釀酒酵母和異常漢遜酵母混合發(fā)酵黃酒工藝研究

鄭超群，陳 晨，蔣予箭，張 蕾，謝廣發(fā)

（1 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018 2 浙江樹(shù)人學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院 浙江省污染暴露與健康干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310015）

黃酒是中國(guó)最古老的釀造酒，與葡萄酒、啤酒共同享有世界三大古酒的美譽(yù)[1]。黃酒是以稻米、黍米、小米等為主要原料，利用麥曲和部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀造而成的發(fā)酵酒[2-4]。黃酒的酒精度低，一般含量為14% vol～20% vol，20 種氨基酸成分齊全，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，符合新時(shí)代消費(fèi)者對(duì)食品安全、健康、營(yíng)養(yǎng)的需求。然而，近年來(lái)黃酒的發(fā)展不盡如人意。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)白酒的人均消費(fèi)量為9 L 左右，啤酒的人均消費(fèi)量為38 L 左右，而黃酒的人均消費(fèi)量不足2 L[5]，黃酒市場(chǎng)仍有增長(zhǎng)的空間，黃酒生產(chǎn)工藝與裝備的更新、新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的工作還任重道遠(yuǎn)。

釀酒酵母（S.cerevisiae）是黃酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種，其特點(diǎn)是發(fā)酵速度快，酒精轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵過(guò)程易于控制，對(duì)其它雜菌的抑制作用強(qiáng)，然而存在香氣成分不豐富等缺陷[6]。異常漢遜酵母（H.anomala）是一類(lèi)與酒精發(fā)酵相關(guān)的天然非釀酒酵母，其代謝能力差，產(chǎn)酒精能力較低，通常不能獨(dú)自完成酒精發(fā)酵[7]。研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母能夠通過(guò)自身代謝活動(dòng)生成醇或酯，或者通過(guò)胞外酶的釋放產(chǎn)生包括乙酯類(lèi)、高級(jí)醇、甘油、揮發(fā)性酚類(lèi)、芳香酮等一系列對(duì)黃酒質(zhì)量有益的香氣物質(zhì)，增加酒類(lèi)香氣的復(fù)雜度和濃郁度[8-10]。Rojas 等[11]發(fā)現(xiàn)，有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、異常畢赤酵母（Pichia.anomala）與釀酒酵母的混合發(fā)酵獲得的乙酸酯類(lèi)化合物比單一釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)品有明顯提高。Moreira 等[12]提出，將葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母進(jìn)行混合模擬自然發(fā)酵，結(jié)果酯類(lèi)含量增加，提高了香氣復(fù)雜度。李婷[13]從川南白酒窖池中分離出1 株高產(chǎn)酯的非釀酒酵母，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）在40 ℃、pH 5 時(shí)，最大酶活力可達(dá)12.68 U/g，在提前0～96 h 接種處理的混菌發(fā)酵葡萄酒中檢出35 種香氣物質(zhì)，總含量達(dá)70～194 mg/L。夏鴻川等[14]通過(guò)釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵處理提高了葡萄酒甘油產(chǎn)量0.38～1.11 g/L，同時(shí)降低了酒精含量0.33% vol～1.9%vol。Anfang 等[15]發(fā)現(xiàn)，克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）與釀酒酵母按照1 ∶1 接種混合發(fā)酵時(shí)，葡萄酒中硫醇類(lèi)香氣物質(zhì)的含量有所提高；按9∶1 進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)，葡萄酒中乙酸-3-巰基己醇的濃度增加。

本研究以釀酒酵母和異常漢遜酵母為發(fā)酵菌種，在比較2 種酵母的發(fā)酵特性以及對(duì)黃酒品質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)行混菌發(fā)酵試驗(yàn)?；炀l(fā)酵試驗(yàn)包括同時(shí)混合發(fā)酵（CH）和順序混合發(fā)酵（SH）這兩種發(fā)酵途徑。在發(fā)酵過(guò)程中，測(cè)定酵母菌數(shù)、酒精度、還原糖、揮發(fā)酯等理化指標(biāo)。在發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)混菌發(fā)酵黃酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定。對(duì)篩選出的混合發(fā)酵路線(xiàn)，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與發(fā)酵工藝條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：北純糯米；糖化酶（酶活力1×105U/g，食品級(jí)）、液化酶（酶活力2×104U/g，食品級(jí)），河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；釀酒酵母，安琪黃酒專(zhuān)用活性干酵母；異常漢遜酵母1298，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；麥曲，紹興古越龍山黃酒工程技術(shù)研究中心有限公司。

葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、亞甲基藍(lán)、鄰苯二甲酸氫鉀、無(wú)水乙醇、酚酞、甲基紅均為分析純級(jí)；鹽酸、硫酸、乳酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母增殖培養(yǎng)基（YPD）、孟加拉紅培養(yǎng)基，杭州微生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；XSP-4C 顯微鏡，東莞市永先電子儀器有限公司；BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；NSKY-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；3K30 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，SIGAM Laboratory Centrifuges；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)，Millipore。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵試驗(yàn)流程 見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵試驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of fermentation experiment

1.3.2 糖化液的制備 將糯米打碎成糯米粉，粉碎后過(guò)60 目篩，備用，稱(chēng)取糯米粉300 g，蒸餾水750 g（料水比為1∶2.5）加入到1 L 錐形瓶，混合均勻后，加入2 g 液化酶，在75 ℃水浴條件下，液化1 h，調(diào)節(jié)pH 4.5～4.8，加入1.5 g 糖化酶和30 g 麥曲（10%添加量），在65 ℃水浴鍋中糖化3 h，紗布過(guò)濾后，取上清液，正常情況糖度能達(dá)到20°Bx～25°Bx，95 ℃滅菌20 min，備用[16-17]。

1.3.3 酵母的擴(kuò)培與計(jì)數(shù)

1.3.3.1 酯香酵母制備 挑取異常漢遜酵母1298斜面菌種，轉(zhuǎn)入YPD 液體培養(yǎng)基，于28 ℃，180 r/min 條件下培養(yǎng)18～20 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，保證酯香酵母的工作濃度達(dá)到1×107個(gè)/mL 以上，低溫離心10 min 后（4 ℃，4 000 r/min）收集酵母菌體，經(jīng)無(wú)菌水洗滌后，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)，在主發(fā)酵階段前，按接種比例接入純種酯香酵母發(fā)酵劑[18]。

1.3.3.2 釀酒酵母制備 稱(chēng)取10 g 干酵母，加入150 mL 2%葡萄糖溶液，38 ℃水浴活化20 min，低溫離心（4 ℃，4 000 r/min）10 min 后，收集菌體，經(jīng)無(wú)菌水洗滌，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)，按比例接種到糖化酵液中[19]。

發(fā)酵過(guò)程中采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基[20-21]。

1.3.4 發(fā)酵條件 初始糖度18°Bx，溫度28 ℃，發(fā)酵20 d（主發(fā)酵5 d+后發(fā)酵15 d），發(fā)酵體量150 mL，其中釀酒酵母和異常漢遜酵母的的接種量都為1×107個(gè)/mL[22-23]。

1.3.5 發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)組：接種釀酒酵母S.cere；接種異常漢遜酵母Han；同時(shí)接種混合發(fā)酵CH；順序接種混合發(fā)酵（接種漢遜酵母48 h 后接種釀酒酵母）SH[24]。

其中，釀酒酵母和異常漢遜酵母的接種量都為1×107個(gè)/mL，同時(shí)接種是指同時(shí)接入釀酒酵母和異常漢遜酵母同時(shí)進(jìn)行酒精發(fā)酵，順序接種是指先接入異常漢遜酵母，48 h 后再接入釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。

1.3.6 黃酒取樣檢測(cè) 主發(fā)酵第1，2，4 天，后發(fā)酵第7，12，16，20 天，分別取樣125 mL 濾紙過(guò)濾，4 ℃冰箱保存，備用。測(cè)定還原糖、酒精度、總酸、揮發(fā)酯、酵母菌數(shù)等理化指標(biāo)。

1.3.7 理化指標(biāo)的測(cè)定 酒精度、總酸的測(cè)定參照GB/T 13662-2018[25]；還原糖的測(cè)定參照GB 5009.7-2016[26]中的亞鐵氰化鉀滴定法；揮發(fā)酯的測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17946[27]中的回流皂化法。酵母菌數(shù)的測(cè)定：血球計(jì)數(shù)法[28]、平板計(jì)數(shù)法參考GB/T 4789.2-2016[29]。

1.4 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照工藝路線(xiàn)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并對(duì)以下單因素進(jìn)行相關(guān)參數(shù)替換。初始還原糖含量：250，220，190，160，130 g/L，可使用葡萄糖調(diào)節(jié)；初始pH 值：3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，參考文獻(xiàn)[30]使用檸檬酸、小蘇打調(diào)節(jié)；主發(fā)酵溫度：26，28，30，32，34 ℃；接種量（酯香酵母∶釀酒酵母為1 ∶1）：0.5×107，1.0×107，1.5×107，2.0×107，2.5×107個(gè)/mL。每個(gè)發(fā)酵組做3 次平行，取平均值。以發(fā)酵結(jié)束后的揮發(fā)酯、酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)黃酒順序發(fā)酵揮發(fā)酯含量影響較大的3 個(gè)因素（包括初始pH、酵母接種量、主發(fā)酵溫度）根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3 因素3 水平1 響應(yīng)值響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計(jì)。

選定初始pH、酵母接種量、主發(fā)酵溫度范圍分別為pH 3.5～4.9，0.5～1.5×107個(gè)/mL，30～34 ℃，響應(yīng)面的分析因素及水平設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.5 感官評(píng)定

9 名感官評(píng)定人員先經(jīng)過(guò)3 輪品評(píng)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)。使用計(jì)分評(píng)價(jià)法對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以篩選出感官品質(zhì)最優(yōu)的黃酒樣品。本次感官評(píng)價(jià)參考黃酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 13662-2018）[25]，制定發(fā)酵酒的感官評(píng)分表（見(jiàn)表2），滿(mǎn)分是100 分，其中色澤10 分，香氣25 分，口味50 分，風(fēng)格15 分。根據(jù)品評(píng)酒樣的色澤、香氣、味道、風(fēng)格的優(yōu)劣差異的評(píng)語(yǔ)情況，依規(guī)定項(xiàng)目的分?jǐn)?shù)進(jìn)行打分。

表2 黃酒感官評(píng)分表Table 2 Yellow rice wine sensory score

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel，Origin 9.0，Design Expert 8.0.6 軟件處理、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株酵母發(fā)酵特性比較

2.1.1 兩株酵母單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程理化指標(biāo)變化 釀酒酵母和異常漢遜酵母發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化如圖2～4 所示，對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵結(jié)束后各理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indicators after fermentation

圖2 酵母單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程還原糖（a）和酒精度（b）的變化Fig.2 Changes in reducing sugar（a）and alcohol content（b）during yeast fermentation alone

圖2 和圖3 分別為釀酒酵母和異常漢遜酵母發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化，包括還原糖、酒精度、總酸、揮發(fā)酯，圖4 為酵母數(shù)的變化。由圖2 可以看出，釀酒酵母發(fā)酵的還原糖含量急劇下降，僅2 d 下降至7.0 g/L，同時(shí)酒精度含量達(dá)到9.3% vol，第7 天酒精度達(dá)到最高值10.7% vol，之后緩慢下降。異常漢遜酵母的還原糖含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈逐步下降的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后，還原糖含量與釀酒酵母差異不大，說(shuō)明異常漢遜酵母的還原糖代謝能力不低于釀酒酵母。同時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中異常漢遜酵母的酒精度含量始終低于釀酒酵母，說(shuō)明異常漢遜酵母的酒精轉(zhuǎn)化能力較差。由圖3 可知，在發(fā)酵過(guò)程中，異常漢遜酵母的產(chǎn)酸能力明顯強(qiáng)于釀酒酵母，在發(fā)酵第16 天達(dá)到最大值5.6 g/L，之后出現(xiàn)下降，推測(cè)發(fā)酵后期有機(jī)酸會(huì)與醇類(lèi)物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，生成乙酯類(lèi)化合物，導(dǎo)致總酸含量下降，同時(shí)，可以看出異常漢遜酵母的揮發(fā)酯含量一直在增加，第16 天達(dá)到最大值2.67 g/L，而釀酒酵母的揮發(fā)酯含量增加緩慢，變化不大，發(fā)酵結(jié)束后，釀酒酵母和異常漢遜酵母的揮發(fā)酯含量分別為0.53 g/L 和2.41 g/L，異常漢遜酵母的揮發(fā)酯含量是釀酒酵母的4.5 倍。說(shuō)明異常漢遜酵母的產(chǎn)酯能力明顯強(qiáng)于釀酒酵母的產(chǎn)酯能力。由圖4可以看出，釀酒酵母前期的增殖速度較快，第2 天達(dá)到最大值1.61×108CFU/mL，之后呈下降趨勢(shì)；異常漢遜酵母在發(fā)酵前4 天增殖速度最快，在第12 天達(dá)到最大值1.15×108CFU/mL 時(shí)進(jìn)入平衡期，后期糖類(lèi)等碳源物質(zhì)逐漸消耗殆盡，酵母菌缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)入衰亡期。

圖3 酵母單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程總酸（a）和揮發(fā)酯（b）的變化Fig.3 Changes in total acid（a）and volatile esters（b）during yeast fermentation alone

從表3 看出，發(fā)酵結(jié)束后，釀酒酵母與異常漢遜酵母發(fā)酵液中的還原糖含量都在10 g/L 以下，說(shuō)明兩者糖代謝都比較徹底。發(fā)酵結(jié)束時(shí)釀酒酵母的酒精度高于異常漢遜酵母，揮發(fā)酯含量低于異常漢遜酵母，顯然釀酒酵母產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，異常漢遜酵母產(chǎn)揮發(fā)酯能力較強(qiáng)。

2.1.2 酵母單獨(dú)發(fā)酵黃酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果 對(duì)不同發(fā)酵方式的黃酒進(jìn)行感官品評(píng)，總分以各項(xiàng)分累計(jì)而得，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同發(fā)酵方式黃酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of yellow rice wine with different fermentation methods

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)兩種酵母菌單獨(dú)發(fā)酵的黃酒樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，從色澤、口味、香氣、風(fēng)格4 個(gè)方面對(duì)黃酒樣品進(jìn)行打分，由表4 可以看出，兩種酵母單獨(dú)發(fā)酵黃酒的差異主要體現(xiàn)在色澤和香氣成分上，釀酒酵母發(fā)酵的黃酒樣品顏色較淡，而異常漢遜酵母發(fā)酵的黃酒樣品呈現(xiàn)出色澤較好的琥珀色。另外，異常漢遜酵母由于產(chǎn)揮發(fā)酯的特性，所以其發(fā)酵的黃酒樣品香氣成分濃郁，強(qiáng)烈。從口味上來(lái)說(shuō)，釀酒酵母的酒味明顯強(qiáng)于異常漢遜酵母。綜合來(lái)看，異常漢遜酵母發(fā)酵的黃酒樣品得分高于釀酒酵母發(fā)酵的黃酒樣品。

2.2 混合酵母發(fā)酵路線(xiàn)的篩選

2.2.1 混合酵母發(fā)酵過(guò)程變化

2.2.1.1 酵母混合方式對(duì)酵母生長(zhǎng)量的影響 圖5 可知，釀酒酵母和異常漢遜酵母同時(shí)混合接種發(fā)酵，異常漢遜酵母處于劣勢(shì)地位，4 d 后，平板計(jì)數(shù)中檢測(cè)不出異常漢遜酵母菌，說(shuō)明釀酒酵母對(duì)異常漢遜酵母起到強(qiáng)烈的抑制作用[31]?？梢钥闯?，在順序混合發(fā)酵條件下，前期異常漢遜酵母具有先發(fā)優(yōu)勢(shì)，增殖速度較快，形成菌種優(yōu)勢(shì)，對(duì)釀酒酵母的增殖起一定壓制作用。4 d 后，釀酒酵母逐漸適應(yīng)發(fā)酵條件，增殖數(shù)大于異常漢遜酵母，異常漢遜酵母菌種優(yōu)勢(shì)下降，釀酒酵母占據(jù)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)地位。

圖5 同時(shí)混合靜置（a）和順序混合靜置（b）發(fā)酵期間酵母數(shù)變化Fig.5 Changes in yeast number during fermentation with simultaneous mix-and-stand（a）and sequential mix-and-stand（b）

2.2.1.2 酵母混合方式對(duì)發(fā)酵過(guò)程理化指標(biāo)及產(chǎn)揮發(fā)酯量的影響 從圖6 和圖7 可以看出，在發(fā)酵前2 天，CH（同時(shí)混合發(fā)酵）消耗還原糖的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SH（順序混合發(fā)酵）還原糖的速率，這是因?yàn)榍? 天，釀酒酵母大量生長(zhǎng)繁殖，還原糖等碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量吸收利用，通過(guò)EMP 代謝途徑產(chǎn)生大量酒精。發(fā)酵結(jié)束后，SH 和CH 的還原糖含量均低于10 g/L，說(shuō)明發(fā)酵代謝徹底，還原糖轉(zhuǎn)化率高。發(fā)酵過(guò)程中CH 的酒精度始終高于SH 的酒精度，說(shuō)明釀酒酵母的酒精轉(zhuǎn)化率高，SH 揮發(fā)酯含量顯著高于CH 的揮發(fā)酯含量，這是因?yàn)镃H在發(fā)酵過(guò)程中，異常漢遜酵母競(jìng)爭(zhēng)力太差，導(dǎo)致發(fā)酵中后期，以釀酒酵母為主體發(fā)酵菌種。結(jié)束后，SH 的酒精度（8.1%vol）略低于CH 的酒精度（8.7%vol）。CH 和SH 最終總酸含量分別為3.1 g/L 和4.7 g/L，揮發(fā)酯含量分別為0.56 g/L 和1.59 g/L，SH 揮發(fā)酯含量顯著高于CH 揮發(fā)酯含量。

圖6 不同混合條件黃酒發(fā)酵期間還原糖（a）和酒精度（b）的變化Fig.6 Changes in reducing sugar（a）and alcohol content（b）during fermentation of yellow rice wine with different mixing conditions

圖7 不同混菌條件黃酒發(fā)酵期間總酸（a）和揮發(fā)酯（b）的變化Fig.7 Changes of total acid（a）and volatile ester（b）during fermentation of rice yellow wine under different mixed conditions

2.2.2 酵母混合方式對(duì)黃酒發(fā)酵產(chǎn)品感官的影響發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)黃酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定，從色澤、口味、香氣、風(fēng)格4 個(gè)方面對(duì)黃酒樣品進(jìn)行打分，根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果，由表5 可知，SH 黃酒的綜合感官得分高于CH 黃酒。SH 具有濃郁的酒香味，口味醇和、爽口的特點(diǎn)。CH 黃酒具有酒味不醇厚，香氣不明顯的特點(diǎn)。因此，可以將SH 路線(xiàn)作為黃酒新工藝研究方向，改善黃酒風(fēng)味和口感。

表5 黃酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of yellow rice wine

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 由圖8 可知，隨著初始還原糖含量的增加，酒精度呈逐步上升的趨勢(shì)，而揮發(fā)酯含量在逐步下降，當(dāng)還原糖含量高于220 g/L 時(shí)，揮發(fā)酯含量趨于穩(wěn)定，說(shuō)明還原糖含量偏高時(shí)，不利于酯類(lèi)等物質(zhì)的生成，使得發(fā)酵黃酒揮發(fā)酯含量偏低；而酒精度隨還原糖含量的增加而增加，說(shuō)明發(fā)酵徹底，酒精轉(zhuǎn)化率高。由此，可以選擇一個(gè)合適的含糖量（160 g/L），使發(fā)酵黃酒的酒精度含量不能過(guò)低，并且可以增加揮發(fā)酯的含量，增加香氣成分。

圖8 初始還原糖濃度對(duì)發(fā)酵黃酒酒精度和揮發(fā)酯含量的影響Fig.8 Effect of initial reducing sugar concentration on alcohol content and volatile ester content of fermented yellow rice wine

由圖9 可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在26～34 ℃，溫度對(duì)發(fā)酵黃酒最后的酒精度含量影響不顯著，說(shuō)明在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，釀酒酵母具有較強(qiáng)的發(fā)酵酒精能力。發(fā)酵溫度在32 ℃時(shí)，揮發(fā)酯的含量達(dá)到最高值1.70 g/L。發(fā)酵溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響最后揮發(fā)酯的含量。這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高或者過(guò)低都不利于產(chǎn)酯酵母的生長(zhǎng)繁殖，從而使得最終生成的揮發(fā)酯含量下降。另外，發(fā)酵溫度過(guò)高也不利于香氣成分等小分子物質(zhì)保留，使得最終的揮發(fā)酯含量略低。綜上考慮，發(fā)酵溫度為32 ℃較為合適。

圖9 主發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵黃酒酒精度和揮發(fā)酯含量的影響Fig.9 The effect of main fermentation temperature on the alcohol content and volatile ester content of fermented yellow rice wine

由圖10 可知，當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，酒精度含量最高達(dá)到8.9% vol。pH 值為4.0 時(shí)，揮發(fā)酯的含量最高，為1.64 g/L。pH 值的高、低都會(huì)影響異常漢遜酵母的生長(zhǎng)代謝，使得最后生成的揮發(fā)酯含量有所不同。當(dāng)pH 值含量為4.0 時(shí)，酒精度的含量也大于8.0% vol，達(dá)到低度黃酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的酒精度要求。綜合考慮，選擇初始發(fā)酵pH 值為4.0比較合適。

圖10 初始pH 值對(duì)順序發(fā)酵黃酒酒精度和揮發(fā)酯含量的影響Fig.10 Effect of initial pH value on alcohol content and volatile ester content of sequentially fermented yellow rice wine

由圖11 可知，不同接種量條件對(duì)發(fā)酵黃酒最終酒精度含量的影響并不顯著。揮發(fā)酯含量隨著接種量的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。接種量在1.0×107個(gè)/mL 時(shí)，揮發(fā)酯含量最高，達(dá)到1.72 g/L。當(dāng)初始接種量過(guò)小時(shí)，影響發(fā)酵的啟動(dòng)速度，效率過(guò)低。接種量過(guò)高時(shí)，則由于糖類(lèi)等初始營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，不利于酯類(lèi)物質(zhì)的積累。綜合考慮，選擇接種量為1.0×107個(gè)/mL，比較適合黃酒發(fā)酵。

圖11 接種量對(duì)順序發(fā)酵黃酒酒精度和揮發(fā)酯含量的影響Fig.11 Effect of inoculum size on alcohol content and volatile ester content of sequentially fermented yellow rice wine

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定主發(fā)酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）為考察自變量，以揮發(fā)酯含量為響應(yīng)值，用Design-Expert V8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)BoxBehnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)3 因素3 水平，共17 個(gè)試驗(yàn)組別，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Experimental scheme and results of response surface methodology

通過(guò)軟件分析擬合，以揮發(fā)酯含量為響應(yīng)值，得到順序發(fā)酵黃酒揮發(fā)酯含量對(duì)主發(fā)酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）的二次回歸方程為：揮發(fā)酯=1.69-0.053A-0.026B-0.031C-0.005AB-0.020 AC+0.048BC-0.12A2-0.10B2-0.13C2。

從表7 和表8 可以看出，模型的P 值＜0.0001，說(shuō)明該回歸模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)的P 值為0.1750＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著；決定系數(shù)R=0.9808，表明98.8%的數(shù)據(jù)可以用這個(gè)方程來(lái)解釋?zhuān)恍旁氡葹?7.723＞4；變異系數(shù)為1.67%＜15%；以上分析均說(shuō)明該回歸模型與試驗(yàn)擬合良好，可以用于對(duì)順序發(fā)酵黃酒的揮發(fā)酯含量的預(yù)測(cè)分析。

表7 揮發(fā)酯回歸方差模型分析Table 7 Analysis of volatile ester regression variance model

表8 模型可行性分析Table 8 Model feasibility analysis

本模型因素一次項(xiàng)A（P＜0.01）為極顯著水平，B 和C（0.01＜P＜0.0）為顯著水平；二次項(xiàng)A2、B2、C2均為極顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)BC 為極顯著水平（P＜0.01），AB 和AC 均不顯著（P＞0.05），從主發(fā)酵溫度（A）、pH 值（B）、接種量（C）3 個(gè)影響因素的F 值可知，各單因素對(duì)發(fā)酵黃酒揮發(fā)酯含量的影響大小依次為：A（33.89）＞C（12.01）＞B（8.47）。

2.3.2.1 模型討論與分析 響應(yīng)面是以響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖[32]。通過(guò)用Design expert 8.06 軟件分析，得出主發(fā)酵溫度、pH 值和酵母接種量交互作用對(duì)黃酒揮發(fā)酯含量影響的響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 各因素間交互作用對(duì)黃酒揮發(fā)酯含量影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.12 Response surface and contour map of the interaction between factors on the content of volatile esters in yellow rice wine

響應(yīng)面中的最高點(diǎn)是等高線(xiàn)最小橢圓的圓心，并且圖形的曲面越陡峭，說(shuō)明兩因素之間的交互作用越明顯。相反，圖形的曲面越平緩，說(shuō)明兩因素的交互作用越小。等高線(xiàn)的形狀可以表示因素之間的交互作用的顯著程度，等高線(xiàn)的形狀越接近橢圓形，表明兩因素的交互作用顯著；相反，形狀越接近圓形，表面相互作用不顯著[33]。由圖12可知，曲面圖形開(kāi)口均向下，存在極值。從圖中可以看出，溫度對(duì)于SH 黃酒的揮發(fā)酯含量影響最大，A（發(fā)酵溫度）和B（pH 值）的等高線(xiàn)趨于圓形，交互作用不顯著；而A（發(fā)酵溫度）和C（接種量）與B（pH 值）和C（接種量）的曲面形狀較為陡峭，等高線(xiàn)近于橢圓形，說(shuō)明兩因素間的交互作用顯著。從圖中也可看出，發(fā)酵溫度對(duì)揮發(fā)酯含量的影響大于pH 值、接種量；接種量對(duì)揮發(fā)酯含量的影響大于pH 值。因此，各因素影響揮發(fā)酯含量的順序依次為：發(fā)酵溫度＞接種量＞pH 值，與方差結(jié)果分析一致，說(shuō)明模型的可靠性較高。

2.3.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.0.6 對(duì)方程求解，得到順序發(fā)酵黃酒的最佳工藝：發(fā)酵溫度為31.58 ℃，接種量為0.93×107個(gè)/mL，pH 值為4.18。在此條件下，揮發(fā)酯含量的理論值為1.70 g/L。同時(shí)考慮到實(shí)際操作的可行性，修正最佳工藝的條件為：溫度31.5 ℃，接種量為1.0×107個(gè)/mL，pH 值為4.2。在此條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)3 次，得到發(fā)酵黃酒結(jié)束后的揮發(fā)酯含量為1.66 g/L，準(zhǔn)偏差為0.028，與理論值相差不大，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽?，試?yàn)結(jié)果理想。在此條件下，測(cè)得發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)，酒精度8.0% vol，還原糖含量9.32 g/L，總酸含量4.32 g/L，綜合感官評(píng)價(jià)得分為82.6。

3 結(jié)論

本研究對(duì)2 種酵母發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，并對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的黃酒樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，發(fā)酵結(jié)束后，釀酒酵母和異常漢遜酵母的酒精度分別為9.9% vol 和6.8% vol，揮發(fā)酯含量分別為0.53 g/L 和2.41 g/L，異常漢遜酵母的揮發(fā)酯含量是釀酒酵母含量的4.5 倍，含量顯著高于釀酒酵母，且香氣較為濃郁。對(duì)2 種酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵途徑篩選，顯示順序混合發(fā)酵路線(xiàn)能有效提高黃酒中揮發(fā)酯含量，選擇順序混合發(fā)酵路線(xiàn)較為合適。

通過(guò)使用軟件Design-Expert 8.0.6 對(duì)主發(fā)酵溫度、pH 值、接種量3 個(gè)因素以揮發(fā)酯為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵溫度31.5 ℃，pH 值4.2，接種量1.0×107個(gè)/mL。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到揮發(fā)酯含量為1.66 g/L。同時(shí)測(cè)得理化指標(biāo)：酒精度8.0% vol，還原糖含量9.32 g/L，總酸含量4.32 g/L，符合黃酒國(guó)標(biāo)GB/T 13662-2018 中清爽型干黃酒理化要求，綜合感官評(píng)價(jià)得分為82.6。在保證順利發(fā)酵的情況下，增加了非釀酒酵母的優(yōu)勢(shì)，提高了黃酒中揮發(fā)酯含量，增加更多香氣成分，改善了黃酒的品質(zhì)和風(fēng)味，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。