橘汁發(fā)酵過程中柑橘香氣及其貢獻(xiàn)化合物的分析

陳小華，黃 微，黨亞鋒，朱 瑜，耿敬章，金文剛

（1 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育） 陜西漢中723001 2 漢中市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心 陜西漢中 723000）

柑橘是世界第一大類水果，我國是全球最大的柑橘主產(chǎn)國，柑橘產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的27%，年產(chǎn)量超過3 000 萬t，占全國水果產(chǎn)量的21%[1-3]。柑橘產(chǎn)業(yè)作為我國長江中、上游地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)和綠色經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，在改善生態(tài)環(huán)境，提高橘農(nóng)收入及出口創(chuàng)匯中均扮演著重要角色。近年來，隨著我國柑橘產(chǎn)量的不斷提高，柑橘初加工市場日漸飽和，產(chǎn)值日益下降，以柑橘果酒為代表的柑橘深加工產(chǎn)業(yè)受到越來越多的關(guān)注，并在發(fā)酵工藝[4-7]、酵母篩選[8-9]、脫苦[10-11]、澄清和陳釀技術(shù)[12-14]等方面取得了較大的研究進(jìn)展。柑橘香氣是柑橘果酒區(qū)別于其它種類果酒的重要香氣屬性之一，是決定柑橘果酒品質(zhì)、市場價值和消費(fèi)者接受度的重要因素[15-16]。然而，迄今為止對于柑橘香氣在柑橘果酒釀造過程中的形成及影響機(jī)制少有報道。基于此，本研究以柑橘汁為試驗(yàn)材料，以柑橘香氣及其貢獻(xiàn)化合物以及異味物質(zhì)為研究對象，通過研究橘汁發(fā)酵過程中柑橘香氣及其貢獻(xiàn)化合物和異味物質(zhì)的變化，探討柑橘酒釀造過程中柑橘香氣形成過程及可能的影響因素，為今后該果酒香氣品質(zhì)提升提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柑橘樣品

城固蜜橘，采自陜西省城固縣橘園，采收時間為2021 年11 月5 日。果汁可溶性固形物含量12.5%，總酸含量0.58 g/100 mL，固酸比16.4，還原糖2.76 g/100 mL，出汁率36.4%。

1.2 材料及試劑

發(fā)酵袋、純凈水，市售；果酒酵母，安琪股份有限公司；聚酰胺樹脂、苯乙烯/二乙烯苯樹脂、果膠酶、表1 中序號為1～10 和18～25 的化合物、表4中的異丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；表1 中序號為11～17 和26～29 的化合物，北京百靈威科技有限公司；二氯甲烷、乙醚、正戊烷、皂土、硫酸、飽和食鹽水、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、蔗糖、偏重亞硫酸鉀和檸檬酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 鮮橘汁呈香物質(zhì)鑒定結(jié)果Table 1 Identification of aroma compounds in fresh orange juice

1.3 儀器與設(shè)備

榨汁機(jī)，廣東志高空調(diào)有限公司；LYT-330 型手持糖度計(jì)，昆山宏達(dá)光學(xué)儀器廠；固相萃取裝置，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；PHS-3C 型pH計(jì)，上海雷磁儀廠，CJJ78-1 型磁力攪拌器，常州市中貝儀器有限公司；TDL-5C 型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHA-2A 型恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司；正向硅膠色譜小柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；2010plus-TQ8040 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、2010plus-OPV277氣相色譜-人工嗅辨儀（GC-O），日本島津。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 柑橘汁發(fā)酵 選取新鮮柑橘果實(shí)，清洗去皮后榨汁，向果汁中加入0.05%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的果膠酶，40 ℃酶解60 min，加入蔗糖，調(diào)節(jié)糖度至25 Brix，加入偏重亞硫酸鉀調(diào)整SO2質(zhì)量濃度至50 mg/L，加入檸檬酸，調(diào)節(jié)pH 值至4.0，接入活化酵母（10 倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%蔗糖水中加入0.3%酵母，40℃溫育30 min），將果汁置于發(fā)酵袋中，于28 ℃連續(xù)發(fā)酵7 d。每天取樣1 次，共7 份樣品，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.4.2 香氣物質(zhì)提取 向100 mL 0.2%皂土溶液中加入10 g 柑橘汁樣品，攪拌混勻后室溫（25 ℃）靜置6 h，上清液加入聚酰胺樹脂，室溫攪拌過夜后，收集上清液并加入苯乙烯/二乙烯苯樹脂，室溫攪拌過夜后，收集樹脂并加入二氯甲烷，攪拌混勻1 h 后收集二氯甲烷，獲得橘汁香氣粗提物。香氣粗提物參考Joshi 等[17]報道的方法進(jìn)行純化，最終獲得橘汁香氣基性組分、酸性組分、水溶性組分和中性組分。

1.4.3 香氣物質(zhì)定性、定量分析 采用Chen 等[18]報道的方法，分析條件如下：色譜柱型號Inert-Cap-purWax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度230℃，進(jìn)樣口溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z 40～400，掃描速率1 scan/s，載氣：氦氣（流量1 mL/min）。分離程序：起始溫度60 ℃，保持3 min，以3℃/min 速度升溫至220 ℃，保持10 min，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣。每個樣品分析3 次以上，取平均值。香氣物質(zhì)定量分析采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對定量，內(nèi)標(biāo)物為癸酸乙酯（0.243 mg/kg），定性分析采用Nist2021 質(zhì)譜庫檢索、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜比對結(jié)合保留指數(shù)法綜合分析，保留指數(shù)使用正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C9～C27），采用公式（1）計(jì)算。

式中，RI——保留指數(shù)；RT（x）——待測化合物的保留時間（min）；n 和n+1——待測化合物流出前、后正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；RT（n）和RT（n +1）——待測化合物流出前、后正構(gòu)烷烴的保留時間（min）。

1.4.4 柑橘汁關(guān)鍵呈香物質(zhì)鑒定 采用Chen等[18]報道的氣味活性值（OAV）和GC-O 方法。分析條件如下：色譜柱型號InertCap-Wax（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm film thickness），進(jìn)樣口溫度與分離程序如上所述，載氣：氮?dú)猓髁? mL/min），進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣方法：不分流進(jìn)樣，樣品在氣相色譜端和嗅聞端的分離比為1∶1，嗅聞口的溫度170 ℃，濕熱空氣流量為100 mL/min。嗅聞方法簡述如下：7 名來自陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全專業(yè)的本科生（年齡20～22 歲，3 名男性，4 名女性）組成感官評價小組成員，在GC-O 分析的整個運(yùn)行時間內(nèi)，每名成員對嗅聞口端的流出物進(jìn)行嗅聞并記錄每個感知到的氣味物質(zhì)的氣味特征和強(qiáng)度（強(qiáng)度范圍：1～5，其中“1”為弱，“5”為強(qiáng)），每個小組成員進(jìn)行3 次嗅聞試驗(yàn)，測得的香氣屬性的強(qiáng)度值為3 次嗅聞試驗(yàn)的平均值并取整數(shù)。

1.4.5 感官分析 參考牛云蔚等[19]的方法，略有修改。20 mL 不同發(fā)酵階段橘汁樣品裝入棕色玻璃瓶中，上述7 名感官評價小組成員對樣品中的柑橘香氣強(qiáng)度進(jìn)行描述和評分（強(qiáng)度范圍：0～5，其中“0”為無，“5”為強(qiáng)）。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 采用WPS Excel 2019 軟件對香氣物質(zhì)相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性和相關(guān)性分析采用SPSS22.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘香氣貢獻(xiàn)化合物鑒定

GC-MS 結(jié)合氣味活性值（OAV）和GC-O 分析結(jié)果顯示（表1），從鮮橘汁中共鑒定出29 種呈香物質(zhì)，主要由果香氣（OAV平均值=206；氣味強(qiáng)度平均值=2.8）、柑橘香氣（OAV平均值=87；氣味強(qiáng)度平均值=2.9）、花香氣（OAV平均值=1 092；氣味強(qiáng)度平均值=2.5）、清香氣（OAV平均值=39；氣味強(qiáng)度平均值=3）和乳脂香氣（OAV平均值=2.5；氣味強(qiáng)度平均值=2）化合物構(gòu)成。OAV 分析結(jié)果顯示，2-甲基丁酸乙酯（果香氣）和芳樟醇展示了較高的OAV 值，分別為1 000 和4 932，其次為檸檬烯（柑橘氣味）、己酸乙酯（菠蘿氣味）、辛醛（柑橘氣味）、α-松油醇（丁香氣味）、香茅醇（柑橘氣味）和丁香酚（丁香氣味），其OAV 值范圍在110～261 之間，其余呈香物質(zhì)的OAV 值則較低。GC-O 分析結(jié)果顯示，2-甲基丁酸乙酯、辛醛和芳樟醇的氣味強(qiáng)度最高（5.0；強(qiáng)），其次為己醛、檸檬烯、香茅醇和丁香酚，其氣味強(qiáng)度值為4.0（較強(qiáng)）。此外，月桂烯、反式-2-已烯醛、己酸乙酯、癸醇、葉醇和α-松油醇也展示了中等的氣味強(qiáng)度（3.0）。相似的結(jié)果在前人的研究中也有報道，如Buettner 等[20]、Arena等[21]、Kumazawa 等[22]和Mastello 等[23]從鮮榨柑橘汁從中鑒定出己醛、月桂烯、檸檬烯、辛醛、壬醛、香蘭素等多種高OAV 氣味物質(zhì)。

如圖1 所示，柑橘香氣是柑橘汁香氣結(jié)構(gòu)中的重要香氣屬性之一，柑橘汁中類似柑橘氣味特征的香氣物質(zhì)在柑橘香氣屬性形成中扮演重要角色[16，20]。在本研究中，柑橘汁香氣提取物經(jīng)GC-O和OAV 分析共鑒定出月桂烯、庚醛、檸檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等9 種柑橘香氣貢獻(xiàn)化合物。

圖1 基于GC-O 和香氣強(qiáng)度分析的柑橘汁香氣輪廓Fig.1 Aroma profile of orange juice based on GC-O and aroma intensity analysis

固相微萃取提取技術(shù)（SPME）因其操作簡便及萃取濃縮一步到位的優(yōu)點(diǎn)，成為目前柑橘香氣物質(zhì)提取最常使用的方法[4-9]，然而該方法由于受到萃取頭容量限制及纖維素膜選擇性吸附的影響，對香氣物質(zhì)的吸附效率比較有限[15]。因而，本研究使用固相萃取技術(shù)[18]結(jié)合Joshi 等[17]的正向硅膠色譜分離方法對柑橘汁中的香氣物質(zhì)進(jìn)行高效萃取，將香氣物質(zhì)分離為基性組分（I）、酸性組分（II）、水溶性組分（III）和中性組分（IV）。相較于傳統(tǒng)SPME 方法，該方法可大大降低香氣物質(zhì)色譜分離過程中的峰重疊的出現(xiàn)，提高了定性準(zhǔn)確性[24]。使用該方法，本研究從鮮橘汁中還鑒定出2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、異戊醇、乙酸芳樟酯、香茅醇和橙花醇等新的氣味物質(zhì)，這些氣味物質(zhì)在其它文獻(xiàn)中少有報道。

2.2 柑橘香氣及其貢獻(xiàn)化合物在橘汁發(fā)酵過程中的變化

對柑橘香氣在橘汁發(fā)酵過中的感官分析顯示，鮮橘汁在發(fā)酵1～4 d 的過程中，柑橘香氣強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，隨后則逐漸減弱并呈現(xiàn)出濃烈的酸敗和刺激性氣味（表2）。相似的，伴隨柑橘香氣的增強(qiáng)，其貢獻(xiàn)化合物含量亦呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，在發(fā)酵第4 天，含量平均增加了約2～15倍（表3），隨后則顯著下降。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，柑橘香氣強(qiáng)度的變化與檸檬烯、γ-松油烯、辛醇和橙花醇含量增減有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。該結(jié)果表明，上述香氣物質(zhì)在柑橘香氣形成中扮演了重要角色，是柑橘香氣的關(guān)鍵貢獻(xiàn)化合物。相似的變化趨勢在康明麗等[4]的研究中也有報道，該研究結(jié)果顯示，柑橘汁在發(fā)酵7～35 d 的過程中，包括檸檬烯在內(nèi)的多種香氣物質(zhì)的含量也呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。游離態(tài)和糖苷鍵合態(tài)是柑橘汁中香氣物質(zhì)存在的兩種主要狀態(tài)，游離態(tài)香氣物質(zhì)可被直接感知，而糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)則無氣味[26-27]。柑橘汁在發(fā)酵初期香氣物質(zhì)含量顯著增加，可能與柑橘汁發(fā)酵過程中，糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)在酸或糖苷酶的水解作用下，形成游離態(tài)芳香化合物，從而使發(fā)酵橘汁中的香氣物質(zhì)含量不斷增加有關(guān)[28]。

表2 柑橘香氣在橘汁發(fā)酵過程中的變化Table 2 Changes of orange characteristic aroma during orange juice fermentation

表3 柑橘香氣貢獻(xiàn)化合物在橘汁發(fā)酵過程中的變化Table 3 Change of orange -like aroma compounds during orange juice fermentation

2.3 橘汁發(fā)酵過程中異味物質(zhì)的產(chǎn)生和變化

感官分析顯示，橘汁發(fā)酵4 d 后，伴隨柑橘香氣減弱，酸敗和刺激性氣味呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢（表2），這與橘汁發(fā)酵后期異味化合物大量產(chǎn)生有關(guān)。成分分析結(jié)果顯示，在橘汁發(fā)酵后期，一些異味化合物，如異丁酸（刺激性難聞氣味）、丁酸（刺激性難聞氣味）、2-甲基丁酸（刺激性氣味）、戊酸（汗臭和腐臭味）、己酸（汗液酸臭味）、庚酸（脂肪酸敗味）和辛酸（酸敗和汗臭氣味）的含量呈顯著增加的趨勢（表4），這些異味物質(zhì)對果酒中柑橘香氣具有顯著的遮蓋作用[29-31]。

表4 橘汁發(fā)酵過程中異味化合物的變化Table 4 Change of off-odorants during orange juice fermentation

3 結(jié)論

采用GC-MS 結(jié)合氣味活性值（OAV）和GCO 方法從鮮橘汁中鑒定出29 種香氣物質(zhì)，主要由果香氣、柑橘香氣、花香氣、清香氣和乳脂香氣化合物構(gòu)成，其中月桂烯、庚醛、檸檬烯、γ-松油烯、癸醇、辛醛、辛醇、香茅醇和橙花醇等化合物被鑒定為柑橘香氣貢獻(xiàn)化合物。在柑橘汁發(fā)酵過程中，柑橘香氣強(qiáng)度及其貢獻(xiàn)化合物含量均呈先增加后降低的趨勢，二者呈正相關(guān)，糖苷鍵合香氣化合物在橘汁發(fā)酵過程中，水解為自由態(tài)香氣化合物可能是柑橘香氣貢獻(xiàn)化合物顯著增加的重要原因。伴隨柑橘香氣強(qiáng)度及其貢獻(xiàn)化合物含量的降低，異味化合物含量則呈顯著增加的趨勢，其對柑橘香氣具有顯著的遮蓋作用。