米糠酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠糖代謝異常及氧化應(yīng)激的改善作用

馬 勤，童 鑫，張名位，董麗紅，黃 菲，趙 東，池建偉，賈栩超，張瑞芬

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510640）

隨著生活水平的提高，高脂膳食也日益流行，由此造成了肥胖癥的發(fā)生，進(jìn)而引發(fā)糖尿病等慢性疾病。脂質(zhì)的積累與機(jī)體的氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，氧化應(yīng)激條件下可通過(guò)激活相關(guān)代謝通路，增加脂肪的生成并減少脂肪的分解，來(lái)促進(jìn)機(jī)體脂質(zhì)積累[1]。此外氧化應(yīng)激反應(yīng)可影響骨骼肌和脂肪組織中葡萄糖的吸收，并引起胰島素抵抗[2]，因此降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平是改善脂代謝和糖尿病的重要途徑。酚類(lèi)物質(zhì)是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種重要的抗氧化劑，可能是膳食中預(yù)防糖脂代謝紊亂的重要活性物質(zhì)[3-4]。在臨床上，姜黃素、表沒(méi)食子兒茶素和咖啡因等抗氧化劑已被用于肥胖癥的預(yù)防[5-6]。流行病學(xué)研究表明增加主食中全谷物的比例能夠明顯降低肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。隨著對(duì)全谷物認(rèn)知的加深，越來(lái)越多的科研人員對(duì)全谷物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用以替代精制谷物。糙米作為一種典型的全谷物，富含酚酸、膳食纖維、γ-谷維素等生物活性物質(zhì)，且大部分存在于麩皮層[9]。目前有研究表明米糠酚類(lèi)物質(zhì)具有改善脂代謝的作用，然而其改善糖代謝的活性作用及其機(jī)制尚不清楚。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究米糠酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)高脂膳食引起的糖代謝異常及氧化應(yīng)激的影響，對(duì)引導(dǎo)民眾健康飲食具有一定的意義。

HPLC 分析顯示糙米中富含對(duì)香豆酸、阿魏酸、表兒茶素、原兒茶酸、芥子酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)；藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎、降血脂、護(hù)肝等活性[10-12]。富含酚類(lèi)物質(zhì)的紅米可通過(guò)ACAT-2、HMG-CoA 還原酶和SREBP-2 降低肝臟膽固醇合成，并通過(guò)CYP7a1 和CYP8b1 促進(jìn)高膽固醇飲食小鼠肝臟膽固醇降解，從而發(fā)揮降低膽固醇的作用[13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)米糠酚類(lèi)物質(zhì)通過(guò)AMPK 信號(hào)通路降低肝臟中脂質(zhì)的生物合成，促進(jìn)脂肪酸的氧化分解，從而調(diào)節(jié)脂代謝[14]。米糠酚類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)抗氧化活性減少自由基損失，從而改善β 細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)胰島素分泌[15]。

米糠酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化的作用已廣泛報(bào)道，且有研究證實(shí)其具有改善脂代謝的作用并能調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞的功能，然而其是否與改善機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)尚不清楚。本研究采用高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠模型，研究米糠酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)其糖脂代謝的影響，重點(diǎn)探討其對(duì)脂肪組織細(xì)胞形態(tài)、體內(nèi)相關(guān)激素水平及氧化應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠，廣州荔泉食品有限公司；HPD-300大孔樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)為SYXK（粵）2012-0081）；胰島素ELISA 試劑盒，Crystal Chem 公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Infinite M200pro 酶標(biāo)儀，TECAN 公司；Nikon Eclipse Ci 顯微鏡，Nikon 公司；ACCUCHEK Mobile 血糖儀，德國(guó)Roche 公司。

1.2 米糠酚類(lèi)物質(zhì)的制備

米糠酚類(lèi)物質(zhì)參考前期研究的方法制備[10]。采用超臨界二氧化碳的方法進(jìn)行脫脂得到脫脂米糠，采用冷的80%的丙酮水溶液對(duì)脫脂米糠中酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取，提取液濃縮后過(guò)HPD-300 大孔樹(shù)脂，純水洗脫后，采用70%乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并經(jīng)冷凍干燥后得到米糠酚類(lèi)物質(zhì)粉末。采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定米糠酚類(lèi)物總酚含量，采用HPLC-DAD 檢測(cè)米糠酚類(lèi)提取物中酚類(lèi)物質(zhì)的構(gòu)成及其含量。所得總酚含量為82.5%，對(duì)香豆酸、蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸是含量最高的5 種化合物，其含量分別為（86.18 ± 3.16），（81.75± 1.38），（81.87 ± 1.12），（68.74±3.15），（58.36±2.44）mg/g[10]。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

80 只C57BL/6J 小鼠于溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%的條件下適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為4 組（n=20）：正常組（NC 組）、高脂組（HF 組）、低劑量組（HF+LP 組）和高劑量組（HF+HP 組）。其中NC 組飼喂正常飼料，HF 組、低劑量組和高劑量組均飼喂高脂飼料，低劑量組和高劑量組分別灌胃200 mg/（kg·d）和400 mg/（kg·d）劑量的米糠酚類(lèi)物質(zhì)（RBPE），NC 組和HF 組灌胃相同體積的蒸餾水作為對(duì)照。

飼喂16 周后，小鼠禁食12 h，眼眶取血，3 000×g 離心15 min 后，取上清保存于-80 ℃冰箱備用。處死小鼠后取肝、脾、腎、附睪脂肪及腎周脂肪并稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。取部分新鮮附睪脂肪組織固定于4%多聚甲醛溶液中，用于組織染色。其余臟器分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 組織染色

新鮮附睪脂肪組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、包埋切片后，用蘇木素-伊紅染色，并于顯微鏡下觀察拍照。

1.5 血糖、胰島素水平測(cè)定

小鼠禁食、不禁水12 h 后，眼眶取血，采用羅氏血糖儀測(cè)定空腹血糖；參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定血清胰島素和瘦素水平。

1.6 葡萄糖耐量測(cè)定

小鼠處死前1 周，禁食、不禁水12 h，腹腔注射葡萄糖溶液（2.0 g/kg）后，斷尾取血，采用羅氏血糖儀分別測(cè)定0，0.5，1.0，1.5，2.0 h 的血糖水平，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

1.7 血清及肝臟氧化應(yīng)激水平測(cè)定

根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清和肝臟MDA、SOD、GSH、GSH-px 和CAT 的水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）”表示，采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBPE 對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

由圖1 可知，各組小鼠體質(zhì)量均隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，其中HF 組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度最大，低劑量和高劑量的RBPE 可以減緩高脂膳食引起的體質(zhì)量增加，而差異不顯著。由表1可知，與正常飲食相比，高脂膳食可以顯著提高小鼠肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪、腎臟和脾臟的臟體比（P＜0.05）。RBPE 可以劑量依賴地降低肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪的臟體比（P＜0.05）；高劑量的RBPE 膳食可以顯著降低腎臟的臟體比，而低劑量的RBPE 對(duì)脾臟的臟體比沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果表明RBPE 可以降低高脂膳食引起的小鼠內(nèi)臟脂肪的積累。

圖1 RBPE 對(duì)小鼠的體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of RBPE on body weight of mice

2.2 RBPE 對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠血糖的影響

各組小鼠血糖水平及其口服葡萄糖耐量下曲線面積如圖2 所示。與NC 組相比，HF 組小鼠空腹血糖水平顯著升高，而低劑量和高劑量RBPE均可以顯著降低高脂小鼠的空腹血糖水平（P＜0.05），提示RBPE 可以有效改善高脂膳食引起的小鼠血糖水平升高。葡萄糖耐量可反應(yīng)胰島β 細(xì)胞功能以及機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力[16]。結(jié)果顯示，腹腔注射葡萄糖后各組小鼠血糖均迅速升高，于0.5 h 達(dá)到最大值并緩慢下降。2 h 時(shí)，NC 組和RBPE 處理組小鼠血糖水平均恢復(fù)至正常水平，而HF 組小鼠血糖仍處于較高水平?？崭固悄土壳€下面積（AUC）結(jié)果顯示，高脂膳食明顯導(dǎo)致糖耐量受損，而RBPE 對(duì)高脂引起的糖耐量受損具有一定的改善作用（P＜0.05）。這些結(jié)果表明RBPE 對(duì)高脂引起的小鼠糖代謝異常具有改善作用。

圖2 RBPE 對(duì)小鼠糖代謝的影響Fig.2 Effect of RBPE on glucose metabolism in mice

2.3 RBPE 對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素水平和附睪脂肪組織形態(tài)的影響

胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要特征，機(jī)體表現(xiàn)為高胰島血癥，而胰島素敏感性降低[17]。血清胰島素測(cè)定結(jié)果如圖3a 所示，與NC 組相比，HF組小鼠胰島素水平顯著升高（P＜0.05），而高劑量RBPE 干預(yù)可顯著降低高脂小鼠的血清胰島素水平（P＜0.05）。脂肪組織在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其可以通過(guò)調(diào)控PKCε 介導(dǎo)脂肪飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，而當(dāng)存在和缺乏PKCε 時(shí)，脂肪細(xì)胞在形狀和大小上會(huì)表現(xiàn)出差異[18]。因此進(jìn)一步探究了RBPE 對(duì)小鼠附睪脂肪組織形態(tài)的影響。結(jié)果如圖3b 所示，與NC 組相比，HF 組小鼠附睪脂肪細(xì)胞顯著增大，而經(jīng)RBPE 干預(yù)鼠附睪脂肪細(xì)胞的體積明顯減小。這些結(jié)果表明RBPE 對(duì)高脂引起的小鼠高胰島血癥具有一定的抑制作用。

圖3 RBPE 對(duì)小鼠胰島素水平（a）和附睪脂肪組織形態(tài)（b）的影響Fig.3 Effect of RBPE on insulin level（a）and histopathological observation of epididymal fat tissue（b）

2.4 RBPE 對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

SOD、CAT 和GPx 是內(nèi)源性抗氧化酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基。GSH 是一種主要的內(nèi)源性抗氧化劑，能中和細(xì)胞內(nèi)的自由基和活性氧化合物。SOD、CAT、GPx 和GSH 在維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用；MDA 為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，可反映機(jī)體氧化損傷程度[19-20]。各組小鼠血清SOD 活力和MDA 含量如表2 所示，與NC 組相比，HF 組小鼠SOD 的活力顯著降低，MDA 的含量顯著升高（P＜0.05）。與高脂膳食相比，RBPE 膳食可以顯著提高SOD 的酶活力，并降低血清MDA的含量（P＜0.05）。肝臟是調(diào)節(jié)血糖代謝的重要器官。各組小鼠肝臟的氧化應(yīng)激水平如表2 所示，與正常飲食相比，高脂膳食顯著降低肝臟SOD、CAT和GSH-px 等抗氧化酶的活力，降低抗氧化物GSH 的含量，并促進(jìn)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 的產(chǎn)生（P＜0.05）。與HF 組相比，RBPE 組小鼠的SOD、CAT和GSH-px 等抗氧化酶的活力顯著提高，MDA 含量顯著下降，且抗氧化物GSH 的含量顯著升高（P＜0.05）。這些結(jié)果表明RBPE 可以顯著降低高脂膳食引起的小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

表2 RBPE 對(duì)小鼠血清和肝臟氧化應(yīng)激水平的影響Table 2 Effect of RBPE on oxidative stress in serum and liver

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)米糠酚類(lèi)物質(zhì)可以顯著減少高脂小鼠臟器脂肪積累，降低空腹血糖水平，改善小鼠的葡萄糖耐受性，調(diào)節(jié)小鼠糖代謝紊亂。Justo 等[12]的研究也表明米糠酶解提取物可以減輕高脂誘導(dǎo)的小鼠的血糖升高、胰島素抵抗、血脂異常以及脂肪組織的形態(tài)改變。Jung 等[11]探究了米糠酚酸類(lèi)物質(zhì)和阿魏酸對(duì)db/db 小鼠的影響，結(jié)果表明兩者均可以顯著降低小鼠血糖水平。本研究中米糠提取物酚類(lèi)物質(zhì)含量超過(guò)80%，其主要成分為對(duì)香豆酸、蘆丁、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸。研究表明咖啡酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸和原兒茶酸可顯著降低高果糖飲食誘導(dǎo)的大鼠血糖、胰島素和瘦體水平，減少血清炎癥因子的含量[21-22]。這些研究結(jié)果一致表明米糠酚類(lèi)物質(zhì)具有改善糖代謝的作用。

米糠酚類(lèi)物質(zhì)體外抗氧化作用已被廣泛報(bào)道，研究顯示其具有清除ABTS、DPPH、過(guò)氧化自由基（ORAC 法）的作用[23-25]。Saji 等[26]發(fā)現(xiàn)米糠酚類(lèi)物質(zhì)可以顯著抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧生成，降低細(xì)胞內(nèi)MDA 水平。Xiao等[27]研究表明米糠酚類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)減輕線粒體功能障礙，降低酒精誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)氧化損失，從而發(fā)揮護(hù)肝的作用。然而米糠酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激作用尚不清楚。本研究表明米糠酚類(lèi)物質(zhì)可以提高高脂小鼠SOD、CAT 和GSH-px 等抗氧化酶的活力，降低MDA 的含量，并提高抗氧化物GSH 的含量，降低高脂引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。蘆丁可以降低高脂小鼠肝臟MDA 的水平，提高GSH 含量，并提高SOD 和GPx 等抗氧化酶的活性[28]。Shen 等[29]研究表明米糠酚類(lèi)物質(zhì)的主要成分對(duì)香豆酸可以通過(guò)Nrf 信號(hào)通路抑制活性氧的生成，從而改善高脂小鼠的糖脂代謝。這些研究提示米糠酚類(lèi)物質(zhì)改善高脂小鼠氧化應(yīng)激的作用，可能是對(duì)香豆酸、蘆丁、阿魏酸等酚類(lèi)物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)米糠酚類(lèi)物質(zhì)可以顯著改善高脂小鼠的糖代謝紊亂，其機(jī)制可能通過(guò)提高機(jī)體SOD、CAT 和GSH-px 等抗氧化酶的活力，促進(jìn)GSH 等抗氧化物質(zhì)的合成，并降低氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生從而降低小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。