羅 鈺,劉詠雪,付楊楠,張 晨,*
(1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州350108 2 福州大學(xué)先進制造學(xué)院 福建泉州362251 3 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108)
茶飲料是目前市場上最受歡迎的飲品之一,在我國有悠久的歷史[1]。當前茶葉品質(zhì)的研究主要集中在茶風(fēng)味物質(zhì)的組成和氧化上[2-3],然而這些風(fēng)味物質(zhì)及其氧化衍生物從葉組織溶出的過程對茶湯品質(zhì)的影響卻被忽略[4]。該溶出過程受到茶葉細胞壁的阻礙,可能會因其中果膠的作用而影響各種物質(zhì)的溶出速率[5],進而影響茶湯品質(zhì)。因茶湯泡制過程中,風(fēng)味物質(zhì)的變化無法從果膠對其溶出的影響而得出,可通過提取獲得的天然果膠與纖維素膜結(jié)合,模擬茶葉細胞壁結(jié)構(gòu),以分析茶風(fēng)味物質(zhì)溶出過程[6]。因此,建立新型的果膠提取方法,獲得結(jié)構(gòu)相對完整的天然果膠,是研究果膠對茶風(fēng)味物質(zhì)溶出影響的關(guān)鍵。
果膠是一種從高等植物細胞壁中提取獲得的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖[7]。若在提取過程中果膠結(jié)構(gòu)不被破壞,且其性質(zhì)仍被保留,則為天然果膠。當前,果膠的提取方法主要有水熱法、酸法及堿法[8],然而,這些方法均對果膠分子結(jié)構(gòu)有影響,無法用于模擬葉細胞壁。水熱法主要以高溫的方式來增加細胞間質(zhì)中果膠分子在水中的溶解度[9],其果膠提取率較低(30%~40%),且果膠分子容易發(fā)生斷裂[10]。酸法提取是利用稀酸將非水溶性的果膠轉(zhuǎn)變成水溶性的果膠[11],提取率約為70%[12]。酸處理過程中半乳糖醛酸主鏈易發(fā)生斷裂,且果膠分子連接了纖維素片段,凝膠性相對較差[13]。堿法提取是通過將果膠酸中和以提高果膠溶解率,提取率可達90%[14]。此法提取過程中果膠脫酯[15],果膠與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物提高了果膠的流變性[13]。
理論上,天然果膠的提取可通過使用碳水化合物酶降解細胞壁成分中的纖維素和半纖維素[16-17],以促進果膠的釋放。然而,目前可行的碳水化合物酶提取方案尚未清晰。其原因:一是植物細胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜,酶分子不易進入且需要使用多種靶向的碳水化合物酶進行復(fù)合降解,果膠提取效率較低。二是市售纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合酶可能會降解果膠,對果膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。為了獲得天然果膠,本研究以綠茶為材料,分析4 種商業(yè)酶(S22178 酶、半纖維素酶、Viscozyme?L 和FoodPro?CBL)對果膠提取、結(jié)構(gòu)和功能的影響。測定提取液中半乳糖醛酸含量,分析提取率。采用凝膠色譜分析其分子質(zhì)量分布。以標準果膠(商業(yè)柑橘果膠和阿拉伯半乳聚糖)為模型,檢測4 種酶對果膠HG 主鏈結(jié)構(gòu)和RG-I 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的降解作用。采用紅外吸收光譜分析果膠鏈中酯化羧基含量的變化。通過乙醇沉降對果膠提取物進行純化,分析純化樣的外觀,以及化學(xué)成分、分子質(zhì)量分布、粒徑與黏度的關(guān)系。
綠茶葉(Green tea leaf,GTL)由中國福建省工泰公司提供。Viscozyme?L(主要含有纖維素酶,酶活力120 U/mL),美國Sigma 公司;FoodPro?CBL(主要含有纖維素酶,酶活力1 500 U/g),中國上海杜邦公司;S22178 酶(主要含有纖維素酶,酶活力10 000 U/g),上海玉博生物科技有限公司;半纖維素酶(酶活力為20 000 U/g)、阿拉伯半乳聚糖(RG-I 結(jié)構(gòu)),上海源葉生物科技有限公司;商業(yè)柑橘果膠(HG 結(jié)構(gòu)),甲氧基化度(76.68±0.35)%,德國CNW 試劑公司。所有化學(xué)品均為分析純級。
Nicolet iS50 FT-IR 傅里葉紅外光譜儀,武漢德盟科技有限公司;Thermo Fisher Scientific 3000高效液相色譜儀(配有示差折光檢測器),中國賽默飛世爾科技有限公司;OMNI 粒徑分析儀,美國Brookhaven 儀器公司;MCR302 安東帕旋轉(zhuǎn)流變儀,上海安東帕商貿(mào)有限公司。
1.3.1 果膠酶提取方案 將綠茶葉研磨成粉末,分別稱取200 mg 綠茶粉,與4 mL 含不同酶的0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)進行充分混勻后,于恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)3 h。酶的添加量是:1)S22178 酶50,200,250,500,700 U;2)半纖維素酶4.5,45,90,135,300,600 U;3)FoodPro?CBL 90,180,713,1 000,1 420 U;4)Viscozyme?L 0.24,0.6,1.8,3,6 U。將反應(yīng)后的樣品離心(4 000×g,20 min),收集上清液,測定半乳糖醛酸含量。
式中,A1——上清液中半乳糖醛酸含量(mg);A2——200 mg 綠茶粉中半乳糖醛酸含量(mg)。
1.3.2 酶對果膠HG 主鏈和RG-I 側(cè)鏈的影響 以商業(yè)柑橘果膠和阿拉伯半乳聚糖分別作為果膠HG 主鏈結(jié)構(gòu)和RG-I 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的標準模型。分別將100 mg 商業(yè)柑橘果膠和阿拉伯半乳聚糖與2 mL 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.45)混合,在該混合液中加入不同量的酶,充分混勻后在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)3 h。酶的添加量是:1)600 U S22178 酶;2)1 200 U FoodPro?CBL;3)0.25 U Viscozyme?L;4)500 U 半纖維素酶。將反應(yīng)后的樣品離心(4 000×g,20 min),收集上清液后凍干,于干燥皿中保存,待用。
1.3.3 乙醇沉降純化酶果膠提取物 根據(jù)1.3.1節(jié)提取方案,將10 g 綠茶粉分別與含10 000 U S22178 酶、4 500 U FoodPro?CBL、15 U Viscozyme?L 或4 500 U 半纖維素酶的緩沖液混勻。在恒溫振蕩器中30 ℃反應(yīng)3 h 后,離心(4 000×g,20 min),收集上清液。加入2 倍體積的無水乙醇,沉淀,離心(4 000×g,15 min),收集沉淀物。加入1倍體積的去離子水,重復(fù)乙醇沉淀步驟2 次,使用去離子水充分溶解果膠沉淀。將果膠純化液凍干后置于干燥皿中拍照,記錄樣品的外觀。
1.4.1 半乳糖醛酸含量的測定 參考咔唑比色法測定溶液中半乳糖醛酸含量[18]。顯色反應(yīng)后,測定樣品在530 nm 波長處的吸光值,并以0~200 mg/L的半乳糖醛酸為參照,計算半乳糖醛酸含量。若待測樣品為固體,則采用酸降解法進行半乳糖醛酸含量的測定。將25 mg 綠茶粉溶解于0.5 mL 64%硫酸中,靜置30 min 后加入5.5 mL 蒸餾水,將混合溶液置于80 ℃恒溫振蕩器中加熱60 min,離心獲得上清液,測定其半乳糖醛酸含量。
1.4.2 傅里葉紅外光譜分析 果膠樣品的特征吸收峰采用傅里葉紅外光譜儀測定[19]。將1 mg 果膠樣品和200 mg KBr 充分混合后,用瑪瑙研缽和研杵均化混合物并壓成薄片。在400~4 000 cm-1波數(shù)范圍對果膠樣品進行掃描,記錄光譜圖。采用Sun 等[20]和Liu 等[21]的方法,建立DE 值與A1742/(A1742+A1642)值之間的線性回歸方程:Y=87.609X+25.768 來計算果膠的酯化度。式中,A1742——色譜圖中1 742 cm-1處的峰面積;A1642——色譜圖中1 642 cm-1處的峰面積。
1.4.3 分子質(zhì)量分布的測定 果膠樣品的分子質(zhì)量分布采用高效液相色譜儀測定[22]。制備質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的果膠溶液,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾,備用。使用賽默飛SEC 300 凝膠色譜柱,示差折光檢測器對樣品進行分析。選擇流速0.25 mL/min,進樣體積20 μL 和含有0.1 mol/L NaCl 的乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH 4.5)為流動相,在25 ℃下檢測。
1.4.4 蛋白質(zhì)含量的測定 以0~100 mg/L 硝酸鉀溶液制作標準曲線,用總有機碳分析儀(TOC)測定果膠樣品中總氮質(zhì)量濃度(g/L)[23],采用轉(zhuǎn)換因子5.4 來計算蛋白質(zhì)濃度[14]。
1.4.5 中性糖含量的測定 果膠樣品(20 mg)經(jīng)4 mL 4 mol/L 三氟乙酸(120 ℃,4 h)水解后,加入0.5 mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(70 ℃,30 min)進行衍生化。衍生化后樣品的中性糖含量采用高效液相色譜儀測定[13]。用于分析的柱子為Thermo C18 柱(4.6 mm×250 mm,孔徑5 μm),洗脫液為0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7)∶乙腈=82∶18(V/V)。設(shè)置UV 檢測器波長為245 nm,流速1.0 mL/min,進樣體積10 μL,于25 ℃檢測。
分別配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL L-(+)-鼠李糖、L-(+)-阿拉伯糖、D-(+)-木糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)-半乳糖(97%)、D-(+)葡萄糖(99.5%)溶液為標準溶液。RG-I 型果膠由重復(fù)的半乳糖醛酸和鼠李糖二糖骨架和阿拉伯聚糖、半乳聚糖和/或阿拉伯半乳聚糖的側(cè)鏈組成[24]。由于阿拉伯糖和半乳糖主要存在于RG-I 型果膠中,因此阿拉伯糖和半乳糖含量被用來代表RG-I 果膠[25]。RG-II 型果膠具有HG 型果膠的骨架,該骨架具有復(fù)雜的側(cè)鏈,其包含連接至半乳糖醛酸的鼠李糖[26]。由于RG-II 型果膠中幾乎不含半乳糖和阿拉伯糖,因此半乳糖和阿拉伯糖含量與鼠李糖含量的比率變化可用來表示RG-II 型果膠提取率的變化。
1.4.6 多酚含量的測定 果膠樣品的多酚含量參考酒石酸亞鐵法測定[27]。將250 μL 果膠溶液與315 μL 酒石酸亞鐵溶液充分混合,加入1 mL pH 7.5 的磷酸鹽緩沖液,于室溫反應(yīng)5 min。測定樣品在540 nm 波長處的吸光值,以0~0.5 mg/mL 茶多酚繪制標準曲線,計算果膠樣品中的多酚含量。
1.4.7 黏度的測定 果膠樣品的黏度采用安東帕旋轉(zhuǎn)流變儀測定[28]。將果膠樣品與去離子水充分混合,25 ℃下測定混合溶液(50 g/L)在剪切速率1~100 rad/s 范圍的黏度。記η1為剪切速率在1 s-1時的黏度。
1.4.8 粒徑的測定 基于樣品的多分散性和基線指數(shù)介于0.1~0.3 和5~10 之間,選擇配制果膠質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液。采用粒徑分析儀(OMNI,Brookhaven,USA)測定其粒徑分布[13]。
采用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。若無特別說明,每個樣品重復(fù)測定3次,其結(jié)果表示為“平均值±標準差(xˉ ±s)”。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's法多重比較分析各組的差異顯著性,顯著性水平為P<0.05。
綠茶粉分別經(jīng)4 種酶處理后獲得上清液,通過測定其半乳糖醛酸含量估算果膠提取率,結(jié)果如 圖1 所 示。采 用S22178 酶、FoodPro?CBL、Viscozyme?L 和半纖維素酶都能高效提取果膠,提取率均可達80%。4 種酶中,Viscozyme?L 輔助果膠提取的效果最佳,每mg 茶粉僅用0.003 U 酶即可獲得97%的果膠,而其它酶達到這一條件需要的酶添加量均超過3 U/mg。這可能是由于Viscozyme?L 除了含有纖維素酶活力外,還含有阿拉伯聚糖酶和木聚糖酶等多種酶活力,可有效提高葉細胞壁的降解效率[14]。
圖1 不同酶添加量下果膠的提取率Fig.1 Extraction rate of pectin under different enzyme addition amounts
以商業(yè)柑橘果膠和阿拉伯半乳聚糖分別作為果膠HG 主鏈和RG-I 側(cè)鏈的標準模型,通過分子排阻色譜分析4 種酶對果膠HG 主鏈和RG-I 側(cè)鏈的影響,如圖2 所示。圖2a 顯示,商業(yè)柑橘果膠僅有1 個組分,在SEC 試驗中的保留時間約23 min。Viscozyme?L 處理后的商業(yè)柑橘果膠在色譜圖中23 min 處的信號峰基本消失,可見Viscozyme?L 可完全降解果膠HG 主鏈。S22178 酶處理后的商業(yè)柑橘果膠在色譜圖中23 min 處的信號峰變小,發(fā)生拖峰現(xiàn)象,表明S22178 酶對果膠HG 主鏈產(chǎn)生部分降解。相比之下,經(jīng)半纖維素酶和FoodPro?CBL 處理的商業(yè)柑橘果膠在色譜圖23 min 處的信號峰基本沒有變化,表明這兩種酶對果膠HG 主鏈沒有影響。圖2b 顯示,阿拉伯半乳聚糖只有1 個組分,在色譜圖中的保留時間約38 min。經(jīng)4 種酶作用后的RG-I 側(cè)鏈在SEC 圖譜中峰型相似,表明4 種酶對果膠的RG-I 側(cè)鏈沒有影響。
圖2 經(jīng)不同酶處理前、后商業(yè)柑橘果膠(a)和阿拉伯聚糖(b)的分子質(zhì)量分布Fig.2 The molecular weight distribution of commercial citrus pectin(a)and arabinoxylan(b)before and after treatment with different enzyme concentrations
可見,半纖維酶或FoodPro?CBL 處理獲得的果膠結(jié)構(gòu)與天然果膠結(jié)構(gòu)相似,而其它兩種酶均破壞果膠結(jié)構(gòu)。
為了進一步探究4 種酶對綠茶果膠酯化度的影響,測定果膠提取液的紅外光譜圖,結(jié)果如圖3所示。果膠酯化度通過1 742 cm-1處的峰面積與1 742 cm-1和1 642 cm-1處的峰面積之和的比值來計算。S22178 酶處理樣、FoodPro?CBL 處理樣和半纖維素酶處理樣的酯化度相近,分別為40%,41%和44%,Viscozyme?L 的最低為31%??梢姡琒22178 酶、FoodPro?CBL 和半纖維素酶對果膠的酯化度影響較小,Viscozyme?L 具有一定的脫酯作用。
圖3 4 種酶提取的綠茶果膠的傅里葉紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy of green tea pectin extracted by four enzymes
2.4.1 外觀 將綠茶果膠提取物用乙醇沉降進行純化,其凍干樣品的外觀如圖4 所示。由于Viscozyme?L 破壞了果膠分子結(jié)構(gòu)(見圖2a),因此果膠樣品中小分子物質(zhì)居多,凍干品呈粉末狀。其它3 種酶對HG 果膠僅存在部分降解或無明顯降解作用,使獲得的果膠樣品中存在更多的大分子物質(zhì)呈云片狀。與未經(jīng)酶處理和半纖維素酶處理相比,S22178 酶、FoodPro?CBL 和Viscozyme?L純化樣顏色較淺,推測葉綠素與纖維素之間發(fā)生了結(jié)合[29]。葉綠素可通過纖維素降解,溶于乙醇溶液后去除。
2.4.2 黏度 純化后果膠樣品的黏度采用安東帕旋轉(zhuǎn)流變儀檢測,結(jié)果如圖5 所示。4 種酶法純化樣的黏度隨角頻率的增加呈現(xiàn)剪切稀化的現(xiàn)象。比較剪切速率為1 時,各果膠樣品的黏度(η1)差異,F(xiàn)oodPro?CBL 純化樣的黏度最大(η1=1 227 mPa·s),S22178 酶純化樣的黏度次之(η1=862 mPa·s),而半纖維素酶純化樣的黏度較低(η1=154 mPa·s),Viscozyme?L 黏度基本為0。4 種酶處理的純化樣黏度存在較大差異,這或許與純化樣的分子質(zhì)量分布、化學(xué)組成及其粒徑分布相關(guān)。
2.4.3 化學(xué)組成 測定了純化后綠茶果膠樣品的化學(xué)組成(包括半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)、多酚和各種單糖含量),結(jié)果見表1。以半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖含量表示各種類型果膠的總量,Viscozyme?L 純化樣中果膠含量最高,其次為S22178 酶純化樣和半纖維素酶純化樣,而Food-Pro?CBL 純化樣和水純化樣中果膠含量相對較少。水純化樣和S22178 酶純化樣中GA/Rha 的值較大,約為20??梢娖渲饕獮楣z的HG 結(jié)構(gòu)。Viscozyme?L 純化樣、半纖維素酶純化樣和FoodPro?CBL 純 化樣的GA/Rha 和(Ara+Gal)/Rha 值較小,表明其果膠提取物中含有更多其它的果膠結(jié)構(gòu)。在保證HG 果膠提取率的情況下,獲得更多RG-I 和RG-II 結(jié)構(gòu)的果膠,以更接近天然果膠的狀態(tài)。果膠RG-II 結(jié)構(gòu)在細胞壁中的空間位置更靠近內(nèi)側(cè)的細胞膜,而RG-I 充斥于整個細胞壁[30],相對而言RG-II 結(jié)構(gòu)的提取難度較大??梢?,純化樣中更多RG-II 側(cè)鏈的存在表明其果膠提取物結(jié)構(gòu)更接近細胞壁中的天然果膠。果膠的溶出與纖維素和半纖維素的降解相關(guān)[31],而各樣品中葡萄糖和木糖的含量變化并未表明其相關(guān)性。這一現(xiàn)象可能是由于纖維素和半纖維素在不同酶處理條件下被降解的程度不同,從而導(dǎo)致它們在乙醇沉降過程中的損失不同。水純化樣、S22178 酶純化樣、FoodPro?CBL 純化樣和半纖維素酶純化樣中蛋白質(zhì)含量相差不大,而Viscozyme?L 純化樣中的蛋白質(zhì)含量相對較少。這可能是Viscozyme?L 酶還具有一定的蛋白酶活性,可降解蛋白質(zhì),導(dǎo)致它們在乙醇沉降過程中的損失較大。
理論上果膠HG 主鏈含量與黏度呈正相關(guān),然而S22178 酶純化樣的黏度低于FoodPro?CBL純化樣的黏度,可見果膠的非HG 型主鏈結(jié)構(gòu)也能提供部分的黏性特質(zhì)[2,29]。
2.4.4 分子質(zhì)量分布與粒徑分布 純化后果膠樣品的分子質(zhì)量分布用高效液相色譜儀測定,粒徑分布用粒徑分析儀檢測,結(jié)果如圖6 所示。圖6a表明,S22178 酶純化樣和FoodPro?CBL 純化樣在SEC 圖譜中的分子質(zhì)量分布與水處理的純化樣的分子質(zhì)量分布相似,在20~25 min 內(nèi)出現(xiàn)較多的大分子物質(zhì)。Viscozyme?L 純化樣和半纖維素酶純化樣中含有的大分子物質(zhì)較少,小分子物質(zhì)較多。由于半纖維素酶可降解非果膠和纖維素等多糖類物質(zhì),這些物質(zhì)可能在乙醇沉降的過程中沒有被去除[32],導(dǎo)致其在35~44 min 內(nèi)的小分子峰明顯增強。Viscozyme?L 可徹底破壞HG 果膠主鏈,因此其果膠樣在色譜圖中20~25 min 內(nèi)的大分子峰基本消失,在35~44 min 內(nèi)小分子峰的信號增強。相比之下,F(xiàn)oodPro?CBL 純化樣只在20~25 min 內(nèi)出現(xiàn)1 個主峰,說明此果膠樣品的分子質(zhì)量較大,且組分間的分子質(zhì)量差異較小。可見,分子質(zhì)量大且分布較為集中的果膠樣品具有更好的黏性[33](見圖5)。
純化后果膠樣品的粒徑用粒度儀測定,結(jié)果如圖6b 所示。半纖維酶純化樣的平均粒徑最大,S22178 酶純化樣和FoodPro?CBL 純化樣平均粒徑接近,而Viscozyme?L 純化樣的平均粒徑最小。相比于其它純化樣,F(xiàn)oodPro?CBL 純化樣在光散圖中只有1 個峰呈正態(tài)分布,出現(xiàn)在100~1 000 nm 范圍,表明樣品的組分間顆粒大小相近。其它3 種酶純化樣均呈現(xiàn)2 個不同的信號峰,其中主峰出現(xiàn)在200~1 000 nm 范圍,次峰出現(xiàn)在40~200 nm 范圍。Viscozyme?L 純化樣粒徑較小,主要出現(xiàn)在200 nm 附近。由于半纖維素酶純化樣中的纖維素未降解且與果膠結(jié)合形成較大的顆粒,因此即使半纖維素酶純化樣和FoodPro?CBL純化樣成分接近,其黏度仍存在較大差異(見圖5)[14]。
可見,由于FoodPro?CBL 純化樣的結(jié)構(gòu)與天然果膠相似且具有較好的黏性,因此將其浸泡于纖維素膜中,可制作出與葉細胞壁結(jié)構(gòu)相近的體外模型[6,34]。此外,還可將其作為增稠劑應(yīng)用于食品行業(yè)。
S22178 酶、半 纖維素 酶、FoodPro?CBL 和Viscozyme?L 都能高效提取果膠,提取率均能達80%。S22178 酶和Viscozyme?L 對果膠HG 主鏈有破壞,且其幾乎完全被Viscozyme?L 降解。半纖維素酶和FoodPro?CBL 對果膠HG 主鏈和RG-I 側(cè)鏈均無顯著影響。經(jīng)純化后,F(xiàn)oodPro?CBL 純化樣的黏度最大(η1=1 227 mPa·s),半纖維素酶純化樣的黏度較低(η1=154 mPa·s),Viscozyme?L 黏度基本為0。FoodPro?CBL 純化樣中果膠含量為48%(HG 主鏈43%,RG-I 側(cè)鏈5%),且相比于半纖維素酶純化樣,F(xiàn)oodPro?CBL純化樣中果膠結(jié)構(gòu)更豐富,組分間顆粒大小相近,呈現(xiàn)典型的剪切稀化現(xiàn)象,最接近天然果膠的狀態(tài),可用于模擬茶葉細胞壁,研究果膠對風(fēng)味物質(zhì)溶出的影響。