萌育與凍融處理對芝麻γ-氨基丁酸含量的影響

王洪震，郝征紅，李圓圓，馬夢瑤，張 悅，王明輝

（1 山東農(nóng)業(yè)工程學院食品科學與工程學院 濟南250100 2 中國海洋大學海洋生命學院 山東青島266003 3 濟南大學生物科學與技術(shù)學院 濟南 250022）

γ-氨基丁酸（γ-Amino butyric acid，GABA）是一種以自由態(tài)存在的四碳非蛋白質(zhì)天然氨基酸，是哺乳動物腦、脊髓中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有抗抑郁，改善睡眠，緩解精神壓力，降血壓，防止動脈硬化等功能[1-6]。我國早在2009 年就將GABA 列入新資源食品管理。由于人體自身合成γ-氨基丁酸的能力隨年齡的增長而減弱，通常食物中GABA 含量僅為0.03～2.00 μmol/g dw，因此正常飲食無法滿足機體需求[7]。芝麻（Sesamum indicum L.）是脂麻科脂麻屬植物脂麻的干燥成熟種子，在全球種植范圍廣，芝麻含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)及多種生物活性物質(zhì)，有研究分析了芝麻的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)其谷氨酸含量最高，占種子的4%左右，占總氨基酸的20%以上[8-10]，而谷氨酸是合成GABA 的重要前體物質(zhì)，因此芝麻具有較高的GABA轉(zhuǎn)化富集潛力。

萌育處理被認為是一種成本低廉、方便有效的改善谷物、豆類食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值的方法，可以有效提高谷物、豆類的營養(yǎng)價值和生物活性成分含量[11-14]，如提高GABA 的含量、多酚類物質(zhì)以及新產(chǎn)生維生素C 等[6-7]。近年來，有研究利用糙米、小米、大豆、鷹嘴豆、蠶豆等通過發(fā)芽、發(fā)酵等方式進行GABA 富集[15-20]。目前國內(nèi)外對芝麻中GABA 的研究尚處于起步階段，對于芝麻中GABA含量的影響因素研究尚屬空白。本研究探討萌育與凍融處理條件對芝麻中GABA 含量的影響，利用響應面試驗得到芝麻轉(zhuǎn)化γ-氨基丁酸的最佳處理條件，為利用芝麻開發(fā)富含γ-氨基丁酸的食品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

芝麻：中芝34 號，山東省十里香芝麻制品有限公司提供，山東省無棣縣種植。

γ-氨基丁酸（GABA）標準品，上海源葉生物科技有限公司；苯酚，西隴科學股份有限公司；無水乙醇，天津市富宇精細化工化學有限公司；無水氯化鈣，天津博迪化工股份有限公司；L-谷氨酸鈉，上海藍季科技發(fā)展有限公司；硼砂，天津市恒興化學試劑制造有限公司；硼酸，西隴科學股份有限公司；次氯酸鈉，天津市富宇精細化工化學有限公司。

RXZ-500D 型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，江南儀器有限公司；THZ-98AB 型恒溫振蕩器，上海一恒科技儀器有限公司；TGM-20L 型高速冷凍臺式離心機，湘儀離心機儀器制造有限公司；GZX-9240MBE 型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；PHS-2F 型酸度計，上海雷磁儀器有限公司；V-5600 型分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 萌育條件的單因素實驗設計 將芝麻籽粒用5 倍體積的去離子水或相應培養(yǎng)液在室溫下浸泡0.5 h，浸泡處理的芝麻置于鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取萌育溫度、萌育時間、氯化鈣溶液濃度及谷氨酸鈉溶液濃度4 個因素進行單因素實驗。萌育芝麻從培養(yǎng)箱中取出后，瀝干，勻漿，待測。蒸餾水浸泡芝麻0.5 h 作為對照組。

1）萌育時間的變化 將挑選過的芝麻浸泡0.5 h，在30 ℃下萌育0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 d，每12 h 補充一次蒸餾水，按時取樣，瀝干，勻漿，測定GABA 含量。

2）萌育溫度的變化 芝麻浸泡0.5 h，分別在20，25，30，35，40，45 ℃下萌育2.0 d，每12 h 補充一次蒸餾水，取樣，瀝干，勻漿，測定GABA 含量。

3）氯化鈣溶液濃度的變化 配制濃度為0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 mmol/L 的氯化鈣溶液，將芝麻分別置于不同濃度氯化鈣溶液中浸泡0.5 h，然后30 ℃培養(yǎng)2.0 d，每隔12 h 補充相應濃度氯化鈣溶液，取樣，瀝干，勻漿，測定GABA 含量。

4）谷氨酸鈉溶液質(zhì)量濃度的變化 配制質(zhì)量濃度為0.0，0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 mg/mL 的谷氨酸鈉溶液，將芝麻分別置于不同質(zhì)量濃度谷氨酸納溶液中浸泡0.5 h，然后30 ℃培養(yǎng)2.0 d，每隔12 h 補充相應濃度谷氨酸鈉溶液，取樣后，反復沖洗后瀝干，勻漿，測定GABA 含量。

1.2.2 凍融處理（冷凍-解凍）的單因素及響應面試驗設計 萌育芝麻冷凍處理：選取一定量的芝麻用5 倍體積蒸餾水在室溫下浸泡0.5 h 后，30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.0 d，隨后選取冷凍時間、解凍溫度、解凍時間3 個影響因素進行試驗。

1）冷凍時間的單因素實驗 將培養(yǎng)1.0 d 的芝麻在-18 ℃下分別冷凍12，15，18，21，24 h，之后在30 ℃下解凍12 h，瀝干，勻漿后測定GABA 含量。

2）解凍溫度的單因素實驗 將培養(yǎng)1.0 d 的芝麻在-18 ℃下冷凍18 h，之后分別在20，25，30，35，40 ℃下解凍12 h，瀝干，勻漿后測定GABA 含量。

3）解凍時間的單因素實驗 將培養(yǎng)1.0 d 的芝麻在-18 ℃下冷凍18 h，30 ℃培養(yǎng)箱解凍6，9，12，15，18，21 h，瀝干，勻漿后測定GABA 含量。

4）冷凍-解凍處理響應面試驗設計 在單因素實驗基礎上，基于Box-Behnken 模型，以冷凍時間、解凍溫度、解凍時間作為自變量，GABA 含量為響應值，設計方法見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

1.2.3 γ-氨基丁酸含量的測定 采用Berthelot 比色法測定GABA 含量[21]。樣品用濾紙吸干表面水分，準確稱取2.00 g，研磨至均勻漿狀，定容至50 mL，40 ℃，300 r/min 于恒溫振蕩器中振蕩浸提1 h，13 000 r/min 離心15 min，取出上清液，濾紙過濾，過0.22 μm 濾膜，取0.5 mL 上清液測定。GABA 質(zhì)量濃度C（μg/mL）與吸光值（OD）之間線性回歸方程為y=1.5877x+0.0045（R2=0.9977）。

樣品中水分含量的測定參照GB 5009.3-2016。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 各影響因素試驗指標重復測定3 次，結(jié)果以“xˉ ±s”表示，測定指標以干重表示，用Design Expert 10.0 及DPS 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用Origin 2018 及Microsoft Excel 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌育條件對γ-氨基丁酸含量的影響

2.1.1 萌育時間對GABA 含量的影響 由圖1 可知，對照組GABA 含量為（1.98±0.08）mg/g，隨著萌育時間的延長，GABA 含量逐漸增加，至2.5 d 時，GABA 含量突增至（6.60±0.09）mg/g，與對照組相比增加4.62 mg/g；在萌育0 d（對照組）和3 d 時，芝麻中GABA 含量存在顯著差異（P＜0.05），提高了2.63 倍。這可能是由于萌育初期，芝麻吸收環(huán)境水分，只是物理吸漲過程，因此對GABA 含量影響不大；萌育中期，芝麻中大分子儲能物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖等，通過細胞組織內(nèi)源酶的作用，轉(zhuǎn)化為可溶性小分子物質(zhì)，供給芝麻呼吸、萌育所需營養(yǎng)物質(zhì)，為GABA 的大量轉(zhuǎn)化奠定基礎，故萌育芝麻中的GABA 含量迅速上升；隨著芝麻萌育時間繼續(xù)延長，從2.5 d 至3.0 d，GABA 含量增幅變小，可能是因為GABA 分解速率加快，底物含量降低，GABA 的增幅減緩[22]。控制萌育時間是一種有效增加GABA 含量的處理方法，可以通過此方法轉(zhuǎn)化芝麻中GABA。

圖1 不同萌育時間對GABA 含量的影響Fig.1 Effects of different germination time on GABA content

2.1.2 萌育溫度對GABA 含量的影響 根據(jù)圖2可知，萌育溫度在20～30 ℃范圍內(nèi)，GABA 含量快速增加，30 ℃增加至最大值（3.36±0.09）mg/g，相較對照組提高了1.38 mg/g，隨后開始下降。谷氨酸脫羧酶是GABA 轉(zhuǎn)化過程中最重要的酶，芝麻萌育過程中，由于反應底物谷氨酸的作用，谷氨酸脫羧酶逐漸被激活，萌育溫度過低會抑制谷氨酸脫羧酶的活性，萌育溫度過高會直接破壞酶蛋白空間結(jié)構(gòu)，溫度過高或過低均會抑制谷氨酸脫羧酶催化生成GABA[23]。

圖2 不同萌育溫度對GABA 含量的影響Fig.2 Effects of different germination temperatures on GABA content

2.1.3 氯化鈣溶液濃度對GABA 含量的影響 由圖3 可知，當氯化鈣濃度為0 mmol/L 和1 mmol/L時，萌育芝麻中GABA 含量并沒有顯著性差異（P＞0.05），含量較低，當濃度增加至2 mmol/L 時，芝麻萌育轉(zhuǎn)化GABA 含量達到最大值（4.12±0.11）mg/g，相較于對照組提高了2.14 mg/g，隨著氯化鈣濃度繼續(xù)增加，芝麻萌育GABA 含量開始下降，含量仍略高于去離子水萌育時的含量。這可能是因為作為第二信使，鈣離子通過信號傳遞的方式調(diào)節(jié)谷氨酸脫羧酶活力，增加酶促反應速率，合成代謝速率高于分解代謝速率，達到GABA 含量增加的目的[24]；氯化鈣濃度進一步增加，培養(yǎng)液中離子濃度升高，芝麻細胞外的滲透壓升高，堵塞物質(zhì)運輸通路，不利于GABA 的轉(zhuǎn)化。

圖3 不同濃度氯化鈣溶液對GABA 含量的影響Fig.3 Effect of calcium chloride solution with different concentration on GABA content

2.1.4 谷氨酸鈉對GABA 含量的影響 由圖4 可知，當谷氨酸鈉溶液質(zhì)量濃度增加至4.5 mg/mL時，芝麻萌育轉(zhuǎn)化GABA 達到最大值（6.24±0.06）mg/g，相較于對照組提高了4.26 mg/g，隨著谷氨酸鈉溶液質(zhì)量濃度進一步增加，GABA 含量反而降低。這可能是由于溶液濃度過高使得萌育環(huán)境中離子濃度升高，芝麻細胞外滲透壓增加，堵塞物質(zhì)運輸及電子傳遞的通道[25]，不利于物質(zhì)代謝，GABA 的生成受阻。而在較適合的濃度時，作為底物的谷氨酸鈉質(zhì)量濃度升高，谷氨酸鈉脫羧酶合成GABA 時，可利用的底物相應增多。

圖4 不同質(zhì)量濃度谷氨酸鈉溶液對GABA 含量的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of sodium glutamate solution on GABA content

2.2 凍融處理對芝麻中γ-氨基丁酸含量的影響

2.2.1 冷凍時間對萌育芝麻GABA 含量的影響由圖5 可知，冷凍時間在12～18 h 時，GABA 含量增加，18 h 增加至最大值，之后隨著冷凍時間的延長，GABA 含量降低。這可能是由于低溫冷凍促使諸如蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)變性且合成量減少[26-27]，促使小分子物質(zhì)生成，因此谷氨酸向GABA 的轉(zhuǎn)化量增加，當芝麻受到外界逆境脅迫如冷凍-解凍損傷等，植物會合成包括GABA 在內(nèi)的小分子功能物質(zhì)，適應外界逆環(huán)境；此外，植物在逆境環(huán)境中會通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)鈣離子濃度或胞內(nèi)氫離子濃度來調(diào)節(jié)胞內(nèi)谷氨酸脫羧酶活性[28]，進而調(diào)節(jié)GABA 含量，冷凍初期，鈣離子釋放有利于激活谷氨酸脫羧酶，而長時間冷凍，酶活性降低的同時，也會促使GABA 分解以滿足芝麻能量供求[29]，造成GABA 含量降低。

圖5 不同冷凍時間對GABA 含量的影響Fig.5 Effect of different freezing time on GABA content

2.2.2 解凍溫度對萌育芝麻GABA 含量的影響由圖6 可知，解凍溫度在20～25 ℃范圍內(nèi)，GABA含量沒有顯著性差異（P＞0.05），隨著解凍溫度的升高，GABA 含量增加，在30 ℃達到最大值。這是由于低溫下芝麻的細胞形成冰晶體，融化后其體積發(fā)生變化，對細胞造成機械損傷，植物在遭受應激性時會刺激GABA 的合成，抵御逆環(huán)境，芝麻由冷凍處理轉(zhuǎn)入解凍條件，芝麻為適應環(huán)境開始積累包括GABA 在內(nèi)的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，隨著溫度進一步升高，芝麻組織產(chǎn)生不可抑制的損傷[30-32]，導致GABA 含量降低。

圖6 不同解凍溫度對GABA 含量的影響Fig.6 Effect of different thawing temperatures on GABA content

2.2.3 解凍時間對萌育芝麻GABA 含量的影響由圖7 可知，在6～15 h，隨著解凍時間的延長，GABA 含量相應增加，在15 h 增加至最大值，隨后含量開始降低。這是因為低溫解除冰晶融化后，氫離子等滲入細胞質(zhì)，激活谷氨酸脫羧酶，故隨著解凍時間的延長，GABA 含量在萌育芝麻組織內(nèi)積累，此外，回溫過程中芝麻組織細胞膜被破壞，細胞內(nèi)外傳質(zhì)作用增大，谷氨酸脫羧酶與底物充分作用，合成的GABA 得以積累；解凍時間過長，就會出現(xiàn)諸如組織損傷、微生物繁殖等不可控影響，導致GABA 含量下降[33-35]。

圖7 不同解凍時間對GABA 含量的影響Fig.7 Effect of different thawing time on GABA content

2.3 不同處理條件對γ-氨基丁酸含量影響的比較

由圖8 可知，凍融處理與其它處理條件相比，芝麻中GABA 含量存在顯著性差異（P＞0.05），凍融處理顯著提升GABA 含量，本研究選用響應面試驗完成冷凍-解凍處理的優(yōu)化。

圖8 不同處理條件對GABA 含量的影響Fig.8 Effects of different treatment conditions on GABA content

2.4 冷凍-解凍（凍融）處理條件的優(yōu)化

在凍融處理單因素實驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設計原理，以冷凍時間、解凍溫度、解凍時間為考察因素，以GABA 量為響應值，確定冷凍-解凍的最佳條件，具體結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結(jié)果Table 2 Experiment design and results table of Box-Behnken

2.4.1 二次多項式回歸模型的建立 回歸模型的方差分析見表3。

表3 GABA 回歸模型方差分析Table 3 GABA regression model analysis of variance

結(jié)合表2、表3 可知，GABA 含量與凍融處理間的二次多項式模型為：Y=9.30+0.47A+1.16B-0.39C-0.76AB+0.045AC-0.48BC-1.10A2-1.85B2-2.29C2。式中，Y 指GABA 含量的預測值，A、B、C分別指冷凍時間、解凍溫度、解凍時間的編碼值。

其中二次多項式模型的有效性主要由失擬項檢驗與回歸方程顯著性檢驗決定，這兩項都可以通過F 檢驗反映。由表4 可知，模型P=0.0003達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項P=0.1177 不顯著（P＞0.05），這說明所選模型合理。R2Adj為0.9171，說明該模型可以解釋芝麻凍融過程中91.71%響應值的變化規(guī)律。綜上，芝麻在凍融處理中GABA 含量的變化可以通過該二次多項式模型預測。

結(jié)合表3 可知，因素B 對凍融處理過程中GABA 含量的影響極顯著（P＜0.01），因素AB 對凍融處理過程中GABA 含量的影響顯著（P＜0.05），因素A、C、AC、BC 對凍融處理過程中GABA 含量影響不顯著（P＞0.05），因素A2、B2、C2對凍融處理過程中GABA 含量影響極顯著（P＜0.01）。

2.4.2 因素交互作用分析 冷凍時間、解凍溫度、解凍時間的交互作用對GABA 含量的影響可以通過響應面3D 圖及等高線直觀觀察。在等高線圖中，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著。

1）冷凍時間與解凍溫度的交互作用 結(jié)合圖9 可知，冷凍時間與解凍溫度交互作用顯著，隨著冷凍時間延長及解凍溫度升高，響應值相應增加，隨后出現(xiàn)下降的趨勢，解凍溫度在29～33 ℃，冷凍時間在17～19 h，對應GABA 含量達到最大值，與單因素實驗分析結(jié)果相吻合。

圖9 冷凍時間和解凍溫度響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of freezing time and thawing temperature

2）冷凍時間與解凍時間的交互作用 由圖10 可知，隨著冷凍時間、解凍時間的延長，響應值相應增加，隨后又開始出現(xiàn)下降趨勢，解凍時間在14～16 h，冷凍時間在17～19 h，對應GABA 含量達到最大值，這與單因素實驗時分析結(jié)果相吻合。

圖10 冷凍時間和解凍時間響應面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour map of freezing time and thawing time

3）解凍溫度與解凍時間的交互作用 由圖11 可知，隨解凍時間的延長及解凍溫度的升高，響應值（GABA 含量）相應增加，而隨后開始出現(xiàn)下降的趨勢，解凍溫度在29～33 ℃，解凍時間在14～16 h，對應GABA 含量達到最大值，這與單因素實驗分析結(jié)果吻合。

圖11 解凍溫度和解凍時間響應面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour map of thawing temperature and thawing time

2.4.3 凍融處理提高γ-氨基丁酸含量的最優(yōu)條件 經(jīng)過軟件分析可以得出凍融處理轉(zhuǎn)化GABA的最佳條件是：冷凍時間18.3 h，解凍溫度31.5℃，解凍時間14.6 h，芝麻中GABA 含量可達9.92 mg/g。

2.4.4 驗證性試驗 結(jié)合最優(yōu)條件，選定冷凍時間18 h，解凍溫度32 ℃，解凍時間15 h，測定GABA 轉(zhuǎn)化值為（10.02±0.35）mg/g，與模型預測值接近，證實了模型的可靠性，響應面優(yōu)化試驗結(jié)果也得到驗證。

3 結(jié)論

1）萌育時間、溫度對于芝麻GABA 的含量均有明顯作用。隨著芝麻萌育時間的延長，GABA 含量顯著增加，萌育2.5 d，GABA 含量突增至（6.60±0.09）mg/g，與對照組相比增加4.62 mg/g；萌育3 d，GABA 含量增加至（7.19±0.18）mg/g，相較于對照組提高2.63 倍。隨著萌育溫度的提高，芝麻GABA 含量先升高再降低，萌育溫度30 ℃時，GABA 含量增加至最大值（3.36±0.09）mg/g，是對照組的1.7 倍。

2）在萌育過程中添加氯化鈣、谷氨酸鈉有利于GABA 的轉(zhuǎn)化。添加2.0 mmol/L 氯化鈣溶液時，GABA 含量增加至最大值（4.12±0.11）mg/g，相較于對照組提高了2.14 mg/g，是對照組的2 倍；添加4.5 mg/mL 氯化鈣溶液時，GABA 含量增加至最大值（6.24±0.06）mg/g，是對照組的3.15 倍。

3）冷凍-解凍脅迫（凍融）處理對提高萌育芝麻GABA 含量效果明顯。使用浸泡0.5 h，30 ℃萌育1.0 d 的芝麻進行冷凍-解凍處理，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設計原理，確認最優(yōu)的芝麻GABA 轉(zhuǎn)化條件是冷凍脅迫18 h，解凍溫度32℃，解凍時間15 h，該條件下芝麻中GABA 含量可達（10.02±0.35）mg/g，比未經(jīng)冷凍-解凍處理的芝麻GABA 含量提高3.02 倍，比未經(jīng)萌育處理的芝麻GABA 含量提高4.06 倍。