枯草芽孢桿菌發(fā)酵對豆類中酚類物質(zhì)及抗氧化活性的影響

唐雙慶，魯慧琪，李秀麗，邱怡君，王 敏，徐 媛，王紅波，2*

（1 江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全研究中心 武漢430056 2 湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心 武漢 430056）

豆類不僅含有碳水化合物和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有多酚、多肽和低聚糖等生物活性成分[1]。植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物，主要存在于植物的果、皮、根、葉等組織器官中，具有抗氧化、抗糖尿病、降低膽固醇、護(hù)肝以及抗心腦血管疾病等功效，植物多酚已引起食品研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[2-5]。發(fā)酵豆制品是我國居民喜食的傳統(tǒng)豆類食品，微生物發(fā)酵可提高豆類的營養(yǎng)特征和生物活性功能[6]。目前，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和少量真菌等微生物菌種可應(yīng)用于豆類發(fā)酵[7]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）常用于食品和動物飼料產(chǎn)品的加工。枯草芽孢桿菌所產(chǎn)納豆激酶在體內(nèi)、外均具有溶栓活性，且對機(jī)體無毒性，經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的豆類食品營養(yǎng)價值和生物活性能得到顯著改善[8]。Sanjukt 等[9]研究表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆和黑豆，其總酚含量分別從1.93 mg GAE/g 和1.64 mg GAE/g 增至7.9～8.4 mg GAE/g和6.9～7.5 mg GAE/g，且大豆的DPPH 自由基清除率從1.3 mg AAE/g 增至29.9 mg AAE/g。Limón等[10]研究發(fā)現(xiàn)菜豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，可溶性酚類含量在48 h 和96 h 分別提升96%和126%，且氧自由基清除能力從170 mg TE/g 最高增至540 mg TE/g。自由基的氧化應(yīng)激對生物細(xì)胞具有毒害作用，抗氧化活性物質(zhì)有利于清除氧化自由基，酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力顯著相關(guān)[11]。國內(nèi)外現(xiàn)有研究報道多集中在微生物發(fā)酵對1～5種常見豆類酚類含量及抗氧化活性的比較研究，而研究豆類種類偏少，且不同酚類物質(zhì)含量變化研究也不充分。本研究評價枯草芽孢桿菌ATCC 6051 發(fā)酵對綠豆、蠶豆、豇豆、紅豆、菜豆、豌豆、大豆以及扁豆總酚含量，19 種多酚類物質(zhì)組成和抗氧化活性的影響，為中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆類食品的開發(fā)和推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種豆類（綠豆、蠶豆、豇豆、紅豆、菜豆、豌豆、大豆、扁豆），湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心。菌種枯草芽孢桿菌ATCC 6051 保藏于江漢大學(xué)食品營養(yǎng)與安全研究中心。

6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、蘆丁、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三 嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ），北京索萊寶公司；氫化肉桂酸等19 種標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司；2，2’-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（2，2’-Azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），麥克林公司；LB（Luria-Bertani）肉湯培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司；沒食子酸等分析純級試劑均購于國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

YRE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配有SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵），予華儀器有限責(zé)任公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Freezone 6 Plus 冷凍干燥機(jī)，LABCONCO；Vanquish 超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（配電噴霧離子源以及TraceFinder 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、Multiskan Go 1510 全波長酶標(biāo)儀，Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 制備LB 肉湯和固體培養(yǎng)基，于121 ℃條件下滅菌15 min。將凍藏于-80 ℃條件下的Bacillus subtilis ATCC 6051 菌種接種劃線，于37 ℃下培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到種子液。

1.3.2 發(fā)酵處理 參考Li 等[12]和Saharan 等[13]的發(fā)酵方法。將8 種豆類分別磨成粉末狀，每種豆粉稱取10 g，置入潔凈發(fā)酵瓶，轉(zhuǎn)移至滅菌鍋，滅菌條件為121 ℃/15 min，冷卻后，按照5%體積分?jǐn)?shù)接入種子液，發(fā)酵溫度設(shè)置為37 ℃，發(fā)酵時間設(shè)置為7 d。發(fā)酵結(jié)束后，將樣品置于-80 ℃冰箱冷凍干燥12 h，于-20 ℃儲存待測。

1.3.3 酚類物質(zhì)提取 參考王何柱等[14]酚類物質(zhì)提取方法。稱取1 g 凍干樣品于試管中，加入80%丙酮溶液20 mL，劇烈振蕩10 min，取上清液通過0.22 μm 濾膜過濾，重復(fù)此操作2 次。收集濾液蒸干至10 mL，加入蒸餾水定容至25 mL，置于-20℃下冷藏待分析。

1.3.4 總酚含量測定 參考Hung 等[15]總酚含量測定方法。配制不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置30 s，加入3 mL 10 g/100 mL Na2CO3溶液，蒸餾水定容至5.0 mL，黑暗條件下反應(yīng)30 min。在波長760 nm 處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果用毫克沒食子酸當(dāng)量每克干重豆粉表示（mg GAE/g dw）。

1.3.5 酚類物質(zhì)組成分析 利用超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（外標(biāo)法定量）測定酚類組成。色譜條件和質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)[16]～[18]的方法。色譜條件：色譜柱：Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A 相為超純水，B 相為乙腈（A、B 相均含有0.1%乙酸）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動相洗脫梯度程序如下：0.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；2.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；6.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.1 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；12.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb；離子噴霧電壓：-2 800 V；溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃。掃描模式：單離子檢測模式；掃描方式：負(fù)離子。樣品酚類物質(zhì)含量對照標(biāo)準(zhǔn)品濃度計算得出。

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH 清除活性測定 參考白周亞等[19]DPPH 自由基清除活性測定方法。配制DPPH 溶液和Trolox 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照以下方式添加A0、A1和A2待測液進(jìn)行測定：A0為1 mL DPPH 中加入1 mL 蒸餾水，A1為1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液中加入1 mL 無水乙醇，A2為1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液中加入1 mL DPPH 溶液，搖勻，于黑暗條件下靜置30 min，于波長517 nm 處分別測定A0、A1和A2吸光度值。豆類提取物DPPH 自由基清除活性以清除率表示。DPPH 清除率按公式（1）計算：

1.3.6.2 ABTS+清除活性測定 參考Moghadam等[20]ABTS+自由基清除活性測定方法。提前制備ABTS+清除活性測定工作液，配制不同濃度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)整ABTS+工作液吸光度至0.700±0.001。按照以下方式添加Ai和A0待測液進(jìn)行測定：Ai為100 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液中加入1 mL ABTS 稀釋液，A0為100 μL 甲醇中加入1 mL ABTS 稀釋液，于黑暗條件下靜置10 min，于波長734 nm 處分別測定Ai和A0吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。豆類提取物ABTS+自由基清除活性以每克干重豆粉所含Trolox 當(dāng)量的微摩爾數(shù)表示（μmol TE/g dw）。ABTS+清除率按公式（2）計算：

1.3.6.3 鐵離子還原能力測定 參考唐雙慶等[21]鐵離子還原能力測定方法。提前制備FRAP 工作液，使用前預(yù)熱至37 ℃。配制不同濃度FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液，加入1.8 mL FRAP 工作液，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)10 min，于波長593 nm 處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。豆類提取物鐵離子還原能力以每克干重豆粉所含硫酸亞鐵當(dāng)量的微摩爾數(shù)表示（μmol FE/g dw）。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)均設(shè)置3 組重復(fù)，結(jié)果按照“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 26 分析數(shù)據(jù)的顯著性和相關(guān)性，Origin Pro 2021 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆類總酚含量變化

圖1 為發(fā)酵前、后8 種豆類總酚含量變化。發(fā)酵前扁豆、豌豆、綠豆、大豆、蠶豆、菜豆、紅豆和豇豆總酚含量依次為（1.16±0.05），（1.39±0.17），（1.55±0.06），（1.58±0.11），（1.85±0.13），（2.85±0.13），（4.63±0.30），（5.56±0.59）mg GAE/g dw，豇豆和紅豆總酚含量較高，豌豆和扁豆總酚含量較低。發(fā)酵綠豆、豇豆、紅豆、菜豆、蠶豆、豌豆、大豆和扁豆總酚含量分別達(dá)到（4.23±0.54），（3.86±0.24），（5.75±0.58），（4.50±0.15），（4.14±0.19），（6.16±0.55），（5.14±0.06），（4.64±0.55）mg GAE/g dw。發(fā)酵豇豆總酚含量下降了30.58%，可能由于枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中多酚氧化酶活力較高，導(dǎo)致酚類化合物被氧化分解，豇豆總酚含量降低[22]。發(fā)酵紅豆、菜豆、蠶豆、綠豆、大豆、扁豆和豌豆總酚含量分別增加24.19%，57.89%，123.78%，172.90%，225.32%，300.00%和343.17%。發(fā)酵豆類總酚含量增加與枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶有關(guān)，這種酶可以水解以共軛形式存在的酚苷的β-葡萄糖苷鍵，使之成為相應(yīng)的酚苷元，從而增加游離總酚含量[23]。Jhan 等[24]研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵紅豆總酚含量從（2.59±0.01）mg GAE/g 增加至（3.63±0.03）mg GAE/g。Ali 等[25]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵綠豆、大豆和蠶豆總酚含量增加。

圖1 8 種豆類發(fā)酵前、后總酚含量變化Fig.1 Changes in the total phenol content of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.2 豆類酚類物質(zhì)組成分析

圖2 為19 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品離子流色譜圖。表1 為發(fā)酵前、后8 種豆類19 種酚類化合物含量。發(fā)酵豇豆、蠶豆、綠豆、豌豆、菜豆、紅豆、大豆和扁豆游離苯丙氨酸含量分別增加了706.92%，806.94%，878.97%，1041.82%，1489.77%，1645.47%，1 910.11%和4 077.23%，發(fā)酵大豆具有最高的苯丙氨酸含量，達(dá)到（174.88±9.09）μg/g。苯丙氨酸是一種人體必需氨基酸，發(fā)酵過程中微生物分泌水解蛋白酶是游離苯丙氨酸含量提高的原因[26]。3，4-二羥基苯甲酸、苯甲酸和對香豆酸是常見的防腐劑[27]，發(fā)酵后8 種豆類3，4-二羥基苯甲酸和苯甲酸含量上升，對香豆酸含量下降，發(fā)酵紅豆3，4-二羥基苯甲酸含量最高達(dá)到（14.96±0.78）μg/g，發(fā)酵大豆苯甲酸含量最高達(dá)到（5.19±0.82）μg/g。3，4-二羥基苯甲醛、丁香醛和香草醛3 類醛類化合物在微生物發(fā)酵過程中，易被氧化生成相應(yīng)的酸類化合物，發(fā)酵后均未被檢出。兒茶素、表兒茶素、水楊酸和芥子酸是8 種豆類中具有抗氧化功能的酚酸[28-29]。發(fā)酵能影響豆類中兒茶素、表兒茶素、水楊酸和芥子酸的含量。發(fā)酵紅豆和豇豆中兒茶素、表兒茶素含量增加，分別達(dá)到（21.64±2.77）μg/g 和（13 .90 ±1 .48）μg/ g，（5 .00 ±0 .28）μg/ g 和（2 .38±0.37）μg/g。發(fā)酵紅豆的水楊酸含量上升，達(dá)到（1.15±0.19）μg/g；而菜豆芥子酸含量下降了87.80%。

表1 8種豆類發(fā)酵前、后酚類化合物組成Table 1 Phenolic composition of 8 kinds of beans before and after fermentation

圖2 19 種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品離子流色譜圖Fig.2 Ion chromatography of 19 phenolic compound standards

2.3 豆類提取物抗氧化活性變化

2.3.1 豆類提取物DPPH 清除活性圖3a 為發(fā)酵前、后8 種豆類提取物DPPH 清除活性變化。發(fā)酵前紅豆、豇豆和菜豆提取物DPPH 清除活性較高，分別達(dá)到95.10% ± 0.24%，95.37% ± 0.40%和81.82%± 2.40%。發(fā)酵后豇豆和菜豆DPPH 自由基清除活性分別下降了20.48%和39.86%。抗氧化活性與總酚含量顯著相關(guān)，豇豆總酚含量下降，導(dǎo)致DPPH 自由基清除活性下降[30]。豆類抗氧化活性組分主要有酚類化合物和類胡蘿卜素等，菜豆提取物DPPH 自由基清除活性下降，可能與發(fā)酵過程中具有抗氧化活性成分含量下降的原因有關(guān)[31]。發(fā)酵后綠豆、豌豆、蠶豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除活性均有提高，其中豌豆和大豆提高最多，分別增加了118.00%和106.94%。Li 等[12]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵大豆48 h 后大豆提取物DPPH 自由基清除活性增加至61.10%。Jeon 等[32]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）P229發(fā)酵大豆，也獲得了較高的DPPH自由基清除率。

圖3 8 種豆類發(fā)酵前、后抗氧化活性變化Fig.3 Changes in antioxidant activity of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.3.2 豆類提取物ABTS+清除活性圖3b 為發(fā)酵前、后8 種豆類提取物ABTS+清除活性變化。發(fā)酵前蠶豆、紅豆和豇豆提取物ABTS+自由基清除活性較高，分別達(dá)到（36.18±1.70），（40.29±1.93），（47.86±1.93）μmol TE/g dw。發(fā)酵后豇豆和蠶豆提取物ABTS+自由基清除活性分別下降了54.91%和60.59%。豇豆提取物ABTS+自由基清除活性與發(fā)酵后其總酚含量下降相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)少孢根霉發(fā)酵也會導(dǎo)致蠶豆提取物ABTS+清除活性下降[33]。發(fā)酵后綠豆、大豆、扁豆和豌豆提取物的ABTS+清除活性上升，分別提高了241.34%，176.29%，244.95%和570.60%，其中豌豆ABTS+清除活性上升最高。Yu 等[34]研究發(fā)現(xiàn)利用蛹蟲草（Cordyceps militaris）SN-18 發(fā)酵綠豆，其ABTS+清除活性提升了2.1 倍。

2.3.3 豆類提取物鐵離子還原能力 圖3c 為發(fā)酵前、后8 種豆類提取物鐵離子還原能力變化。發(fā)酵前紅豆和豇豆提取物鐵離子還原能力較高，分別達(dá)到（47.60±0.72），（59.49±0.97）μmol FE/g dw。發(fā)酵后綠豆、扁豆、豌豆和大豆提取物鐵離子還原能力分別提高了69.07%，188.63%，279.87%和297.12%。發(fā)酵后豇豆、紅豆和菜豆提取物鐵離子還原能力下降，其中豇豆最多下降了61.35%。Muhialdin 等[35]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵苦豆提取物鐵離子還原能力下降了6.75%。

利用3 種不同抗氧化活力評價方法比較分析8 種豆類發(fā)酵前、后抗氧化功能變化。研究結(jié)果表明：大豆、綠豆、豌豆和扁豆適宜于利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高抗氧化活力的豆類食品。

2.4 不同豆類總酚含量及酚類組成與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由表2 可知，總酚含量與DPPH 自由基清除活性、ABTS+清除活性和鐵離子還原能力均極顯著相關(guān)（P＜0.01）。劉婷婷等[36]對不同雜豆總酚和抗氧化活性的研究表明，總酚與總抗氧化之間呈極顯著正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)兒茶素、水楊酸和反式肉桂酸與DPPH、FRAP 呈極顯著正相關(guān)，芥子酸與DPPH 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；表兒茶素與DPPH 呈顯著正相關(guān)，水楊酸與ABTS 呈顯著正相關(guān)，3，4-二羥基苯甲酸和氫化肉桂酸與DPPH、FRAP 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。多酚化合物清除自由基抗氧化活性主要通過順序質(zhì)子損失電子轉(zhuǎn)移、氫原子轉(zhuǎn)移和單電子轉(zhuǎn)移等機(jī)制實(shí)現(xiàn)[37]。兒茶素和水楊酸等酚類化合物可以通過給出氫離子與自由基結(jié)合或直接給出電子將自由基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)活性低的陰離子，還可以先給出質(zhì)子轉(zhuǎn)化為陰離子，再由陰離子給出電子將自由基轉(zhuǎn)化為陰離子去清除自由基[38-39]。苯丙氨酸、香草酸、香草醛、沒食子酸、丁香酸、丁香醛、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、對香豆酸、反式阿魏酸和苯甲酸與抗氧化相關(guān)性較低。王何柱等[40]對不同花色蕓豆的酚類化合物與抗氧化進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸也與抗氧化的相關(guān)性較低。

表2 總酚、酚類組成與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 Correlation between total phenols，phenolic composition and antioxidant activity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用枯草芽孢桿菌ATCC 6051 發(fā)酵綠豆和紅豆等在內(nèi)的8 種常見豆類。發(fā)酵后綠豆、紅豆、蠶豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆7 種豆類多酚含量增加，其中發(fā)酵豌豆總酚含量提高了343.17%，達(dá)到（6.16±0.55）mg GAE/g dw。發(fā)酵后8 種豆類游離苯丙氨酸、3，4-二羥基苯甲酸和苯甲酸含量增加。發(fā)酵綠豆、豌豆、蠶豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除率上升，其中豌豆上升最多。發(fā)酵綠豆、大豆、豌豆和扁豆提取物ABTS+清除活性增加，其中豌豆增加最多為570.60%。發(fā)酵綠豆、扁豆、豌豆和大豆提取物鐵離子還原能力提高，其中大豆增加最多為297.12%。總酚含量與3 個抗氧化指標(biāo)均極顯著相關(guān)（P＜0.01）。大豆、綠豆、豌豆和扁豆是利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備高抗氧化活力食品的理想豆類食品原料。