實時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)檢測蜂蜜摻偽大米糖漿

楊 浩，徐 慧，李欣妍，盧 鑫，楊 倩，張 偉，3，4*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工系 河北滄州061100 3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定071000 4 河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室 河北保定071000 5 河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北保定 071000）

蜂蜜是蜜蜂從各種植物分泌物中釀造產(chǎn)生的天然甜味物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值和良好的感官性能[1]。隨著國內(nèi)外對蜂蜜需求量日益增加，蜂蜜的市場供不應(yīng)求[2]。在巨大的利益驅(qū)動下導(dǎo)致其摻偽現(xiàn)象嚴重[3]。這不僅損壞消費者利益，而且沉重打擊了合規(guī)蜂企和蜂農(nóng)的利益。目前市場中約有90%的蜂蜜摻偽與甜味劑有關(guān)，最常見的為大米糖漿[4]。由于蜂蜜摻偽鑒別難度大，現(xiàn)有的檢測技術(shù)很難做到簡便、快速的鑒別[4-5]，且國內(nèi)外對于蜂蜜摻偽的檢測標準并不完善，因此，開發(fā)一種簡單、快速的檢測蜂蜜摻偽方法成為研究熱點。

近年來，許多分析技術(shù)被用于蜂蜜的真實性檢測[6-7]。核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）被認為是最有效的方法之一[8]，然而其成本高，耗時長。氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[9]、高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）[10]這些方法在應(yīng)用于熱處理食品檢測時存在一定局限，且步驟繁瑣，不能滿足快速檢測要求。近紅外光譜技術(shù)（Near infra-red spectroscopy，NIRS）[11-13]、傅里葉變換拉曼光譜（Fourier transform-Raman spectroscopy，F(xiàn)TRS）[14-15]、穩(wěn)定性碳同位素質(zhì)譜（Stable carbon isotope mass spectrometry，SCIMS）[16]等技術(shù)都需要專業(yè)的操作人員，限制了其在常規(guī)檢測中的應(yīng)用?；贒NA 檢測的聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光定量PCR 已在蜂蜜摻偽檢測中得到應(yīng)用。如Sobrino-Gregorio 等[17]通過實時PCR 定量檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的相對靈敏度為2%～5%，靈敏度高，特異性良好，然而反應(yīng)需要復(fù)雜的變溫過程。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸等溫擴增技術(shù)發(fā)展迅速。

本研究團隊基于Bst 酶擴增DNA 的一個新特性，創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)，其原理如圖1 所示。與滾環(huán)擴增（Rolling circle amplifification，RCA）相比[18-19]，SRCA 省時、簡便，無需人為環(huán)化模板；與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相比[20-21]，不需要設(shè)計復(fù)雜的引物，僅需1 對引物便可完成對線性DNA 的擴增，已在摻偽檢測方面得到應(yīng)用，如可視化SRCA 檢測羊肉中鴨肉源成分[22]，豬肉摻偽檢測[23]等肉類產(chǎn)品的真實性評估。本研究針對3種DNA 提取方法，優(yōu)選最佳DNA 提取方法。以大米的4 種特異性基因（PDL、SPS、rbcL、GOS9）為靶序列篩選適宜的引物。將SRCA 與熒光技術(shù)相結(jié)合，建立檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的方法，為蜂蜜摻假的快速檢測提供新方法。

圖1 SRCA 原理圖Fig.1 SRCA schematic

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種植物糖漿（大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、甘蔗糖漿）、槐花蜂蜜均購于當?shù)卮笮褪袌雠c電商平臺；商業(yè)試劑盒“NucleoSpin Food”，基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司；深加工食品DNA 提取試劑盒（Processed food DNA Extraction Kit），上海冀杰生物科技有限公司；Bst DNA 聚合酶及其緩沖液，大連寶生物工程有限公司；EvaGreen 熒光染料，上海開放生物科技有限公司；磷酸鹽（PBS）緩沖液、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等購于當?shù)卦噭┕尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR 儀，中國Archimed Analyzer 公司；TGL16A 臺式離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DXY-33A 型電泳儀，北京六一儀器廠；StepOnePlus qPCR 儀，美國Applied biosystems 公司；H1850R 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Nanodrop 2000 核酸蛋白測定儀，Gene company Limited 基因有限公司。

1.3 DNA 的提取

使用合適的DNA 提取方法，提取出較高產(chǎn)量與純度的DNA 是SRCA 成功的關(guān)鍵[17，24]。對比3種DNA 提取方法（改良的深加工食品DNA 提取試劑盒、改進的CTAB 法、“NucleoSpin Food”商業(yè)試劑盒[25]）。在預(yù)處理的過程中，CTAB 沉淀液具有沉淀DNA 的作用，加之糖漿液體比較黏稠，結(jié)果并不理想，因此，采用PBS 緩沖液對樣品進行預(yù)處理，因其具有調(diào)節(jié)鹽平衡、調(diào)節(jié)適宜pH 值、保護溶液生物活性物質(zhì)的特點。準備大米糖漿樣品48 mL，分裝于6 個50 mL 的離心管中（每管8 mL），經(jīng)PBS 緩沖液預(yù)處理，對比3 種方法，分別進行DNA 的提取。將提取的模板DNA 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀的紫外光下觀察電泳條帶。

1.4 DNA 濃度與純度的測定

對于深加工產(chǎn)品而言，提取的DNA 需要消除SRCA 反應(yīng)的抑制劑，才可用于后續(xù)SRCA 反應(yīng)[17]。用分光光度計測定大米基因組DNA 濃度和純度（A260/280），當純度（A260/280）在1.8～2.1 之間時，可用于SRCA 反應(yīng)，如表1 所示。最后-20 ℃保存水稻基因組DNA，備用。

表1 水稻引物組信息Table 1 Rice primer set information

1.5 引物的設(shè)計與篩選

大米糖漿的DNA 在加工過程中會高度裂解，為確保檢測結(jié)果的準確性，選擇具有種內(nèi)保守性、種間特異性的大米基因；為保證目的序列的完整性，在NCBI 中分別選擇大米的4 種特異性基因（PDL、SPS、rbcL、GOS9）為靶序列設(shè)計引物，在BLAST 上進行同源性比對，使用DNAMAMN 軟件設(shè)計引物，引物序列詳細信息見表1。

1.6 實時熒光SRCA 的反應(yīng)體系和條件

實時熒光SRCA 反應(yīng)總體系為20 μL，包括MgSO4（20.0 mmol/L）3 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5 μL，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL，正反向引物（1 μmol/L）1 μL，大米模板DNA 為1 μL，Bst DNA 聚合酶（8 000 U/mL）1.5 μL，無菌去離子水4.5 μL，EvaGreen 熒光染料1 μL。將大米DNA 模板置于94 ℃條件下，預(yù)變性3 min，加入反應(yīng)體系混合液與EvaGreen 熒光染料，利用熒光定量PCR儀進行反應(yīng)，62 ℃反應(yīng)40 min，設(shè)置每1 min 執(zhí)行采集1 次熒光信號值，隨后在80 ℃條件下放置5 min，防止反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生，最后置于4 ℃冰箱以終止反應(yīng)。

1.7 SRCA 擴增產(chǎn)物的序列分析

將SRCA 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察紫外光下的電泳條帶得到結(jié)果。電泳結(jié)束后切取膠塊底部3 條DNA 片段，進行純化、連接、轉(zhuǎn)化，送往華大基因公司測序分析。

1.8 實時熒光SRCA 定量檢測方法的優(yōu)化

在預(yù)試驗反應(yīng)體系的基礎(chǔ)之上，通過單因素實驗進行反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化。反應(yīng)體系中添加EvaGreen 熒光染料[26]，采用實時熒光SRCA 進行添加量梯度的優(yōu)化方式，分別對Mg2+添加量（1，2，3，4，5 μL）、反應(yīng)溫度（60，61，62，63，64℃）、酶的添加量（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL）、dNTPs的添加量（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 μL）進行優(yōu)化，設(shè)置每1 min 執(zhí)行采集1 次熒光信號值。

1.9 實時熒光SRCA 特異性試驗

將5 種植物糖漿（玉米糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、甘蔗糖漿、大米糖漿）進行基因組DNA 的提取，每種植物糖漿分別準備5 份不同樣品，并在上述最適的反應(yīng)條件下，進行實時熒光SRCA 反應(yīng)，通過擴增曲線驗證樣品，以評估實時熒光SRCA定量方法檢測蜂蜜中大米糖漿成分的特異性，每個樣品重復(fù)3 次。

1.10 實時熒光SRCA 靈敏度及檢出限試驗

為了評估SRCA 檢測方法的靈敏度，利用無菌、無酶水對大米模板DNA 進行梯度稀釋，其初始質(zhì)量濃度為84.5 ng/μL，然后采用10 倍梯度稀釋法，將大米模板DNA 依次稀釋至8.45×107～8.45×100fg/μL，通過實時熒光SRCA 對大米模板DNA 的系列稀釋液進行檢測，以評價該方法的靈敏度，每個樣品重復(fù)3 次。

1.11 人工模擬摻偽檢測試驗

為了驗證實時熒光SRCA 定量方法對檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的實用性，進行人工模擬摻偽檢測試驗。在純槐花蜂蜜中摻入不同比例的純大米糖漿，按照相應(yīng)的摻偽質(zhì)量分數(shù)（0.5%，1%，5%，10%，20%，50%）進行評估，通過實時熒光SRCA對不同摻偽比例的混合樣品進行定量檢測，每個樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取方法的選擇

蜂蜜與大米糖漿中的高碳水化合物和酚類化合物的存在是影響DNA 提取與擴增的主要因素，酚類化合物被氧化后與DNA 結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，使提取的DNA 活性降低；高碳水化合物如多糖，易形成膠狀物，很難從DNA 中完全分離出來，DNA 洗脫液中殘留的多糖成分，會賦予洗脫液一定的黏性，從而抑制聚合酶、限制性內(nèi)切酶等多種生物酶的活性，因此，DNA 提取方法的優(yōu)選，直接影響該方法的實用性[27-29]。

通過對比3 種DNA 的提取方法，提取大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA，獲得的瓊脂糖凝膠圖像，結(jié)果如圖2 所示。泳道2 與泳道5 為改良的CTAB 方法提取大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA，出現(xiàn)了較淺的DNA 條帶；泳道1 與泳道4 為改良的深加工食品DNA 提取試劑盒對大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ模板DNA 的提取，出現(xiàn)了較明顯的DNA 條帶；泳道3 與泳道6 為商業(yè)試劑盒提取方法，在大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA 提取結(jié)果檢測中均出現(xiàn)明顯的DNA 條帶。如表2 所示，為使用分光光度劑測量3 種方法提取DNA 的濃度與純度（A260/280）。結(jié)果表明，相比其它2 種方法，商業(yè)試劑盒方法提取大米DNA 更高效。

表2 DNA 質(zhì)量濃度與純度測定Table 2 DNA mass concentration and purity were determined

圖2 模板DNA 膠圖Fig.2 Template DNA glue diagram

2.2 引物的篩選

使用4 種特異性引物（PDL、SPS、rbcL、GOS9）對3 種方法提取的DNA 進行SRCA 反應(yīng)。如表3所示。改良的CTAB 方法提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應(yīng)時，4 組引物均未出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，說明該方法提取的大米DNA 不適用于SRCA擴增反應(yīng)，故舍棄。

表3 SRCA 引物的篩選Table 3 Screening of SRCA primers

改良的深加工食品DNA 提取試劑盒提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應(yīng)時，PDL、SPS、GOS9 引物對大米糖漿Ⅰ的模板DNA 出現(xiàn)了擴增現(xiàn)象，且PDL 引物的Ct 值最小，GOS9 引物的Ct 值最大，對大米糖漿Ⅱ的模板DNA 檢測中，只有PDL 引物與GOS9 引物產(chǎn)生擴增結(jié)果，SPS引物并未擴增，結(jié)果可能是大米糖漿Ⅱ在加工處理過程中因加熱導(dǎo)致DNA 降解現(xiàn)象較為嚴重，或改良的深加工食品DNA 提取試劑盒提取DNA 采用非離心柱的分離方式，操作過程中雜質(zhì)分離不徹底，模板DNA 中殘留少量的DNA 反應(yīng)抑制劑，對SRCA 反應(yīng)起抑制作用。

商業(yè)試劑盒提取的大米DNA 進行實時熒光SRCA 反應(yīng)時，PLD、SPS、GOS9 引物對大米糖漿Ⅰ與大米糖漿Ⅱ的模板DNA 均產(chǎn)生擴增現(xiàn)象。PDL引物的Ct 值均最小，GOS9 引物的Ct 值最大。rbcL引物對大米糖漿（I 和II）均未顯示擴增結(jié)果，因此該引物特異性較差。結(jié)果表明，相比于其它3 種引物，PLD 引物具有良好的特異性。

2.3 SRCA 反應(yīng)條件優(yōu)化

采用實時熒光SRCA 進行反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果如圖3 所示，當Mg2+添加量為3 μL，熒光曲線的Ct 值最小，擴增效率最高；當反應(yīng)溫度為62 ℃，熒光曲線的Ct 值最小，具有最好的酶活性；Bst DNA 聚合酶的最適添加量1.5 μL；dNTPs 的最適添加量為5.0 μL。

圖3 SRCA 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of SRCA reaction system and reaction conditions

2.4 測序結(jié)果分析

如圖4 所示，SRCA 擴增條帶為梯形條帶，結(jié)果與目的片段一致，為進一步驗證結(jié)果的準確性，進行測序分析，測序結(jié)果藍色代表正向引物（FWP），紅色代表反向引物（RVP）的反向互補序列，目的序列片段長度為82 bp。隨機添加序列為4 bp，產(chǎn)物為含有目的序列的串聯(lián)重復(fù)片段，結(jié)果表明，SRCA 的擴增產(chǎn)物與大米PLD 靶區(qū)匹配良好。

2.5 特異性試驗

由圖5 可知，5 種大米糖漿樣品檢測到了擴增信號，判定為陽性，其它植物糖漿樣品（玉米糖漿、麥芽糖漿、甜菜糖漿、甘蔗糖漿）均未出現(xiàn)擴增曲線，即未發(fā)生擴增反應(yīng)，判定為陰性，結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性，可用于大米糖漿成分的鑒定。

2.6 靈敏度及檢出限試驗

由圖6a 可知，當大米DNA 質(zhì)量濃度為8.45×107～8.45×101fg/μL 時，可檢測到大米DNA 的熒光擴增信號，且Ct 值逐漸增大；當DNA 質(zhì)量濃度為8.45×100fg/μL 時，沒有產(chǎn)生擴增曲線，即未發(fā)生擴增反應(yīng)，因此該檢測方法的靈敏度為84.5 fg/μL，由于大米糖漿在加工處理的過程中，造成DNA 降解的現(xiàn)象較為嚴重，然而其仍具有良好的靈敏度。如圖6b 所示，大米DNA 質(zhì)量濃度的對數(shù)與Ct 值存在線性關(guān)系，線性方程為y=-2.209x +27.438（R2=0.995），結(jié)果表明，該方法檢測大米DNA 具有良好的靈敏度。

圖6 靈敏度分析Fig.6 Sensitivity analysis

2.7 人工模擬摻偽試驗

圖7a 為純槐花蜂蜜和摻入不同百分比純大米糖漿的實時熒光SRCA 結(jié)果圖像。對蜂蜜中人工摻偽大米糖漿的不同質(zhì)量比例（0.5%，1%，2%，5%，10%，20%，50%）進行評估，對混合樣品的大米糖漿含量進行定量檢測，摻偽質(zhì)量比與其對應(yīng)Ct 值如下：50%（9.981），20%（12.340），10%（14.510），5%（16.122），2%（18.435），1%（21.055），0.5%（0），質(zhì)量比在50%～1%時，產(chǎn)生熒光信號，且Ct 值逐漸增大，摻假比例在0.5%時，未產(chǎn)生熒光信號，說明不能區(qū)分0.5%的摻偽率，而可以檢測到1%的摻假率，因此，該方法可以檢測到蜂蜜中大米糖漿的摻假水平為1%。如圖7b 所示，質(zhì)量比的對數(shù)與其對應(yīng)的Ct 值線性關(guān)系良好，建立的線性方程y=6.618x+7.651，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，線性關(guān)系良好。相比于Sobrino-Gregorio 等[17]通過實時PCR 檢測蜂蜜中大米糖漿（定量水平為2%～5%），實時熒光SRCA 靈敏度更高，因為SRCA 檢測方法能夠擴增較小的DNA 片段（60～120 bp）或高度降解的DNA[1]。

圖7 人工模擬摻偽檢測及檢出限測定Fig.7 Artificial simulation detection of adulteration and detection limit

3 結(jié)論與討論

蜂蜜與大米糖漿中高碳水化合物、酚類化合物的存在是影響DNA 提取與擴增的主要因素[30]。在預(yù)處理過程中，CTAB 沉淀液具有沉淀DNA 的作用，而糖漿制品的DNA 破壞比較嚴重，而且糖漿液體比較黏稠，提取效果并不理想，PBS 緩沖液具有調(diào)節(jié)適宜pH 值、調(diào)節(jié)鹽平衡、保護溶液生物活性物質(zhì)的特點。因此，采用PBS 緩沖液進行樣品預(yù)處理，并評估3 種DNA 提取方法，對比結(jié)果表明，商業(yè)試劑盒“NucleoSpin Food”的DNA 提取效率最好，且操作簡單，用時更少。大米特異性基因的選擇同樣是實時熒光SRCA 檢測植物源成分的關(guān)鍵。本研究以4 種特異性基因為靶序列，分別設(shè)計引物，結(jié)果表明，在大米PDL 的特異性基因上設(shè)計的引物效果最好，經(jīng)特異性試驗證實引物的特異性良好。

本研究構(gòu)建了實時熒光SRCA 技術(shù)定量檢測蜂蜜摻偽大米糖漿的方法，靈敏度試驗表明，該方法檢測到大米DNA 的靈敏度為8.45×101fg/μL，人工摻偽樣品檢測試驗表明，該方法可準確檢出蜂蜜中低至1%的大米糖漿成分，建立的線性方程為y=6.618x+7.651（R2=0.993），相比于實時PCR[3]可檢測摻偽比例為2%～5%，SRCA 具有更高的靈敏度，因為SRCA 可擴增DNA 片段長度60～120 bp 或高度裂解的DNA，目前在蜂蜜摻偽植物糖漿檢測方法中很難檢出低于10%的植物糖漿成分。因此，該方法具有更低的定量檢出限。綜上所述，SRCA 技術(shù)可用于蜂蜜摻偽的定量檢測，具有良好的特異性和更高的靈敏度。整套檢測僅需2.5 h，耗時短，為蜂蜜摻偽的快速定量檢測提供了一種新策略。