乳源外泌體對微生物的作用

趙紫涵，譚楚敏，吳希陽，謝秋玲

（暨南大學(xué) 廣州 510632）

外泌體（Exosomes）是細(xì)胞外囊泡（EVs）的一個重要類別，其直徑約30～150 nm，也稱為小細(xì)胞外囊泡（sEVs）[1]。外泌體存在于乳汁及其它體液中，包括羊水、血液、惡性腹水、唾液和尿液等[2]。早在1971 年，對牛乳的脫脂乳進(jìn)行超速離心時就觀察到富含囊泡的分離物，其具有淡黃色可溶層的特征，位于堅硬的酪蛋白顆粒之上，被稱為“絨毛層”[3]。2007 年，Admyre 等[4]首次證明人初乳和成熟乳中的囊泡分離物具有典型的外泌體特征，且具有免疫潛力。此外，外泌體還被發(fā)現(xiàn)存在于其它許多物種的乳汁中，包括奶牛[5]、水牛[6]、豬[7]、山羊[8]和馬[9]等。乳外泌體被認(rèn)為是調(diào)節(jié)母親和哺乳期嬰兒之間細(xì)胞通訊不可或缺的信號體，它通過功能性物質(zhì)（如miRNA、mRNA、DNA 和蛋白質(zhì)）參與細(xì)胞間的通訊，能將其物質(zhì)傳遞給特定的受體，在細(xì)胞間的信息傳遞和免疫功能中發(fā)揮重要作用[10]。

1 外泌體

1.1 外泌體的形成過程

乳外泌體主要來源于乳腺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和乳腺干細(xì)胞中的不同細(xì)胞群[11-13]，通過一系列調(diào)節(jié)過程而形成，這些調(diào)節(jié)過程可以概括為“內(nèi)吞-融合-分泌”（圖1）。最初，質(zhì)膜上的小泡向內(nèi)出芽（內(nèi)吞作用），小囊泡相互融合形成早期內(nèi)體，隨后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓耐砥趦?nèi)體。這些晚期內(nèi)體膜多處凹陷并向內(nèi)出芽形成細(xì)胞腔內(nèi)囊泡（Intraluminal vesicle，ILVs），富含ILVs 的內(nèi)體稱為多囊泡內(nèi)小體（Multivesicular endosome，MVEs）。MVEs有2 個去向：一部分MVEs 與溶酶體融合，使其內(nèi)容物發(fā)生降解后排出細(xì)胞外；另一部分MVEs 與細(xì)胞膜融合，釋放ILVs 到細(xì)胞外，這些分泌的囊泡即為外泌體[14-15]。

圖1 外泌體分泌過程[16]Fig.1 Release of exosomes[16]

1.2 外泌體組分

作為一種重要的EVs 類型，外泌體能保護(hù)不穩(wěn)定的內(nèi)含物免受降解，并在幾乎所有組織中通過外泌體的內(nèi)吞作用為物質(zhì)的攝取提供一種載體[17]。乳外泌體及其內(nèi)含物會因物種來源、品種、飲食和健康狀況而發(fā)生改變[6，12，18-20]。根據(jù)ExoCarta外泌體數(shù)據(jù)庫（http：//www.exocarta.org），目前已知約有9 769 種蛋白質(zhì)，3 408 種mRNA，2 838 種miRNA，以及1 116 種脂類與外泌體相關(guān)[21]。

乳外泌體蛋白質(zhì)的含量和種類是高度多樣的，不僅在不同物種之間，而且在同一物種的不同個體之間也存在差異。Samuel 等[19]采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了不同泌乳時期牛乳外泌體蛋白質(zhì)組的變化，通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)：相比成熟乳，牛初乳外泌體中富含與免疫應(yīng)答和生長相關(guān)的蛋白質(zhì)。豬乳外泌體含有多種蛋白質(zhì)，如表皮生長因子、結(jié)締組織生長因子、血小板衍生生長因子以及肌生長抑制素等，這些蛋白在控制細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用[20]。乳外泌體中還觀察到具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用的乳蛋白，如TGF-β[22-23]、酪蛋白、乳球蛋白和乳鐵蛋白[9，24-25]。牛乳外泌體中就發(fā)現(xiàn)了參與血小板/中性粒細(xì)胞脫顆粒、抗菌肽和補(bǔ)體激活的蛋白質(zhì)，可能調(diào)節(jié)受體的免疫系統(tǒng)以指導(dǎo)嬰兒的生長，以及在修復(fù)和發(fā)育方面發(fā)揮潛在作用[19]。

早在1955 年和1993 年就發(fā)現(xiàn)了牛奶外泌體中RNA 的存在[26-27]，其中miRNA 最受關(guān)注。miRNAs 是人類和其它哺乳動物中所有類型細(xì)胞之間的長距離基因調(diào)節(jié)因子，對健康和疾病有巨大影響，體循環(huán)中的microRNA 可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展以及大腦的發(fā)育和功能，并為機(jī)體與腸道微生物區(qū)系的溝通建立了橋梁。首次關(guān)注牛奶microRNAs 的研究在2010 年被報道，并開啟了一個關(guān)于牛奶miRNAs 研究的非常新的研究領(lǐng)域[5]。單位體積奶中發(fā)現(xiàn)了含有高濃度的miRNA[2]。本團(tuán)隊在牛、羊及人這3 種來源的乳汁外泌體中均檢測到大量miRNA，且不同乳源外泌體miRNA 譜之間往往存在一定程度的重疊。乳miRNA 的表達(dá)與乳腺狀況有關(guān)，包括感染、癌癥、懷孕和哺乳狀況，因此乳miRNA 可以用作疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，例如在牛奶中高度穩(wěn)定的bta-miR-223，其表達(dá)水平受到乳腺狀況的影響可作為監(jiān)測乳腺感染狀況的良好指標(biāo)[22]。同時還有大量研究發(fā)現(xiàn)乳源外泌體中有大量與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA[28]，例如人乳外泌體中富含能調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的miRNA 和誘導(dǎo)B 細(xì)胞分化的miR-181 和miR-155[28-30]，還有研究表明乳外泌體中的miR-148a 是牛乳中表達(dá)最豐富的miRNA，也是先天免疫反應(yīng)、小鼠樹突狀細(xì)胞中抗原呈遞的調(diào)節(jié)劑[31-32]，同時，let-7a 能夠通過下調(diào)IL-6 水平，調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞的分化[33]。牛乳外泌體和人乳外泌體中部分蛋白及miRNA 組成與功能分析如表1 所示[4，19，28，34-43]。

表1 牛乳和人乳外泌體中部分蛋白及miRNA 組成與功能分析Table 1 Analysis of the composition and function of some proteins and miRNAs in bovine milk and human milk exosomes

除蛋白質(zhì)和miRNA 外，外泌體中還含有DNA 等核酸分子、磷脂酰膽堿和神經(jīng)酰胺等脂質(zhì)分子及糖分子，這些成分的存在也與外泌體的生物發(fā)生、細(xì)胞識別和受體細(xì)胞對外泌體的有效攝取有關(guān)[44-45]。外泌體的脂質(zhì)組成主要有磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等物質(zhì)。其中，膽固醇和鞘磷脂對膜脂筏動態(tài)結(jié)構(gòu)域的形成至關(guān)重要，脂筏（Lipid raft）在外泌體與靶細(xì)胞間的信號傳遞中發(fā)揮重要作用。分布在外泌體膜結(jié)構(gòu)上的脂質(zhì)可以隔離內(nèi)容物，從而提高外泌體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時也在外泌體與受體細(xì)胞的信息交流中扮演重要角色[45]。牛奶外泌體中的糖鏈主要以唾液酸化及巖藻糖化修飾糖鏈為主，這些糖鏈結(jié)構(gòu)既可以作為外泌體的識別位點，也具有一定的抗菌作用[46]。此外，牛乳外泌體中的一種具有Lacdi NAc 結(jié)構(gòu)（F0H5N8S0G0）的N-連接糖鏈和2 種唾液酸化N-連接糖鏈（F0H5N3S0G1 和F0H4N4S0G1）也可以作為牛奶來源外泌體的潛在生物標(biāo)志物用來鑒別牛乳外泌體[46]。也有研究證明牛乳外泌體表面糖蛋白的半乳糖和唾液酸化半乳糖修飾對于非牛物種的外泌體攝取至關(guān)重要[47]。

乳中的蛋白質(zhì)和miRNA 等功能分子被包裹在細(xì)胞外囊泡中，由于具有磷脂雙分子層的保護(hù)，使得乳外泌體中的物質(zhì)能抵御高溫、RNase 消化[28，48-49]、低pH 值[48-49]和體外胃腸道消化[2，43，50]等惡劣條件。有研究對當(dāng)前所有公開可用的來自194個物種的34 612 個miRNA 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推斷各類外源miRNA 進(jìn)入人體循環(huán)的可能性，345 個飲食來源的miRNA 被預(yù)測為高度可運(yùn)輸序列，其中有117 個與其在人類中的同源物具有相同的序列，73 個已知與外泌體相關(guān)[51]。據(jù)報道，牛乳和豬乳中的miRNA 在人、豬和小鼠中是生物可利用的[7，51-52]，商業(yè)巴氏殺菌牛奶中的乳源性miRNA 被成年人大量吸收[52]。在飲用牛乳后的人體血漿中通過miRNA 測序分析也驗證出9 個牛乳來源的miRNA[51]。

乳源外泌體中的功能物質(zhì)能被腸上皮細(xì)胞吸收，并通過跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)血液循環(huán)。體外試驗表明，乳源外泌體可以抑制與腸道增殖有關(guān)的P53基因的表達(dá)[7]。研究發(fā)現(xiàn)乳源外泌體能夠顯著促進(jìn)CDX2、IGF1R 和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，證明了乳源外切體可以促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖和腸道發(fā)育。牛乳源細(xì)胞外小泡（BMEV）在體外能夠被小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞、脾細(xì)胞和腸道細(xì)胞IPEC-J2 攝取，并能降低脾細(xì)胞中血清MCP-1 和IL-6 的水平[50]。Baier 等[52]發(fā)現(xiàn)人類乳汁外泌體能夠在消化后存活，并被腸道細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞核，可能通過外泌體miRNA 影響基因表達(dá)或進(jìn)入嬰兒的體循環(huán)，發(fā)揮組織特異性免疫保護(hù)和發(fā)育功能。此外，一些研究已經(jīng)證明嬰兒配方奶中缺乏生物活性miRNA 和乳源性EVs[53-54]。有人推測，配方奶中乳源性EVs 和相關(guān)內(nèi)含物的缺乏可能會導(dǎo)致嬰兒代謝和免疫程序受損[24，55]。

2 外泌體與病原微生物感染的關(guān)系

外泌體能夠介導(dǎo)細(xì)菌-宿主之間的相互作用，參與傳染性疾病、炎癥性疾病和腫瘤等多種疾病的病理過程，從而促進(jìn)健康或引起各種疾病[56]。病原菌感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生外泌體，致使外泌體內(nèi)的組分發(fā)生變化，包括蛋白質(zhì)和核酸分子，從而影響和調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)。

幽門螺桿菌Hp 感染的巨噬細(xì)胞所釋放的外泌體中miR-155 顯著上調(diào)，這些攜帶miR-155 的外泌體被其它巨噬細(xì)胞攝取并內(nèi)化后，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中多種促炎介質(zhì)和炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，如TNF-α、IL-23 和IL-6 等炎癥相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)，而炎癥信號通路蛋白MyD88、NF-кB 表達(dá)下調(diào)，這表明外泌體miR-155 可通過參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)Hp 感染巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。用荷載miR-155 的外泌體在體外培養(yǎng)幽門螺桿菌，幽門螺桿菌的生長受到顯著抑制。體內(nèi)、外試驗表明，miR-155 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來促進(jìn)巨噬細(xì)胞抑制或殺死幽門螺桿菌，以防止幽門螺桿菌感染引起的胃炎[57]。體內(nèi)試驗中，用荷載miR-155 的外泌體治療幽門螺桿菌感染小鼠，觀察到小鼠胃上皮組織的炎癥反應(yīng)顯著降低。感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）的巨噬細(xì)胞會釋放攜帶結(jié)核分枝桿菌病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的外泌體，包括分枝桿菌蛋白、脂類和核酸。這些攜帶結(jié)核分枝桿菌PAMP 的EVs 可被受體細(xì)胞上的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）檢測到，PRRs 可以誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以激活或減弱細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)：一方面，感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞釋放的外泌體攜帶有結(jié)核分枝桿菌抗原，可以促進(jìn)先天性和獲得性免疫反應(yīng)的激活；另一方面，外泌體作為結(jié)核分枝桿菌病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）的攜帶者也可以抑制受感染細(xì)胞以外的宿主免疫反應(yīng)[58-59]。

外泌體還可通過TLR2 依賴的途徑調(diào)控固有免疫應(yīng)答。TLR2 主要識別革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的肽聚糖，也可識別脂蛋白和脂多糖等生物分子。TLR2 能夠識別外泌體所攜帶的細(xì)菌特異性成分或其代謝中間產(chǎn)物，從而促進(jìn)免疫識別和炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在病原微生物感染刺激下產(chǎn)生的外泌體含有病原微生物脂多糖和脂蛋白等成分，可以激活TLR2，影響未感染的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)[60]。結(jié)核分枝桿菌中的RNA 可通過結(jié)核分枝桿菌SecA2 依賴的途徑遞送到巨噬細(xì)胞來源的EVs 中，由感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞釋放的EVs 刺激宿主RIG-I/MAVS/TBK1/IRF3 RNA傳感途徑，導(dǎo)致受體細(xì)胞產(chǎn)生I 型干擾素。這些EVs 還通過依賴RIG-I/MAVS 的途徑促進(jìn)與LC3相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌吞噬小體成熟，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡率增加[61]。

母乳外泌體中含有豐富的蛋白質(zhì)，參與免疫和炎癥途徑的調(diào)節(jié)，能夠影響局部對細(xì)菌攻擊的免疫反應(yīng)[34]。葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎導(dǎo)致腸道微生物群失衡，包括致病細(xì)菌的增加和腸道微生物多樣性的減少。致病菌豐度的增加激活跨膜模式識別受體如Toll 樣受體（TLR），這些模式識別受體介導(dǎo)中樞信號級聯(lián)反應(yīng)的激活，包括NF-κB，Akt 和MAPK 途徑。此外，微生物群（非致病菌）及微生物群代謝物（如短鏈脂肪酸）可以調(diào)節(jié)Treg/Th17 細(xì)胞的NF-κB 活化和動態(tài)平衡，從而防止過度炎癥。在UC 小鼠模型中口服mEV 可重塑小鼠腸道微生物群以恢復(fù)腸道免疫力。相比對照組，DSS 處理組小鼠腸道菌群中腸球菌科（Enterococcaceae）和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）分類分支顯著增加，在EV 處理組中這些致病細(xì)菌豐度無顯著變化，而一種益生菌阿爾曼氏菌（Akkermansia）豐度顯著增加。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，相比DSS 處理組，口服mEV 防止了結(jié)腸縮短并有效抑制腸道炎癥細(xì)胞的浸潤和組織纖維化[34]。牛奶外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)結(jié)果，通過GO 富集分析和KEGG 通路分析顯示，牛奶EV 中所包含的大多數(shù)蛋白質(zhì)作用于細(xì)胞胞內(nèi)成分及參與生物反應(yīng)過程，有多種蛋白質(zhì)（如MHC class I antigen，HSPB1，NOD2 等）參與免疫相關(guān)反應(yīng)以及炎癥信號通路，包括NOD 樣受體信號通路，Toll樣受體信號通路和NF-κB 信號通路，而這些通路也存在于機(jī)體對細(xì)菌的免疫反應(yīng)中[34]。

3 外泌體對微生物的作用

只有較少針對外泌體對微生物直接作用的研究，展示了不同來源的外泌體，如腸源性外泌體、乳源外泌體、尿液外泌體等從不同方面直接作用于微生物，調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化活動，進(jìn)而影響微生物的生長代謝及黏附等過程。例如有研究發(fā)現(xiàn)血清EVs 的存在對于細(xì)菌引發(fā)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，而且可能存在菌種差異。與乳酸菌不同，雙歧桿菌誘導(dǎo)的TLR2/6 反應(yīng)在血清EV存在下會被抑制。血清EVs 可以稍稍提高DC 細(xì)胞對于乳酸菌的吞噬，而對于雙歧桿菌的吞噬在缺乏EVs 時幾乎全部消失。EVs 可能在細(xì)菌聚集中發(fā)揮作用，這意味著EVs 與細(xì)菌之間存在直接的相互作用，并可能是通過影響細(xì)菌的黏附和清除方式而起作用[62]。

另一項研究確定，尿外泌體作為先天免疫效應(yīng)器影響致病性和共生性大腸桿菌的生長，并導(dǎo)致細(xì)菌溶解[63]。該研究表明，在酸性pH 條件下，尿液外泌體可導(dǎo)致大腸桿菌的裂解和死亡。通過深入的蛋白質(zhì)組分分析證明，正常的人尿外泌體富含天然免疫蛋白，包括已知具有抑菌作用（如粘蛋白-1、纖維連接蛋白和CD14）或殺菌作用（如溶菌酶C、鈣保護(hù)素和真皮殺菌素）的蛋白質(zhì)，以及那些作為微生物受體或與細(xì)菌表面分子結(jié)合的蛋白質(zhì)。作者還通過進(jìn)一步試驗證明尿液外泌體能夠有效地抑制致病性和共生性大腸桿菌的生長并誘導(dǎo)細(xì)菌裂解。同時，該研究還證明尿液外泌體對細(xì)菌的殺滅作用必須依賴于外泌體結(jié)構(gòu)的完整性。

Yu 等[64]將大腸桿菌K-12 MG1655 和植物乳桿菌WCFS1 分別與乳源外泌體M-exo（Milk-derived exosomes）、脂肪來源外泌體Asc-exo（Adipose-derived stem cell exosomes）和從椰子水中提取出的納米顆粒（Nanoparticles extracted from coconut water）共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3 種類型胞外體顆粒都能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)（圖2），并影響細(xì)菌生長，同時會影響細(xì)菌生長相關(guān)基因的表達(dá)。例如已有研究表明yegH，ptsG 和rpoC 三個基因可能參與了細(xì)菌生長代謝并影響細(xì)菌的黏附和入侵[65-67]。當(dāng)用M-exo 或ASC-exo 處理MG1655 時，yegH 和ptsG表達(dá)水平上調(diào)，而rpoC 表達(dá)水平下調(diào)。通過生物信息學(xué)進(jìn)一步分析，yegH，ptsG 和rpoC 是某些miRNAs（包括miR-21，miR-497 和miR-395）可能的靶基因，因此推測有可能是共培養(yǎng)的外源EVs 通過miRNAs 的轉(zhuǎn)移而改變了細(xì)菌的基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長代謝過程。

圖2 細(xì)菌對胞外囊泡的攝取[64]Fig.2 Extracellular vesicles are taken up by bacteria[64]

Lei 等[68]證明了從檸檬果實中壓榨得到的檸檬汁中的外泌體樣納米顆粒（LELNs）可以增強(qiáng)乳酸桿菌對膽汁的耐受性。Msp1 和Msp3 是鼠李糖乳桿菌（LGG）的外分泌蛋白，研究表明，LENN 通過限制Msp1 和Msp3 的表達(dá)量來增強(qiáng)LGG 對膽汁的耐受性。Msp1 和Msp3 都含有細(xì)胞壁肽聚糖水解酶結(jié)構(gòu)域，并且Msp1 已被證明可以水解細(xì)胞壁衍生的肽聚糖，因此Msp1 和Msp3 表達(dá)量的降低，可以降低膽汁對LGG 細(xì)胞膜的可及性，使得膽汁更不易于作用于細(xì)胞膜，從而增強(qiáng)LGG 對膽汁的抗性。

我國學(xué)者也對牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2 的生長影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)牛乳外泌體對動物雙歧桿菌的生長具有明顯的促進(jìn)作用，同時也能夠提高動物雙歧桿菌F1-3-2 對腸胃環(huán)境的耐受性和黏附性能[69]。

本團(tuán)隊研究了牛乳、羊乳及人乳3 種乳源外泌體對大腸桿菌生長的影響，分別用不同濃度的外泌體在體外共培養(yǎng)大腸桿菌，試驗表明羊乳和人乳外泌體對大腸桿菌的生長均具有不同程度的抑制作用，其中人乳外泌體對大腸桿菌生長的抑制作用最為明顯，羊乳外泌體次之。此外，不同濃度的外泌體對大腸桿菌生長的抑制程度也有所差異，在人乳及羊乳外泌體處理組中，均發(fā)現(xiàn)較高濃度的外泌體對大腸桿菌生長抑制作用更為顯著。

4 外泌體對腸道菌群的作用

腸道菌群對于人體健康和疾病治療的作用近年來受到了很大關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群不僅可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖類、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，還有助于促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，影響腸道功能和正常發(fā)育[70]。飲食會影響到腸道菌群的種類和生長，飲食中所包含的外泌體是否也會影響到腸道菌群呢？在人乳和其它物種的乳汁中，包含豐富的與免疫相關(guān)的miRNA 和其它功能物質(zhì)，因而外泌體具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖等生理功能[7，28]。不僅如此，口服植物來源的外泌體被發(fā)現(xiàn)可以改善小鼠的腸道菌群，增強(qiáng)小鼠免疫力[71]。

Zhou 等[72]對C57BL/6 小鼠分別飼養(yǎng)牛乳外泌體缺乏（Exosome and RNA depleted，ERD）或牛乳外泌體充足（Exosome and RNA-sufficient，ERS）的日糧，通過收集小鼠盲腸內(nèi)容物，對盲腸微生物菌群進(jìn)行16S rRNA 高通量測序，發(fā)現(xiàn)菌群中3 個門、7 個科和52 個操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）存在顯著差異。例如，15 和47 周ERS 小鼠的軟壁菌門的豐度是ERD 小鼠的3 倍，7 和47 周ERS 小鼠毛螺菌科的4 個OTUs 豐度高于ERD 小鼠的2 倍。這表明，乳外泌體可跨物種改變小鼠腸道菌群組成，參與腸道菌群與宿主間的相互作用。

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis）是一種常見的腸道疾病，腸道菌群失調(diào)被認(rèn)為是引起結(jié)腸炎的關(guān)鍵因素[34，73]。給葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠灌胃牛乳外泌體（mEVs）后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎患者腸道微生物多樣性降低，而經(jīng)MEVs 干預(yù)后，腸道微生物多樣性有所恢復(fù)。同時發(fā)現(xiàn)在DSS 處理的小鼠中，表現(xiàn)出腸道桿菌枯竭，而變形桿菌和韋氏微生物門的相對豐度顯著增加，經(jīng)MEVs 干預(yù)可以部分恢復(fù)其豐度，尤其一種益生菌阿爾曼氏菌在MEVs 干預(yù)組的小鼠中顯著增加。這些結(jié)果表明，MEVs 可以在DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中塑造腸道微生物區(qū)系，并且MEVs 對不同菌種的作用也有所差異[34]。在類似的研究中，Benmoussa 等[74]用DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，引起小鼠糞便中毛螺菌科和瘤胃菌科豐度的下降，采用不同的離心速度獲得了2 種牛乳胞外小囊泡（35 000×g 離心獲得的P35K 和100 000×g 離心獲得的P100K），兩種胞外囊泡均能一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復(fù)腸道屏障和補(bǔ)充粘蛋白的分泌。

Tong 等[75]用不同濃度的牛乳外泌體對C57BL/6 小鼠進(jìn)行為期8 周的處理，以研究牛乳外泌體對小鼠腸道微生物區(qū)系組成的影響。與對照組（PBS）相比，mEV 處理組小鼠腸道菌群在科、屬、種3 個水平上均存在顯著差異，證明了mEV 可以調(diào)節(jié)宿主腸道微生物群。Yang 等[76]研究了源自人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體（PMSC-Exos）在心肌梗死（MI）中的作用，研究過程中發(fā)現(xiàn)，與MI 模型組相比，PMSC-Exos 干預(yù)組通過增加擬桿菌、變形桿菌、疣狀結(jié)腸炎、放線菌、擬桿菌、雙歧桿菌的相對豐度以及降低厚壁菌豐度，來顯著調(diào)節(jié)腸道微生物群落組成。此外，與MI 組相比，補(bǔ)充PMSCExos 也顯著提高了腸道微生物群群落代謝物SCFAs（丁酸、異丁酸和戊酸）產(chǎn)量。相關(guān)性分析表明，腸道微生物群、微生物SCFAs 和MI 炎癥之間存在密切關(guān)聯(lián)。在關(guān)于外泌體對骨質(zhì)疏松癥影響的研究中發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥誘導(dǎo)小鼠的腸道微生物群落中乳酸菌群落減少，然而通過外泌體攝入可以有效恢復(fù)腸道微生物群落組成[77]。

外泌體調(diào)節(jié)腸道微生物的機(jī)制雖尚待深入探索，但人們推測外泌體中包含的功能物質(zhì)如miRNAs 可能起到重要作用。Liu 等[50]在小鼠糞便中檢測到大量的miRNA，同時也發(fā)現(xiàn)了廣泛的外泌體的存在，而在從小鼠糞便中分離出的外泌體中同樣攜帶眾多的miRNA，miRNA 譜對比分析顯示在糞便中豐度較高的miRNA，在外泌體中也大量存在。作者以厭氧具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）和兼性厭氧大腸桿菌（Escherichia coli）兩種腸道細(xì)菌為研究對象，通過生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)每個細(xì)菌核酸序列都被預(yù)測為許多miRNAs 的靶標(biāo)。用這些miRNAs 的模擬物在體外培養(yǎng)厭氧具核梭桿菌和兼性厭氧大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-515-5p 促進(jìn)了厭氧具核梭桿菌的生長，而hsa-miR-1226-5p 促進(jìn)了大腸桿菌的生長。以上試驗結(jié)果表明miRNAs 能夠直接影響細(xì)菌的生長且這種作用具有序列特異性。進(jìn)一步研究觀察到miRNAs 可進(jìn)入細(xì)菌，且在大腸桿菌培養(yǎng)過程中觀察到miRNA 在細(xì)菌中的動態(tài)積累。因此可以合理推測外泌體中的miRNA 可以轉(zhuǎn)移到腸道微生物體內(nèi)，從而影響微生物的生長與代謝，同時，不同的miRNA 對不同的細(xì)菌具有序列特異性，因而對于不同的種群會產(chǎn)生不同影響，進(jìn)一步調(diào)整腸道菌群的組成。

5 展望

目前，外泌體對于微生物作用的研究還相對較少，雖然已經(jīng)有研究證明了外泌體影響腸道微生物群的組成及菌種豐度，外泌體組分包括miRNA 和蛋白質(zhì)等對微生物作用的相關(guān)研究也已取得一定進(jìn)展，然而外泌體內(nèi)富集的信息分子成分及其功能還有待進(jìn)一步闡明。此外，關(guān)于外泌體作用于微生物的具體機(jī)制仍有待深入研究。外泌體對微生物作用的研究有著廣闊的應(yīng)用前景，相信隨著研究深入，能更好地闡明外泌體對微生物作用的機(jī)制，并在臨床實踐領(lǐng)域發(fā)揮其價值。