參與發(fā)酵香腸、奶酪、咸魚、醬油等食品生產(chǎn)的優(yōu)勢菌。研究證明，CNS 作為優(yōu)勢生產(chǎn)菌群可以賦予發(fā)酵食品（肉制品、乳制品及水產(chǎn)品）良好的風(fēng)味、色澤及質(zhì)地[6]，是發(fā)酵食品中的有益微生物菌群。在實際生產(chǎn)中，CNS 常和乳酸菌一同被應(yīng)用于肉制品、乳制品的生產(chǎn)。CNS 中的肉球葡萄球菌因遺傳背景研究較為深入，從上世紀(jì)50 年代開始，便作為商業(yè)化發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵香腸中[7]。木糖葡萄球菌則是發(fā)酵肉制品和發(fā)酵乳酪中應(yīng)用較為廣泛的商業(yè)化食品發(fā)酵劑[8]。2016 年，我國將木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌和小牛葡萄球菌（S.vitulinus）3 種CNS 菌株正式納入 《可食用菌種名單》。此外，其它CNS 也被作為小眾產(chǎn)品的發(fā)酵劑在特定的區(qū)域范圍使用。例如，肉葡萄球菌和模仿葡萄球菌（S.simulus）用作意大利香腸的工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵劑[9]；馬胃葡萄球菌被應(yīng)用于干酪發(fā)酵生產(chǎn)中[10]；而木糖葡萄球菌可用于“酸魚”的發(fā)酵[11]。

大量研究闡述了CNS 具有良好的生產(chǎn)性能，生產(chǎn)實踐也證明，添加CNS 不僅能提高發(fā)酵乳肉制品的質(zhì)量和安全性，還能有效縮短生產(chǎn)周期，商品化CNS 發(fā)酵劑的開發(fā)與應(yīng)用對于提高發(fā)酵食品的品質(zhì)和安全性具有重要意義。然而，由于食源性CNS 與CPS 中的金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌等致病菌具有鄰近的親緣關(guān)系、相似的遺傳背景，加之一些食源性的CNS 能夠在臨床檢出，學(xué)者們對CNS 在食品生產(chǎn)中應(yīng)用的安全性仍存質(zhì)疑。本文總結(jié)近年來食品中CNS 的相關(guān)研究，基于CNS 代謝特性詳細(xì)闡述其對發(fā)酵食品品質(zhì)形成的影響，以及CNS 用作發(fā)酵劑時需關(guān)注的安全問題，為科學(xué)篩選CNS 發(fā)酵劑提供更多的理論依據(jù)。

1 CNS 對發(fā)酵食品品質(zhì)的影響

作為自然發(fā)酵肉制品、乳酪、腌魚等食物生境中的優(yōu)勢菌群，CNS 攜帶的多種酶活性以及代謝產(chǎn)物使其在提升發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味，改善肉制品色澤，減少發(fā)酵過程中生物胺積累，抑制其它有害菌生長等諸多方面發(fā)揮著重要作用。同時，CNS 對發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)力，因此具備作為發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵劑的潛質(zhì)。

1.1 CNS 促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的形成

風(fēng)味是評價發(fā)酵食品品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。在發(fā)酵香腸、乳酪、發(fā)酵魚制品等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，除了化學(xué)反應(yīng)和內(nèi)源酶的作用外，微生物代謝在產(chǎn)品風(fēng)味形成中發(fā)揮重要作用。如表1 所示，CNS 具備較好的脂肪酶、蛋白酶、酯酶等豐富的酶活性，在發(fā)酵過程中，CNS 依靠其代謝產(chǎn)酶，將發(fā)酵產(chǎn)品原材料中的脂肪、蛋白質(zhì)等大分子逐級降解為脂肪酸、多肽、氨基酸、酮、醛、酸等小分子，促進(jìn)發(fā)酵風(fēng)味的形成。此外，CNS 也能夠?qū)μ妓衔镞M(jìn)行緩慢代謝，生成有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如乙醛、乙偶姻、雙乙酰等[6]。

表1 CNS 產(chǎn)酶及其對發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 1 CNS Enzymes and its effect on flavor compounds in fermented food

在實際生產(chǎn)過程中，雖然內(nèi)源酶對脂肪的降解發(fā)揮主要作用，但CNS 對脂肪降解和風(fēng)味物質(zhì)積累的作用仍不容忽視。絕大多數(shù)CNS 都有良好的脂肪酶活性，可以促進(jìn)肌肉和脂肪組織中脂質(zhì)的水解。研究表明，接種木糖葡萄球菌進(jìn)行發(fā)酵的哈爾濱干香腸，其游離脂肪酸含量增加了6～9倍[12]。Zeng 等[11]發(fā)現(xiàn)，接種木糖葡萄球菌生產(chǎn)的低鹽發(fā)酵魚，產(chǎn)品中油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量顯著增加，同時有大量棕櫚酸積累。游離脂肪酸是脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物，也是進(jìn)一步形成芳香化合物的關(guān)鍵[13]。CNS 能通過不完全的β-氧化對游離脂肪酸進(jìn)行降解，促進(jìn)與產(chǎn)品獨(dú)特風(fēng)味相關(guān)的小分子物質(zhì)積累。通常，脂肪酸首先被氧化成烯脂酰輔酶A（enoyl-CoA），再被水合成羥脂酰輔酶A（hydroxyacyl-CoA），隨后脫氫生成酮脂酰輔酶A（ketoacyl-CoA），酮脂酰輔酶A 進(jìn)一步被硫解為β-酮酸、短鏈游離脂肪酸和乙酰輔酶A[6]。CNS 能夠?qū)Ζ?酮酸進(jìn)行脫羧生成甲基酮類化合物[14]，如2-戊酮、2-己酮和2-庚酮等[15]。甲基酮類化合物具有果味和脂肪氣味且閾值較低，對發(fā)酵肉制品的典型風(fēng)味形成起積極作用。同時，甲基酮也可以進(jìn)一步還原為仲醇，進(jìn)而通過CNS 的酯酶活性，與酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成乙酯類芳香化合物[16]。干發(fā)酵香腸生產(chǎn)中的木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌利用其β-脂肪氧化活性對脂肪酸進(jìn)行降解，產(chǎn)生大量與風(fēng)味相關(guān)的支鏈和直鏈甲基酮內(nèi)酯[17]。接種木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌后，意大利Salami 香腸中游離脂肪酸含量、不飽和脂肪酸降解形成的醛、酮、醇等小分子化合物含量顯著上升[18]。

CNS 對蛋白質(zhì)的降解，尤其是對氨基酸的代謝有重要作用，影響產(chǎn)品中多肽、氨基酸、氨基酸降解物等風(fēng)味物質(zhì)的組成，促進(jìn)了發(fā)酵食品特征風(fēng)味的形成[19]。CNS 對肌肉中大分子蛋白質(zhì)的降解能力存在較大菌種間差異，尤其表現(xiàn)在不同菌株對肌原纖維蛋白和肌漿蛋白水解能力的差異上。Casaburi 等[9]研究發(fā)現(xiàn)意大利發(fā)酵香腸中分離所獲的肉葡萄球菌和模仿葡萄球菌能較好地水解肌漿蛋白，而中國傳統(tǒng)低鹽發(fā)酵“酸魚”中分離的木糖葡萄球菌則對草魚的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白均有水解活性[11]。CNS 對蛋白質(zhì)降解的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在水解肽鏈和氨基酸轉(zhuǎn)化兩個方面：CNS能產(chǎn)生肽酶降解肽鏈，從而大量積累游離氨基酸[20]；同時，CNS 代謝中，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸3 種支鏈氨基酸發(fā)生反式胺化和脫羧反應(yīng)，生成支鏈醛、羧酸和醇等揮發(fā)性風(fēng)味成分[16]。圖1 是亮氨酸經(jīng)CNS 代謝產(chǎn)生發(fā)酵香腸特有風(fēng)味物質(zhì)3-甲基丁醛和3-甲基丁酸的過程[17]。肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌均有較強(qiáng)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化能力，然而由于兩者的代謝差異，生產(chǎn)中添加不同菌株，其最終積累的風(fēng)味物質(zhì)差異較大。希臘salami生產(chǎn)中，添加木糖葡萄球菌促進(jìn)了3-甲基-1-丁醇、雙乙酰、2-丁酮、乙偶姻、苯甲醛、苯乙酮和甲基支鏈酮等多種風(fēng)味物質(zhì)的積累[21]。肉葡萄球菌則對支鏈氨基酸表現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力，能將其轉(zhuǎn)化為甲基支鏈醛（如3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛）或相應(yīng)的酸[14]。

圖1 亮氨酸轉(zhuǎn)化為芳香化合物的假設(shè)途徑[17]Fig.1 Hypothetical pathway for the conversion of leucine into aroma compounds[17]

CNS 借助酯合成酶促進(jìn)酯類物質(zhì)在發(fā)酵食品生產(chǎn)中積累，進(jìn)而影響產(chǎn)品風(fēng)味，其催化生成的乙酯類化合物（丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯）是發(fā)酵肉制品的典型風(fēng)味物質(zhì)[22]。木糖葡萄球菌135產(chǎn)生的乙酯可以賦予產(chǎn)品水果味并掩蓋腐酸氣味，從而消減發(fā)酵制品中的魚腥味、鐵銹腥味、酸敗味等不良?xì)馕禰23]；而接種了木糖葡萄球菌的酸魚也可以產(chǎn)生酯類物質(zhì)，傳遞令人愉快的香氣[24]。此外，脂肪酶和蛋白酶作用生成的脂肪酸和氨基酸在氧化酶的作用下，也可以進(jìn)一步生成酯，例如：干發(fā)酵香腸生產(chǎn)中的木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌具有脂肪酶氧化活性，促使脂肪酸進(jìn)一步氧化生成具有風(fēng)味的支鏈和直鏈甲基酮內(nèi)酯；軟骨葡萄球菌（S.chondrosus）在氧化酶作用下，可將亮氨酸轉(zhuǎn)化為2-乙基或3-甲基丁酸酯[17]。在合成酯的同時，CNS 中的酯降解酶也可以促使酯類發(fā)生水解作用，形成酸類與醇類，從而對發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味起到調(diào)節(jié)作用。肉葡萄球菌的酯降解酶活性可以促進(jìn)分解甘氨酸乙酯，且這個活性可以貫穿于細(xì)胞的整個生長周期[25]。

1.2 CNS 改善發(fā)酵肉制品的色澤

色澤是反映肉制品品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，在傳統(tǒng)肉類加工中，借助添加硝酸鹽/亞硝酸鹽形成加工肉制品特有的色澤。硝酸鹽/亞硝酸鹽在肉制品中被還原生成一氧化氮（NO），NO 與肉品中的肌紅蛋白（Mb）發(fā)生配位反應(yīng)，生成具有腌肉制品特征紅色的亞硝基肌紅蛋白（NO-Mb）。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中，添加肉葡萄球菌或馬胃葡萄球菌等CNS，能夠更好地促進(jìn)發(fā)色，改善產(chǎn)品色澤。Huang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)在不添加硝酸鹽的干香腸中，添加3 種不同的CNS 可以使干香腸產(chǎn)生誘人的色澤。CNS 促進(jìn)肉制品發(fā)色的機(jī)制主要有兩種（圖2）：一是通過產(chǎn)生硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶，促使硝酸鹽和亞硝酸鹽還原生成NO，進(jìn)而生成NO-Mb；二是在O2和NADPH+存在下，CNS 通過一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成NO 和L-瓜氨酸[29]，NO 與肌紅蛋白結(jié)合形成NO-Mb，促成了發(fā)酵肉制品色澤的形成[13]。

圖2 CNS 中NO 合成途徑[6]Fig.2 NO synthesis pathway in CNS[6]

研究表明，不同種的CNS 產(chǎn)硝酸鹽還原酶能力存在較大差異。肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌這兩種常用作肉制品發(fā)酵劑的CNS 具有突出的硝酸鹽還原能力，馬胃葡萄球菌、遲緩葡萄球菌（S.lentus）、模仿葡萄球菌、松鼠葡萄球菌（S.sciuri）、腐生葡萄球菌常具有較強(qiáng)的硝酸鹽還原酶活性，而沃氏葡萄球菌（S.warneri）的硝酸鹽還原酶活性較低或不存在[30]。Vermassen 等[31]在腌肉模型試驗中，發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌能夠在24 h 降解80%以上的硝酸鹽。Bosse 等[32]在腌制火腿中接種肉葡萄球菌LTH 7036（高硝酸鹽還原酶活性）和肉葡萄球菌LTH 3838（低硝酸還原酶活性）兩種發(fā)酵劑，對比發(fā)現(xiàn)CNS 的硝酸鹽還原酶活性是肉制品色澤形成的關(guān)鍵。

一氧化氮合酶基因（nos）廣泛分布于食源性CNS 中[33]。Ras 等[34]對肉制品中分離獲得的、隸屬于肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌5 個種的113 株CNS進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)所有的分離菌株均攜帶nos基因，然而其NO 的產(chǎn)量很低，亞硝基肌紅蛋白僅占紅色素類物質(zhì)的8%～16%。黃攀發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵香腸體系中，通過添加蔗糖可以誘導(dǎo)小牛葡萄球菌中nos 基因的表達(dá)，可促使NO 產(chǎn)量升高，促進(jìn)NO-Mb 形成，提升產(chǎn)品色澤[35]。然而，許多研究表明，實際生產(chǎn)中單純使用CNS 進(jìn)行發(fā)色，其發(fā)色效果與添加亞硝酸鹽相比仍有較大差距[36]。

此外，發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中，添加硝酸鹽和亞硝酸鹽不僅能夠促進(jìn)發(fā)色，還能有效抑制肉毒梭菌等致病菌的滋生，因此在研究硝酸鹽和亞硝酸鹽替代發(fā)色品的過程中，其抑菌作用亦不能被忽視。

1.3 CNS 對產(chǎn)品中生物胺含量的影響

生物胺是生物有機(jī)體中常見的化合物，天然存在于許多食物中，如水果、蔬菜、肉類、魚類、巧克力和牛奶等。它們在生物有機(jī)體中負(fù)責(zé)許多基本功能[37]，然而人體過量攝入這些胺類物質(zhì)可能會對健康造成影響，引起頭疼、心悸、嘔吐等毒性反應(yīng)[38]。在發(fā)酵食品生產(chǎn)中，一些微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用于組氨酸、酪氨酸、精氨酸等氨基酸后，會形成組胺、酪胺、腐胺等生物胺的積累。因此，產(chǎn)生物胺的能力也是評價發(fā)酵食品生產(chǎn)菌株安全性的一個重要標(biāo)準(zhǔn)[39]。

篩選不產(chǎn)生物胺的生產(chǎn)菌株，能夠從源頭上把控產(chǎn)品中生物胺的含量。在發(fā)酵菌株篩選過程中，研究人員通過宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究手段，對傳統(tǒng)醬油ganjang 發(fā)酵過程中分離的微生物產(chǎn)生生物胺的脫羧酶序列[40]及其代謝物中的生物胺進(jìn)行分析，從而篩選出一些低產(chǎn)或不產(chǎn)生物胺的發(fā)酵菌株，從而有效避免該類有害物質(zhì)的積累。Kanjan 等[41]對模擬葡萄球菌PMRS35 進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)其不攜帶產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺等生物胺的相關(guān)的氨基酸脫羧酶基因。Landeta 等[42]通過對分離自西班牙干腌火腿加工過程中的56 種CNS 進(jìn)行多種氨基酸脫羧酶基因檢測，從中篩選出不產(chǎn)生物胺的CNS 作為發(fā)酵劑。

篩選能夠?qū)ι锇愤M(jìn)一步降解的生產(chǎn)菌株，也可以一定程度上消除或減少產(chǎn)品中生物胺的含量。在食品生產(chǎn)中，部分CNS 菌株能夠通過胺氧化酶活性催化降解生物胺生成醛類[43]。Martuscelli等[44]在木糖葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了可降解組胺和酪胺的氧化酶。Mah 等[45]在日本鳀魚腌制時添加木糖葡萄球菌0538 作為發(fā)酵劑，能明顯減少產(chǎn)品中的生物胺含量，組胺含量降低最為顯著。而Zaman等[46]用從魚露中分離得到的葡萄球菌FS19 也同樣具有胺氧化酶活性，作為發(fā)酵劑進(jìn)行醬油發(fā)酵后，產(chǎn)品中組胺、腐胺、尸胺和酪胺的含量明顯降低。Mainar 等[29]以植物乳桿菌和木糖葡萄球菌作為微生物發(fā)酵劑進(jìn)行酸魚發(fā)酵也有效降低了酸魚中腐胺和尸胺的含量，而加入啤酒酵母混合發(fā)酵劑則可以降低酸魚中酪胺的含量。除了胺氧化酶的作用外，研究人員對魚露中分離的尼泊爾葡萄球菌（S.nepalensis）5-5 進(jìn)行降生物胺機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝途徑，阻斷組氨酸脫羧過程，使轉(zhuǎn)化為生物胺之外的其它代謝產(chǎn)物[47]。

1.4 CNS 對有害菌的抑制

研究人員發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉、魚制品生產(chǎn)中接種CNS 能有效抑制金黃色葡萄球菌、李斯特菌（Listeria）、大腸桿菌（Escherichia coli）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）等食源性致病菌滋生[24，48]。CNS 主要通過產(chǎn)細(xì)菌素和抑制有害菌形成生物膜來實現(xiàn)抑菌。

細(xì)菌素因其安全性良好而被認(rèn)為是抗生素和化學(xué)食品添加劑的首選替代品[49]。Sung 等[50]報道了人型葡萄球菌（S.hominis）MBBL 29 產(chǎn)生了一種與傳統(tǒng)抗生素相似的具有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)和高抗菌活性的細(xì)菌素，對金黃色葡萄球菌有良好的拮抗作用。Kanjan 等[41]對Budu 魚中分離的模擬葡萄球菌PMRS35 進(jìn)行瓊脂斑點法測定，從中發(fā)現(xiàn)了對蛋白酶具有抗性的細(xì)菌素，該細(xì)菌素對多種致病菌特別是金黃色葡萄球菌TISTR 具有較強(qiáng)的抗菌活性。由表2 可見，CNS 細(xì)菌素具有多個種類，抗菌譜包括多種革蘭氏陰性和陽性的食源性致病菌。除了直接檢出細(xì)菌素，一些研究通過測定CNS中產(chǎn)細(xì)菌素基因的存在，來評估CNS 分泌細(xì)菌素的能力。例如：Brito 等[51]在巴西健康奶牛群中分離的17 株CNS 中檢測出了對李斯特菌和金黃色葡萄球菌Newbould 305 有抑制作用的a70/a53 細(xì)菌素基因。與傳統(tǒng)的抗生素相比，細(xì)菌素通常對真核細(xì)胞無毒害作用，且能被消化酶作用失活，對腸道微生物影響較小，因此被視作安全的抗菌劑[52]。

表2 發(fā)酵食品中產(chǎn)細(xì)菌素的CNS 及其抑菌作用Table 2 Pathogen inhibition and bacteriocin production of CNS isolated from fermented food

有害菌的致病性與其生物膜形成能力呈正相關(guān)。CNS 則可以通過生產(chǎn)抑制肽及各種酶等抑制因子來抑制有害菌生物膜的形成。賴健昆[53]發(fā)現(xiàn)CNS 產(chǎn)生的RNAIII 抑制肽（RIP）能干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)，影響有害菌的黏附性及早期生物膜的形成。木糖葡萄球菌培養(yǎng)上清液中分離的RNAIII 抑制肽則可以抑制多種金黃色葡萄球菌菌株。Iwase等[54]發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌中含有一種抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成的因子——絲氨酸蛋白酶Esp23，該因子不僅可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，還能破壞預(yù)先存在的金黃色葡萄球菌生物膜。

另外，研究發(fā)現(xiàn)有害菌生物膜形成可能受多種抑制機(jī)制共同作用。例如：Goetz 等[55]觀察到具有弱生物膜表型的產(chǎn)色葡萄球菌（S.chromogens）和模仿葡萄球菌分離株能夠抑制其它葡萄球菌分離株形成生物膜。其抑制作用不僅僅依賴于抑制因子的積累，弱生物膜表型菌株的存在也會使強(qiáng)生物膜表型葡萄球菌菌株（包括金黃色葡萄球菌）無法形成厚而堅固的生物膜層，從而對其起到抑菌作用。

1.5 適宜工業(yè)生產(chǎn)的特性

作為傳統(tǒng)自然發(fā)酵香腸、發(fā)酵肉質(zhì)品種的優(yōu)勢土著菌株，CNS 菌株具備良好的環(huán)境適應(yīng)性，參與生產(chǎn)時能適應(yīng)高鹽、低pH 等不良環(huán)境并且保持自身活性。Kanjan 等[41]發(fā)現(xiàn)葡萄球菌菌株P(guān)MRS35 可以在高鹽環(huán)境下保持良好的產(chǎn)酶性能，高效降解脂肪和蛋白質(zhì)。而Casaburi 等[9]分離的模擬葡萄球菌在不同溫度、pH 和NaCl 濃度下，都保持了良好的硝酸鹽還原酶、蛋白水解、脂解、脫羧酶和抗氧化活性以及生長能力。CNS 良好的環(huán)境適應(yīng)能力使其在發(fā)酵菌群中能夠迅速成為優(yōu)勢菌，從而抑制有害菌的生長。例如：鰱魚香腸生產(chǎn)中接種含有木糖葡萄球菌的混合發(fā)酵劑后，pH迅速下降，發(fā)酵劑中的菌株迅速增殖，從而抑制了一些腸道細(xì)菌、假單胞菌、酵母菌和霉菌的生長[61]。Xiao 等[13]發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌接種到中式發(fā)酵香腸后，能夠迅速成為發(fā)酵生境中的優(yōu)勢菌，進(jìn)而抑制其它雜菌的生長。

2 CNS 應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)存在的潛在風(fēng)險

CNS 的非致病性是其應(yīng)用于食品生產(chǎn)的前提，然而因其與CPS 中的金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌等致病菌具有相近的親緣關(guān)系、相似的遺傳背景，其作為發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵食品的生產(chǎn)仍然令許多學(xué)者擔(dān)憂。一些CNS 菌株在高濃度下存在的產(chǎn)毒素風(fēng)險、生物胺積累和抗生素抗性基因污染等潛在安全隱患，這些潛在風(fēng)險在發(fā)酵菌株篩選中都需要重點關(guān)注[39，62]。

2.1 產(chǎn)毒素基因的威脅

葡萄球菌產(chǎn)生的毒素通常是指腸毒素、中毒性休克綜合征毒素和細(xì)胞毒素。涉及產(chǎn)毒素的葡萄球菌主要是以金黃色葡萄球菌為代表的CPS，而不是CNS。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)用于食品發(fā)酵的某些CNS 也具備產(chǎn)腸毒素潛力[43]。研究人員從利比里亞火腿、綿羊奶、山羊奶和奶酪中均發(fā)現(xiàn)了少數(shù)產(chǎn)腸毒素的CNS[62]。Nunes 等[63]從巴西新鮮奶酪Minas Frescal 中分離出了能夠生產(chǎn)具有超抗原活性且耐熱腸毒素的CNS，包括木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌（S.sciuri）和魚發(fā)酵葡萄球菌（S.piscifermentans）。

基因水平研究表明，CNS 和CPS 同樣具有編碼腸毒素的基因。研究者從即食發(fā)酵肉制品分離的肉葡萄球菌、琥珀葡萄球菌等CNS 均攜帶金黃色葡萄球菌腸毒素基因[64]。Rall 等[65]從Minas 軟干酪中分離出的CNS 菌株中，17 株來自腐生葡萄球菌、華氏葡萄球菌（S.Fahrenheit）、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、施萊弗氏葡萄球菌（S.schleifer）、頭狀葡萄球菌（S.capitis）的CNS 菌株均攜帶腸毒素基因，占總分離菌株數(shù)的26.2%，其中sea 腸毒素基因檢出率最高，其次是sec 和seb。除腸毒素外，Rosenstein 等[66]發(fā)現(xiàn)肉葡萄球菌TM300 的多種基因表達(dá)產(chǎn)物與金黃色葡萄球菌的毒力因子蛋白具有相似性，其安全性需要被進(jìn)一步關(guān)注。此外，毒素基因的水平轉(zhuǎn)移也是威脅其生產(chǎn)安全因素之一。Tulinski 等[67]對10 個養(yǎng)豬場的肉食品原材料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌能夠與表皮葡萄球菌共享攜帶mec 基因的葡萄球菌盒式染色體（Staphyloccoccal cassette chromosome mec，SCCmec）[68]，通過重組和重排，SCCmec 可以在不同CNS 種間交換轉(zhuǎn)移。因此，CNS 產(chǎn)毒素相關(guān)基因攜帶情況及其是否在發(fā)酵動物性食品生產(chǎn)中表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

2.2 生物胺積累的風(fēng)險

存在氨基酸脫羧酶活性的CNS 用于發(fā)酵食品生產(chǎn)可能引起生物胺的積累[62]。Anderegg 等[69]發(fā)現(xiàn)瑞士發(fā)酵香腸中木糖葡萄球菌是主要的酪胺生產(chǎn)者。Poveda 等[70]從散裝罐母羊奶樣本中分離出的表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌等CNS 均可引起生物胺的積累，最容易積累的是腐胺，其次是2-苯乙胺和酪胺。Harada 等[71]發(fā)現(xiàn)Sakana 味噌發(fā)酵魚醬中的表皮葡萄球菌是組胺積累的貢獻(xiàn)者。

通常認(rèn)為CNS 產(chǎn)生物胺與其攜帶編碼氨基酸脫羧酶基因有關(guān)，該基因的表達(dá)促使發(fā)酵基質(zhì)中的氨基酸脫羧從而生成生物胺。例如：劉蕾等[72]從發(fā)酵肉制品中共分離得到43 株產(chǎn)生物胺CNS菌株，其中產(chǎn)生物胺能力較強(qiáng)的7 株表皮葡萄球菌均攜帶賴氨酸脫羧酶基因（ldc）和組氨酸脫羧酶基因（hdc），部分菌株中檢測到色氨酸脫羧酶基因（tdc）。Anderegg 等[69]發(fā)現(xiàn)瑞士發(fā)酵香腸中的木糖葡萄球菌可能攜帶酪氨酸脫羧酶基因。當(dāng)CNS細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)時，容易積累生物胺，且生成生物胺的基因也更可能發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[73]。然而，許多CNS 菌株在產(chǎn)生物胺特性上存在基因型和表型的不一致。Seitter 等[74]檢測的32 株CNS 中均攜帶編碼氨基酸脫羧酶的基因，除肉葡萄球菌外，其余菌種的表型與基因型均不一致，許多CNS 可以產(chǎn)生2-苯乙胺和色胺，然而菌株中無法找到相應(yīng)的基因。Heo 等[5]發(fā)現(xiàn)一些CNS 分離株在基因檢測時未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生物胺相關(guān)編碼基因，然而在實驗室培養(yǎng)過程中卻能產(chǎn)生尸胺、腐胺和酪胺[75]。

此外，CNS 產(chǎn)生物胺的能力還與發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。Harada 等[71]發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸對表皮葡萄球菌在魚醬中的組胺積累有抑制作用；Sang 等[76]研究蝦醬中生物胺含量的變化時發(fā)現(xiàn)，CNS 產(chǎn)生物胺能力受發(fā)酵環(huán)境中鹽含量的影響，適度增加鹽度可降低生物胺含量；Van der Veken 等[77]發(fā)現(xiàn)，延長肉制品發(fā)酵時間能夠促使腐生葡萄球菌等CNS 積累更高濃度的生物胺，其中，尸胺含量在發(fā)酵結(jié)束7 d 后停止增加，而腐胺則會持續(xù)上升。這些現(xiàn)象表明，生產(chǎn)中通過控制發(fā)酵條件能夠在一定程度上減少CNS 對生物胺的積累。

2.3 抗生素抗性基因污染風(fēng)險

幾十年來，細(xì)菌的抗生素耐藥性研究主要集中在一些重要的臨床菌種上，然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥性細(xì)菌廣泛存在于土壤、水、食物和胃腸道等各種生態(tài)系統(tǒng)[78]，其帶來的直接公共衛(wèi)生問題是抗生素治療效率的降低，同時，抗生素抗性基因（Antibiotic Resistant Genes，ARGs）已成為一種新型環(huán)境污染物，其污染分布廣泛且危害持久。食品發(fā)酵生產(chǎn)中，是否攜帶ARGs 已經(jīng)成為評估發(fā)酵菌株安全性的重要指標(biāo)。CNS 同屬的金黃色葡萄球菌多重耐藥問題已成為公認(rèn)的醫(yī)學(xué)棘手問題，而細(xì)菌攜帶的ARGs 可能通過水平轉(zhuǎn)移傳播給其它共生或致病細(xì)菌[79]。發(fā)酵食品中的CNS 也屢有抗生素耐藥性檢出的報道。例如，Kastner 等[80]發(fā)現(xiàn)用作發(fā)酵劑的木糖葡萄球菌分離株均攜帶四環(huán)素耐藥相關(guān)的tet（K）基因。Fija?kowski 等[64]從意大利臘腸中分離出的肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌中，有69%的菌株對甲氧西林及大環(huán)內(nèi)酯、林可酰胺、鏈霉素B 類（MLSB）具有耐藥性。

食物鏈?zhǔn)强股啬退幓蛟趧游镏g擴(kuò)散的主要途徑之一[81]。López 等[82]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸的生產(chǎn)鏈中，ARGs 可能通過食物鏈在農(nóng)場中的土著微生物之間傳播，最終可能進(jìn)入香腸產(chǎn)品。這些耐藥基因可能通過食物鏈進(jìn)入人體，從而對人類健康造成威脅。Lozano 等[83]在從奶酪、腌制肉類、臘腸、熏魚等即食食品中分離的58 株CNS 中均檢測到了Tn916-Tn1545 接合轉(zhuǎn)座子，攜帶這類接合轉(zhuǎn)座子的菌株對頭孢西丁、克林霉素、替加環(huán)素、利福平和紅霉素均有耐藥性。菌株安全性評估過程中，當(dāng)CNS 中攜帶耐藥基因的質(zhì)粒數(shù)量較低時，傳統(tǒng)的PCR 檢測方法可能無法檢出。此外，多種耐藥基因可能會通過基因盒的形式同時存在于細(xì)菌中[84]，因此，針對應(yīng)用于食品生產(chǎn)的CNS，需要全面評估其抗生素耐藥基因攜帶情況。

3 結(jié)語

與乳酸菌和酵母菌等成熟的商業(yè)化發(fā)酵劑菌種相比，CNS 在工業(yè)化發(fā)酵食品生產(chǎn)中的應(yīng)用并不廣泛，相應(yīng)的商業(yè)化發(fā)酵劑較為有限。CNS 在動物性食品發(fā)酵方面，擁有改善風(fēng)味、著色，降低生物胺，抑制有害菌等良好的生產(chǎn)特性，具備耐低pH 和高鹽脅迫環(huán)境的特性，在動物性發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)中有潛在的應(yīng)用前景。目前，學(xué)者們對CNS 在發(fā)酵食品中的積極作用已廣為認(rèn)同。此外，對于CNS 的潛在風(fēng)險也應(yīng)理性看待，雖然目前沒有強(qiáng)有力的研究表明其應(yīng)用會給食品產(chǎn)業(yè)帶來突出威脅，但人們對于CNS 應(yīng)用過程中的產(chǎn)毒素、積累生物胺以及抗生素基因污染的風(fēng)險仍然有所擔(dān)憂。研究人員發(fā)現(xiàn)了部分CNS 在動物性食品中不容忽視的產(chǎn)毒素能力，并且已經(jīng)通過基因來確定產(chǎn)毒素的機(jī)制[85]，而CNS 產(chǎn)毒素基因的總體分布以及其產(chǎn)毒素能力尚待研究[67，86]。在產(chǎn)生物胺方面，CNS 菌株間在基因型和表型上均存在較大差異，且部分菌株基因型和表型的不一致仍需重視[26]。在抗生素抗性基因污染方面，雖然目前應(yīng)用于食品生產(chǎn)的大部分菌株的抗性基因都未使食品本身產(chǎn)生安全問題，但對其存在的安全隱患和基因轉(zhuǎn)移機(jī)制需要繼續(xù)關(guān)注。

作為人為添加的外源性發(fā)酵劑，CNS 的安全性需要借助多種技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)而全面的評估，隨著組學(xué)測序技術(shù)成本的下降，在CNS 生產(chǎn)發(fā)酵菌株遴選中，可以結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組多組學(xué)測序分析，系統(tǒng)而全面地評估CNS 菌株的生產(chǎn)優(yōu)勢和安全劣勢[87-89]。此外，在商業(yè)化發(fā)酵劑的開發(fā)中，菌株遴選和發(fā)酵劑的復(fù)配也需要基于大量實踐研究，菌株間代謝特性存在較大差異，一些菌株具有良好的蛋白酶或氨基酸轉(zhuǎn)化酶活性，然而其對脂肪β-氧化能力可能差強(qiáng)人意，而具有較好的降生物胺能力的菌株可能對著色沒有太大的幫助，通過發(fā)酵劑的復(fù)配可以揚(yáng)長補(bǔ)短，同時發(fā)揮不同菌株的優(yōu)勢。此外，介于發(fā)酵基質(zhì)本身的營養(yǎng)成分亦存在較大差異，針對不同發(fā)酵底物開發(fā)適宜的發(fā)酵劑，需要對發(fā)酵劑微生物組成、微生物代謝對食品基質(zhì)的影響進(jìn)行系統(tǒng)而全面的研究。