食品加工、貯藏對(duì)乳桿菌源抗菌肽抑菌活性的影響及安全性評(píng)價(jià)

杜旭婷，岳子堯，董 晶，李 戀，滿都拉，孫子羽，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018）

食品在采摘、加工、運(yùn)輸以及貯藏的過(guò)程中會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)，不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)危害消費(fèi)者健康[1]。引起食品腐敗的最主要原因是微生物的污染，除使用鹽漬、糖漬等傳統(tǒng)方法外，在食品工業(yè)中主要使用食品防腐劑來(lái)控制腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)加工食品的貨架期[2]。化學(xué)防腐劑成本低廉，然而其中某些化學(xué)物質(zhì)的大量攝入會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生負(fù)面影響[3]，即使其添加量被控制在對(duì)人體無(wú)毒的區(qū)間，在某些食品中仍無(wú)法完全抑制腐敗菌的生長(zhǎng)[4]。因此，可以替代化學(xué)防腐劑且更加安全的天然防腐劑受到廣泛關(guān)注。乳酸菌抗菌肽是乳酸菌分泌的對(duì)腐敗菌或病原菌具有抑制活性的多肽，因生物安全性及抑菌活性而在食品加工、保藏、飼料生產(chǎn)及醫(yī)藥領(lǐng)域有較成功的應(yīng)用[5]。在食品加工過(guò)程中，酸堿度會(huì)影響抗菌肽抑菌活性，如乳酸鏈球菌素Nisin 適用于酸性環(huán)境，而對(duì)中性以及堿性環(huán)境不耐受[6]。抗菌肽Brevilaterin 經(jīng)-20 ℃反復(fù)凍融6 次后，其抑菌活性略微下降[7]。乳酸鏈球菌素（乳酸菌生產(chǎn)）和聚賴氨酸（鏈霉菌生產(chǎn)）是我國(guó)目前批準(zhǔn)，并應(yīng)用于乳品加工的兩種微生物代謝物，研究新型乳酸菌抗菌肽在我國(guó)食品行業(yè)有著廣闊前景。前期研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌ALAC-4 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌均具有良好的抑菌活性。本試驗(yàn)將其代謝產(chǎn)物粗提液制得粗提粉，研究食品加工、貯藏因素對(duì)其抑菌活性的影響，分析其最適使用條件及范圍。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》（GB 15193.3-2014）對(duì)該粗提粉的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其作為生物防腐劑應(yīng)用于食品行業(yè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

YEPD 液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨20 g/mL，酵母提取粉10 g/mL，葡萄糖20 g/mL，pH 6.0，115℃20 min 滅菌；YEPD 固體培養(yǎng)基：在YEPD 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉15 g/mL；水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g/mL，121 ℃20 min 滅菌。

乳桿菌ALAC-4 分離自內(nèi)蒙傳統(tǒng)發(fā)酵食品；白假絲酵母（Candida albicans，CICC32819）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、青霉（Penicillium）、婁地青霉（Penicillium roqueforti）、黑曲霉（Aspergillus niger）、毛霉（Mucor）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、白地霉（Geotrichum）、桔青霉（Penicillium citrinum）、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）、克柔假絲酵母（Candida krusei）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、粉狀畢赤氏酵母（Pichia farinosa）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）均來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

乳清粉、酪蛋白水解酶、大豆蛋白胨、酵母提取粉、葡萄糖、瓊脂、NaCl，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

ELx808 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰有限公司；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 型垂直凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；DHP-9162B 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HWS012 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)有限公司；FA2104N 型電子天平，上海菁海儀器有限公司；BCD-249CF 型美萎冰箱，合肥美菱股份有限公司；PB-10 型pH 計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KDC-140HR 型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；IKA?RV10 digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，河南兄弟有限公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小白鼠（3～8 周，22 只）、基礎(chǔ)飼料及籠底墊料均由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 乳桿菌源抗菌肽粗提粉制備 乳桿菌活化至3 代，備用。取乳清粉100 g 溶于1 L 90 ℃蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 4.5，90 ℃水浴30 min，經(jīng)脫脂棉和紗布過(guò)濾后，調(diào)節(jié)pH 6.5，煮沸后抽濾，再加等量蒸餾水，以及酪蛋白水解酶5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母粉2 g/L，121 ℃20 min 滅菌，待冷卻后接種乳桿菌發(fā)酵，將發(fā)酵液離心濃縮并真空冷凍干燥，最后研磨成粉，備用。

1.2.2 抑菌譜的測(cè)定 選取食品中常見(jiàn)的致病菌和腐敗菌作為指示菌，測(cè)定其抑菌活性，從而確定抑菌譜。

1.2.3 相對(duì)抑菌活性的測(cè)定 指示菌菌液制備：從菌種保藏斜面用無(wú)菌接種環(huán)刮取1 環(huán)白假絲酵母菌接種至YEPD 液體培養(yǎng)基中，活化1 代（30℃，36 h），再接種到Y(jié)EPD 液體培養(yǎng)基，傳2 代培養(yǎng)（30 ℃，36 h），備用[8]。

雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性[9]：水瓊脂培養(yǎng)基倒平板，待板凝固后使用無(wú)菌鑷子將無(wú)菌牛津杯置于水瓊脂上；無(wú)菌生理鹽水將指示菌梯度稀釋至103CFU/mL；1 mL 指示菌液加入到25 mL YEPD 瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后倒入平皿內(nèi)，待凝固后取出牛津杯；于孔內(nèi)加入200 μL 粗提粉溶液，30℃培養(yǎng)36 h 后，量取抑菌圈直徑。相對(duì)抑菌活性按公式（1）計(jì)算：

1.2.4 最低抑菌濃度測(cè)定 參考李鈺芳等[10]的方法并稍作修改，測(cè)定粗提粉的最小抑菌質(zhì)量濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。取對(duì)數(shù)期的指示菌菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體3 次后，制備成菌懸液（菌液濃度為103CFU/mL），加入96 孔板內(nèi)。用二倍稀釋法將粗提粉稀釋后加入菌懸液中；設(shè)置空白組為等量無(wú)菌水代替菌懸液，其余條件相同；設(shè)置對(duì)照組為等量無(wú)菌水代替粗提粉溶液。將96 孔板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育36 h，測(cè)定試驗(yàn)組與空白組的OD600nm差值，以粗提粉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD600nm差值為縱坐標(biāo)繪制曲線，拐點(diǎn)即為MIC。

1.2.5 食品貯藏過(guò)程中不同因素對(duì)抗菌肽粉抑菌活性的影響

1.2.5.1 貯藏溫度與貯藏時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

將粗提粉分別在-80，-20，4 ℃條件下，處理1周，15 d，1 個(gè)月及3 個(gè)月，恢復(fù)至室溫（25 ℃），配成終質(zhì)量濃度為MIC 的粗提粉溶液，以未處理的樣品作為對(duì)照（相對(duì)抑菌活性為100%），然后用雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性，研究不同貯藏溫度與貯藏時(shí)間對(duì)粗提粉抑菌活性的影響。重復(fù)處理3 次。

1.2.5.2 反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響 將粗提粉反復(fù)凍融（-20 ℃凍結(jié)，常溫解凍，反復(fù)凍融5 次），恢復(fù)至室溫，配成終質(zhì)量濃度為MIC 的粗提粉溶液，以未處理的樣品作為對(duì)照（相對(duì)抑菌活性為100%），然后用雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性，研究反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)粗提粉抑菌活性的影響。重復(fù)處理3 次。

1.2.6 食品加工過(guò)程中不同因素對(duì)抗菌肽粉抑菌活性的影響

1.2.6.1 高溫處理對(duì)抑菌活性的影響 取終質(zhì)量濃度為MIC 的粗提粉溶液，分別在40，60，80，100℃下水浴30 min，121 ℃高溫處理20 min，然后冷卻至室溫，以未處理的樣品作為對(duì)照（相對(duì)抑菌活性為100%），采用雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性，研究不同高溫對(duì)粗提粉抑菌活性的影響。重復(fù)處理3 次。

1.2.6.2 pH 處理對(duì)抑菌活性的影響 取終質(zhì)量濃度為MIC 的粗提粉溶液，分別用HCl 和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH 值至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，室溫處理4 h，調(diào)回pH 值至中性（6.5～7.5），以未處理的樣品作為對(duì)照（相對(duì)抑菌活性為100%），然后用雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性，研究不同pH值對(duì)粗提粉抑菌活性的影響。重復(fù)處理3 次。

1.2.6.3 鹽的質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響 配制質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的NaCl 溶液，加入粗提粉，使終質(zhì)量濃度為MIC，室溫處理4 h 后，以未經(jīng)NaCl 處理的樣品作為對(duì)照（相對(duì)抑菌活性為100%），然后用雙層平板法測(cè)定相對(duì)抑菌活性，研究不同鹽的質(zhì)量濃度對(duì)粗提粉抑菌活性的影響。重復(fù)處理3 次。

1.2.7 安全性評(píng)價(jià) 采用限量法進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：選取22 只健康昆明種小白鼠，雌雄各半（雌性為未交配過(guò)、未妊娠過(guò)的），隨機(jī)挑選2只（1 雌1 雄）作為對(duì)照，體質(zhì)量為（20±2）g（同性別個(gè)體體質(zhì)量不超過(guò)平均體質(zhì)量的20%），預(yù)飼3 d 后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。灌胃前禁食4 h，粗提粉溶液濃度為1×MIC，灌胃體積為20 mL/kg 體質(zhì)量。灌喂后禁食2 h，自由飲水。每天定時(shí)飼喂，連續(xù)觀察7 d 并記錄小鼠的一般情況、動(dòng)作行為和死亡狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖，摘取各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，再脫水、浸蠟、包埋、切片，做HE 染色。在顯微鏡下觀察分析各臟器組織的病理變化，并測(cè)定其心、肝、脾、肺、腎的臟器指數(shù)。臟器指數(shù)測(cè)定按公式（2）計(jì)算：

1.2.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（xˉ±s，n=3）”表示，用Origin 2019 繪制統(tǒng)計(jì)圖，采用SPSS 25.0 單因素ANOVA 檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)差異多重比較，兩兩比較方差齊性時(shí)采用最小顯著性差異法，非齊性時(shí)使用塔姆黑尼T2 方法，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌譜

乳桿菌源抗菌肽的抑菌譜如表1 所示，可以發(fā)現(xiàn)它僅對(duì)白地霉、克柔假絲酵母、釀酒酵母、漢遜德巴利酵母和粉狀畢赤酵母5 株菌無(wú)抑菌性，對(duì)黑曲霉、毛霉、粘紅酵母、白假絲酵母和8 株表中細(xì)菌具有強(qiáng)抑菌性，其中對(duì)白假絲酵母的抑制作用更為突出。而枯草芽胞桿菌D9[11]所產(chǎn)抗菌肽只對(duì)金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌有抑制作用，且抑菌效果不強(qiáng)。由此可見(jiàn)，乳桿菌源抗菌肽對(duì)于引起食品腐敗的細(xì)菌和酵母、霉菌都有較強(qiáng)的抑菌效果，具有廣譜的抑菌性。尤其對(duì)白假絲酵母有更加顯著的抑菌效果。

表1 乳桿菌源抗菌肽抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus-derived antimicrobial peptide

2.2 最低抑菌質(zhì)量濃度

如圖1 所示，當(dāng)粗提粉質(zhì)量濃度增加時(shí)，對(duì)應(yīng)OD600nm呈降低趨勢(shì)，當(dāng)粗提粉質(zhì)量濃度增加到1 g/mL 時(shí)，OD600nm幾乎無(wú)變化，白假絲酵母菌也無(wú)法正常生長(zhǎng)，因此粗提粉對(duì)白假絲酵母菌的MIC 為1 g/mL。

圖1 粗提粉最低抑菌濃度Fig.1 MIC of crude lift powder

2.3 食品貯藏過(guò)程中各因素對(duì)抑菌活性的影響

2.3.1 貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響通過(guò)模擬市場(chǎng)中的保藏溫度條件，即冷藏環(huán)境（4℃）、慢凍環(huán)境（-20 ℃）及速凍環(huán)境（-80 ℃），研究不同貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)粗提粉抑菌特性的影響。根據(jù)圖2 可知，在低溫條件下，長(zhǎng)期貯藏粗提粉相對(duì)抑菌活性均無(wú)顯著變化（P＞0.05），當(dāng)貯藏時(shí)間達(dá)到90 d，4，-20，-80 ℃的相對(duì)抑菌活性為（93.27±2.66）%，（94.45±0.53）%，（90.18±5.30）%，表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉具有良好的貯藏穩(wěn)定性，能夠在極端低溫條件下，長(zhǎng)期抑制病原菌及腐敗菌的生長(zhǎng)。這一結(jié)果可能由于抗菌肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在冷藏、冷凍時(shí)肽鍵以及氫鍵不易解開(kāi)，當(dāng)溫度緩慢恢復(fù)后，抗菌肽的抑菌活力也會(huì)恢復(fù)。Yi 等[12]也發(fā)現(xiàn)乳桿菌源細(xì)菌素BMA 在4 ℃下貯藏3 個(gè)月，其抑菌活性依然良好。同為乳桿菌源抗菌肽，它們都表現(xiàn)出穩(wěn)定的耐貯藏性，這為乳桿菌源抗菌肽粗提粉在食品防腐領(lǐng)域中奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖2 貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響Fig.2 The effect of storage temperature and storage time on antimicrobial activity

2.3.2 反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響 由圖3 可知，粗提粉經(jīng)5 次反復(fù)凍融處理后，相對(duì)抑菌活性與對(duì)照組均無(wú)顯著差異（P＞0.05），在第5 次凍融后，其相對(duì)抑菌活性略有下降至（94.87±7.23）%，表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉具有良好的反復(fù)凍融穩(wěn)定性。低溫環(huán)境可以維持各類食品商品品質(zhì)，而反復(fù)解凍的操作極易造成腐敗菌污染，同時(shí)抗菌肽的抑菌活性很可能會(huì)受反復(fù)凍融處理的影響[13]。瞿青新[14]研究表明酪蛋白源抗菌肽經(jīng)-20 ℃反復(fù)凍融，其抑菌活性無(wú)明顯改變，王美姿等[15]也與本研究結(jié)果相似。

圖3 反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響Fig.3 The effect of freeze-thaw cycle on antimicrobial activity

2.4 食品加工過(guò)程中不同因素對(duì)抗菌肽粉抑菌活性的影響

2.4.1 高溫處理對(duì)抑菌活性的影響 不同高溫處理對(duì)粗提粉抑菌活性的影響，如圖4 所示。粗提粉相對(duì)抑菌活性在40～60 ℃范圍內(nèi)處理30 min 無(wú)顯著性差異（P＞0.05），80 ℃處理30 min 后略有下降，經(jīng)100 ℃處理30 min，121 ℃處理20 min 后，對(duì)白假絲酵母菌的相對(duì)抑菌活性仍然能維持在80%左右，表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉具備良好的熱穩(wěn)定性。這一結(jié)果可能由于抗菌肽分子質(zhì)量小于500 u，二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，高溫對(duì)其結(jié)構(gòu)影響小，使得極端環(huán)境消失后，抗菌肽會(huì)很大程度上恢復(fù)其原始結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮作用[16]。這與很多研究結(jié)果相似，辣椒籽抗菌肽經(jīng)25～100 ℃及121 ℃高溫處理后，其殘留活性依然能保持90%以上[17]，側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9 發(fā)酵所產(chǎn)抗菌肽隨著溫度的升高，抑菌活性逐步下降，然而在100 ℃處理后，活性回收率為80%左右，121 ℃處理后活性回收率為70%左右，同樣具有良好的抑菌熱穩(wěn)定性[18]。而朱張洪基[19]研究的SDLH 抑菌蛋白在50～80 ℃時(shí)的抑菌活性與常溫時(shí)的相比顯著性降低，原因可能是該抑菌蛋白分子質(zhì)量大，高溫處理破壞其空間結(jié)構(gòu)，從而對(duì)抑菌活性產(chǎn)生影響。

圖4 高溫對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 The effect of high temperature on antimicrobial activity

2.4.2 pH 處理對(duì)抑菌活性的影響 當(dāng)高pH 處理后粗提粉相對(duì)抑菌活性發(fā)生顯著性降低，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)pH≤8.0 時(shí)，粗提粉的相對(duì)抑菌活性無(wú)顯著變化（P＞0.05），當(dāng)pH 8.0 時(shí)，粗提粉的相對(duì)抑菌活性比對(duì)照組降低了16.53%，當(dāng)pH≥8.0 時(shí)，粗提粉相對(duì)抑菌活性顯著降低（P＜0.05），幾乎喪失抑菌活性，表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉更適用于偏酸性的環(huán)境。原因1 可能是抗菌肽經(jīng)酸處理后更易溶解；原因2 可能是抗菌肽經(jīng)酸堿處理后的帶電狀態(tài)變化，進(jìn)一步影響粗提粉與白假絲酵母菌細(xì)胞膜的相互作用[20]。已經(jīng)試驗(yàn)批準(zhǔn)并應(yīng)用于食品防腐領(lǐng)域的乳酸鏈球菌素經(jīng)低pH 處理后穩(wěn)定性良好，中性處理后活性降低，并在pH 8.0及以上處理后基本完全失活[21]，這與本研究的乳桿菌源抗菌肽粗提粉具有相似性，其原因可能是兩種物質(zhì)皆源于乳酸菌，而這種特性會(huì)限制其在中性和堿性條件下的應(yīng)用。

圖5 pH 值對(duì)抑菌活性的影響Fig.5 The effect of pH value on antimicrobial activity

2.4.3 鹽的質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響 不同鹽質(zhì)量濃度對(duì)粗提粉相對(duì)抑菌活性的影響，如圖6所示。結(jié)果表明，當(dāng)鹽質(zhì)量濃度≤0.6 mg/mL 時(shí)，粗提粉的相對(duì)抑菌活性無(wú)顯著變化（P＞0.05），當(dāng)鹽質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，其相對(duì)抑菌活性有大幅度下降，最低至（74.74±6.50）%，表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉對(duì)高鹽環(huán)境的抗性較差。肖懷秋等[22]所研究的金屬抗菌肽SIF4 在50～200 mmol/L 鹽濃度內(nèi)，其相對(duì)抑菌活性均無(wú)顯著差異，而劉國(guó)榮等[23]所研究的雙歧桿菌細(xì)菌素BB04，在10～200 mmol/L 的鹽濃度范圍內(nèi)，抑菌效果差異顯著，不適用于高鹽環(huán)境。由此可知，不同抗菌肽的高鹽環(huán)境適應(yīng)性存在差異。

圖6 鹽濃度對(duì)抑菌活性的影響Fig.6 The effect of salinity on antimicrobial activity

圖7 小鼠臟器組織病理切片F(xiàn)ig.7 Histopathological sections of the mouse organs

2.5 安全性評(píng)價(jià)

2.5.1 臨床癥狀 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的一般情況和動(dòng)作行為的觀察記錄表明（表2），整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的采食飲水情況、外觀以及動(dòng)作行為等均無(wú)明顯異常。也未發(fā)現(xiàn)經(jīng)灌胃粗提粉溶液后，小鼠出現(xiàn)明顯的表觀中毒現(xiàn)象。

表2 小鼠生長(zhǎng)體征情況Table 2 Growth signs of mice

2.5.2 半數(shù)致死量及臟器指數(shù)情況 由表3 可以看出，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均未出現(xiàn)死亡情況。則認(rèn)為粗提粉對(duì)動(dòng)物的經(jīng)口急性毒性耐受劑量大于20 g/kg，其LD50＞20 g/kg，根據(jù)食品添加劑急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該粗提粉屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)。因此，該粗提粉應(yīng)用于食品添加劑是安全可行的。經(jīng)灌胃粗提粉溶液后，小鼠的心、肝、脾、肺、腎的臟器指數(shù)與對(duì)照組相比均差異不顯著（P＞0.05），表明在一次性灌胃高劑量粗提粉，即20 g/kg 對(duì)各臟器的形態(tài)以及質(zhì)量無(wú)顯著影響。

表3 小鼠存活情況及臟器指標(biāo)Table 3 Mice survival and organ indicators

2.5.3 臟器及組織病理變化 通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠的臟器及組織，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間宏觀臟器的色澤、形態(tài)、質(zhì)地等均沒(méi)有差異，無(wú)明顯病變及壞死，對(duì)照組小鼠各臟器組織有完整、清晰的結(jié)構(gòu)；經(jīng)抗菌肽灌胃后，小鼠各臟器內(nèi)細(xì)菌形態(tài)少見(jiàn)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯病理變化。由此說(shuō)明，一次灌服20 g/kg 的粗提粉不會(huì)造成臟器和組織的急性病理現(xiàn)象。

3 結(jié)論

抗菌肽抑菌活性的穩(wěn)定性會(huì)制約其在食品防腐領(lǐng)域中的適用范圍及潛力，研究新型抗菌肽在面臨食品加工、貯藏過(guò)程中極端情況下的抑菌穩(wěn)定性，對(duì)其作為食品添加劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重大意義。本研究模擬食品加工過(guò)程中，遇到的高溫、不同pH、高鹽環(huán)境對(duì)具有廣譜抑菌性的抗菌肽粗提粉的影響，發(fā)現(xiàn)其具有良好的熱穩(wěn)定性，在強(qiáng)堿以及高鹽環(huán)境下，其相對(duì)抑菌活性顯著降低（P＜0.05），表明其適用于偏酸、中性以及低鹽環(huán)境。在食品貯藏期間面臨的溫度變化、長(zhǎng)期保存以及反復(fù)凍融的情況下，粗提粉與對(duì)照相比其相對(duì)抑菌活性均無(wú)顯著變化（P＞0.05），在長(zhǎng)期貯藏達(dá)到3個(gè)月時(shí)，3 種低溫貯藏溫度下的粗提粉相對(duì)抑菌活性均能保存90%以上，表明該粗提粉能夠適應(yīng)長(zhǎng)期低溫保藏并具有反復(fù)凍融的能力。小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)表明受試物未顯示毒性，采用限量法評(píng)價(jià)其安全性發(fā)現(xiàn)，小鼠在灌胃量為20 g/kg 后表觀正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象以及死亡情況，根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》初步表明該乳酸菌抗菌肽粗提粉的安全級(jí)別屬于實(shí)際無(wú)毒。以上結(jié)果表明乳桿菌源抗菌肽粗提粉在食品加工及貯藏中不同條件下能夠保持良好抑菌穩(wěn)定性，且安全無(wú)毒，因此其作為一種新型食品防腐劑具有良好的應(yīng)用前景。