傳統(tǒng)腌漬蔬菜中高產(chǎn)AI-2 信號分子乳酸菌的篩選及其益生特性

呂欣然，劉雪晴，顧振辰，呂孟敏，勵建榮*，檀茜倩，崔方超，白鳳翎，俞張富，沈榮虎

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州121013 2 杭州蕭山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司 杭州 311215）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是指細(xì)菌通過監(jiān)測種群群體密度，進(jìn)而調(diào)節(jié)其基因表達(dá)的行為，是細(xì)菌群體之間通訊和交流的一種機制[1]。目前，依據(jù)信號分子類型分為4 類群體感應(yīng)系統(tǒng)：1）擴散信號因子（Diffusible signaling factor，DSF）群體感應(yīng)，存在于革蘭氏陰性菌中，具有調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力因子與生物膜形成等功能[2]；2）寡肽（Auto-inducing peptides，AIP）類群體感應(yīng)，廣泛存在于革蘭氏陽性細(xì)菌中[3]；3）?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）類群體感應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)菌種間交流；4）呋喃硼酸二酯（Autoinducer-2，AI-2）類群體感應(yīng)，AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)及其合成酶蛋白LuxS，可介導(dǎo)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間的種間和種內(nèi)信息交流[4]。AI-2 是細(xì)菌中同型半胱氨酸代謝的副產(chǎn)物[5]，其QS 系統(tǒng)主要參與調(diào)控生物膜形成、生物發(fā)光、細(xì)胞運動和毒力因子的表達(dá)等[6]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中一種重要的乳酸菌，廣泛應(yīng)用在食品加工領(lǐng)域。其具有較好的抑菌性和胃腸道耐受能力，大多數(shù)植物乳桿菌菌株是公認(rèn)的益生菌[7]。為有效適應(yīng)生存環(huán)境變化，乳酸菌種群間會通過分泌群體感應(yīng)信號增加個體間的信息交流，通過產(chǎn)生生物膜、細(xì)菌素等適應(yīng)環(huán)境的變化[8]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）通過AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)其在腸道表面的黏附和定殖能力[9-10]。Moslehi-Jenabian 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AI-2/LuxS 群 體感應(yīng)系統(tǒng)改善了4 種乳酸桿菌的酸適應(yīng)性，增強其在胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)中存活能力。AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)可調(diào)控乳酸菌的酸耐受性和腸道定植能力，然而其調(diào)控乳酸菌的其它益生特性的能力尚不清楚。需進(jìn)一步研究AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)與乳酸菌益生特性的關(guān)系。

鑒于上述問題，本研究利用哈維氏弧菌BB170 菌株報告法，從傳統(tǒng)腌漬蔬菜中篩選產(chǎn)AI-2 信號分子乳酸菌，并通過酸耐受性、膽汁耐受性、黏附性、抑菌特性和生物膜形成能力等指標(biāo)，評價AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)對乳酸菌益生特性的影響，以期為開發(fā)具有益生潛力的乳酸菌發(fā)酵劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 乳酸菌菌株來源于安徽安慶農(nóng)家自制蘿卜和雪菜，遼寧葫蘆島農(nóng)家自制酸菜，遼寧阜新、彰武農(nóng)家自制酸黃瓜和酸菜，遼寧沈陽農(nóng)家自制酸菜，遼寧錦州農(nóng)家自制酸菜；鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、Hela 細(xì)胞，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 MRS 液體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AB 培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、Taq PCR Master mix、DNA marker，生工生物工程（上海）股份有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素-鏈霉素雙抗，Gibco（美國）公司。

1.2 主要設(shè)備與儀器

DL-CJ-2N 超凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Bioscreen C 全自動生長曲線分析儀，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司：CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GI54DS 高壓滅菌鍋，至微儀器有限公司；IKAVortexGENIUS3 振蕩器，德國IKA 公司；MoticAE2000 倒置顯微鏡，北京榮興光恒科技有限公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；QuantityOne 凝膠成像系統(tǒng)、Imark 酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；ABIsteponeplus-PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)AI-2 乳酸菌的篩選 將活化后的乳酸菌以2%接種于MRS 培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)16 h，8 000 r/min 離心10 min，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，得到乳酸菌無細(xì)胞上清液。

按照燕彩玲等[12]、曹素芳等[13]、張騰等[14]的方法，采用哈維氏弧菌生物發(fā)光法測定乳酸菌產(chǎn)AI-2 活性。信號分子AI-2 的濃度用相對熒光強度表示。Ac為待測相對熒光強度；Ai為待測樣品的熒光強度值；Aj為介質(zhì)對照的熒光強度值。計算公式如下：

1.3.2 luxS 基因生物學(xué)鑒定 取1 mL 過夜培養(yǎng)的乳酸菌菌懸液，參照DNA 快速抽提試劑盒說明書提取乳酸菌DNA。參照張騰[15]的方法設(shè)計luxS引物與PCR 反應(yīng)體系和擴增條件。PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果，送至上海生物工程有限公司測序。

1.3.3 生長曲線的測定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液體培養(yǎng)基，將乳酸菌以2%接種于培養(yǎng)基中，使用全自動生長曲線儀于37 ℃每2 h 測定其OD600nm值。

1.3.4 耐酸能力的測定 將活化后的二代乳酸菌以2%的接種量接種于pH 值分別為1.5，2.5，3.5，4.5 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后移入96孔板中，測定其ODAi，以未作處理培養(yǎng)的乳酸菌ODAj作對照[16]。存活率計算公式：

1.3.5 耐膽鹽能力的測定 將活化后的二代乳酸菌以2%的接種量接種于體積分?jǐn)?shù)分別為1%，2%，3%，4%的含膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中[17]，測定方式同1.3.4 節(jié)。

1.3.6 抑菌能力的測定 利用雙層瓊脂擴散法測定篩選出的乳酸菌的抑菌能力[18]。以大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌為指示病原菌。在平板中加入10 mL 素瓊脂作為底層培養(yǎng)基，待其凝固后，將牛津杯放在其表面，然后將含有106CFU/mL 指示菌的LB 半固體培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)作為上層培養(yǎng)基，待其凝固后，將牛津杯取出，分別在孔內(nèi)加入180 μL 乳酸菌液，37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑。

1.3.7 生物膜形成能力的測定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液體培養(yǎng)基，將乳酸菌以2%接種于培養(yǎng)基中，置于37 ℃分別培養(yǎng)24，36 h 和48 h。棄上層培養(yǎng)液后，用PBS 清洗2～3 次去除浮游細(xì)胞，晾干后，加100 μL 結(jié)晶紫染色15 min，去除染液后用PBS 緩慢沖洗至無色。晾干后加入200 μL 33%冰醋酸脫色，搖勻。用多功能酶標(biāo)儀在OD595nm處測定其吸光度值[19]。

1.3.8 Hela 細(xì)胞黏附能力的測定 乳酸菌菌懸液的制備[20]：將活化后的2 株產(chǎn)AI-2 的乳酸菌和鼠李糖乳桿菌LGG（作為陽性對照）接種于MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，調(diào)整細(xì)菌濃度，使其在波長600 nm 處的吸光度為1 4000 r/min 離心10 min，收集菌體，用無菌PBS 洗滌3 次。最后用不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸。

黏附性測定[21-22]：在六孔板中預(yù)先放入20 mm×20 mm 的載玻片，將培養(yǎng)好的Hela 細(xì)胞調(diào)整至2×104cell/mL，接種到六孔板中使其貼壁生長，至細(xì)胞長成單層后用無菌PBS 洗滌2 次，每孔加入1 mL DMEM 和1mL 預(yù)先制備好的乳酸菌菌懸液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。六孔板用PBS 洗3 次，除去未黏附的乳酸菌，加入甲醛固定20 min，對載玻片進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下隨機取20 個視野，觀察并計算乳酸菌黏附數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 試驗均重復(fù)測定3 次，數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 23 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)AI-2 信號分子乳酸菌的篩選結(jié)果

用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法從200 多株乳酸菌中篩選到10 株可產(chǎn)生AI-2 信號分子的乳酸菌。圖1a 為乳酸菌菌株AI-2 的產(chǎn)生情況。在0 h，AI-2 是種間交流信號分子，剛加入的乳酸菌上清液中的信號分子未被指示菌識別，所檢測到的熒光強度是哈維氏弧菌所產(chǎn)生。0～4 h 內(nèi)，各組熒光強度逐漸下降，表明各組產(chǎn)生的信號分子未達(dá)到使指示菌發(fā)光的濃度，熒光強度在4 h 最低，之后逐漸升高，說明4 h 是報告菌株誘導(dǎo)發(fā)光的閾值時間，因此，以4 h 測定的熒光強度來計算最為準(zhǔn)確。本結(jié)果與蔡針華[23]的研究結(jié)果相近，各組發(fā)光強度均在4 h 達(dá)到最低點，相對熒光強度計算時間以孵育4 h 為基準(zhǔn)點。圖1b 為10 株乳酸菌的相對熒光強度。源自于酸菜的植物乳桿菌SCT-2 信號分子AI-2 產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其它乳酸菌，植物乳桿菌DL10 產(chǎn)量最低，且SCT-2 產(chǎn)量為DL10的8.7 倍。選擇以上兩株植物乳桿菌做后續(xù)試驗并比較。

2.2 luxS 基因生物學(xué)鑒定結(jié)果

圖2a 為兩株產(chǎn)AI-2 乳酸菌luxS 基因擴增后的電泳結(jié)果。目標(biāo)條帶約為477 bp，與NCBI 中植物乳桿菌luxS 基因大小相同，說明兩株乳酸菌都含有l(wèi)uxS 基因。將其序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，選取部分同源性較高的不同菌株，用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2b。高產(chǎn)AI-2 信號分子的SCT-2 與植物乳桿菌NMD-17 的luxS 基因有100%的同源性。低產(chǎn)信號分子的DL10 與植物乳桿菌KLDS1.0391 在同一分支且同源率達(dá)99%。

圖2 luxS 基因擴增后電泳結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Electrophoresis results after luxS gene amplification and phylogenetic tree

2.3 乳酸菌的生長曲線

圖3 顯示AI-2 產(chǎn)量不同的兩株乳酸菌24 h生長曲線。2 株乳酸菌的生長周期相似。2 h 時開始進(jìn)入對數(shù)生長期，10 h 時達(dá)到對數(shù)生長末期，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌密度在對數(shù)末期達(dá)到最大值，菌株SCT-2 在18 h 進(jìn)入生長衰退期，而DL10 菌體密度相對穩(wěn)定。排除生長特性的干擾即可做后續(xù)試驗。

圖3 2 株乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of two strains lactic acid bacteria

2.4 耐酸、耐膽鹽能力

益生菌對酸和膽鹽的抗性是選擇新益生菌候選物的基本特性，這種特性與菌株在胃腸道中的存活密切相關(guān)[24]。通常，只有很少細(xì)菌可以在pH 2.0 下存活，一部分在pH 3.0 下存活，在pH 4.0幾乎所有菌株僅可維持其初始種群的80%[25]。圖4a 顯示兩株乳酸菌在不同pH 下的存活率。兩株乳酸菌在pH 1.5 和2.5 時，存活率僅為12.7%和13.6%。當(dāng)pH 4.5 時，均表現(xiàn)出80%以上的存活率，其中高產(chǎn)AI-2 菌株SCT-2 存活率高出低產(chǎn)AI-2 菌株DL10 的8%左右。Rogers 等[26]研究了酸脅迫條件下，嗜酸乳桿菌NCFM 與鼠李糖桿菌GG的AI-2 活性變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著pH 的降低，AI-2 活性顯著增加，說明酸脅迫下，乳酸菌會產(chǎn)生更多AI-2 來應(yīng)對。這與本試驗結(jié)果大致相似，說明luxS 基因產(chǎn)生的AI-2 信號分子在抗酸脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖4 兩株乳酸菌體外對酸和膽鹽的耐受性分析Fig.4 Tolerance analysis of acid and bile salt tolerance of two strains lactic acid bacteria in vitro

膽汁鹽是阻礙細(xì)菌存活的另一個屏障，也是胃腸道細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)激的主要因素[27]。雖然體外條件與體內(nèi)情況不同，但是體外耐受能力測定可以反映菌株對膽鹽的抗逆性。圖4b 顯示兩株乳酸菌在不同膽鹽含量下的存活率。兩株產(chǎn)AI-2 的乳酸菌隨膽鹽濃度的升高，存活率顯著下降。在膽鹽含量為0.1%時，兩株乳酸菌均表現(xiàn)出良好的存活率。當(dāng)膽鹽含量為0.3%和0.4%時，高產(chǎn)AI-2 的SCT-2 存活率為65.2%，高出DL10 存活率20%?？傮w看來，SCT-2 對膽鹽的抗性顯著高于DL10，說明產(chǎn)AI-2 能力好的菌株，其耐膽鹽能力也更好。這與Jiang 等[28]的研究結(jié)果相似，植物乳桿菌YM-4-3 在生長對數(shù)期時，可耐受0.4%膽汁，而穩(wěn)定生長期只能耐受0.2%膽汁，且luxS 基因的表達(dá)也隨植物乳桿菌YM-4-3 的生長而減少，表明AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控乳酸菌對膽鹽的耐受性。

2.5 抑菌能力

表1 列出兩株乳酸菌對單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌抑菌的能力，結(jié)果表明，產(chǎn)AI-2 的乳酸菌對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有不同程度的抑制能力（P＜0.05）。低產(chǎn)AI-2 的菌株DL10 對單增李斯特菌和嗜水氣單胞菌的抑菌直徑為（15.93±0.26）mm 和（15.80±0.13）mm，在4 種指示菌中抑制率明顯低于高產(chǎn)AI-2 的SCT-2。SCT-2 對單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑菌直徑為17.50～19.43 mm，表明高產(chǎn)AI-2 信號分子的植物乳桿菌SCT-2 具有較強的抑菌作用。

表1 2 株乳酸菌的抑菌能力Table 1 Bacteriostatic ability of two strains of lactic acid bacteria

2.6 生物膜形成能力

生物膜是一種復(fù)雜的微生物基質(zhì)。細(xì)胞和胞外多糖、蛋白質(zhì)等其它有機成分附著在生物或非生物表面可形成生物膜[29]。細(xì)菌形成的成熟生物膜可以抵抗紫外線、pH 值、滲透壓等外界不利因素，并降低對常規(guī)抗菌藥物的敏感性。圖5a 顯示兩株乳酸菌在不同時間生物膜的形成能力。隨著時間的延長，生物膜產(chǎn)量逐漸增多，且高產(chǎn)AI-2的菌株SCT-2 在3 個時期生物膜的形成顯著高于低產(chǎn)AI-2 的菌株DL10（P＜0.05），生物膜產(chǎn)量平均提高111.4%。高產(chǎn)AI-2 的SCT-2 生物被膜形成能力更強，而低產(chǎn)AI-2 的DL10 的生物被膜形成能力較弱。E 等[30]研究顯示，植物乳桿菌LIP-1的AI-2 信號分子上調(diào)可促進(jìn)生物膜的形成。與本研究結(jié)果相似，說明AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)正向調(diào)控乳酸菌生物膜的形成。

圖5 兩株乳酸菌在不同時間的生物膜形成能力和細(xì)胞黏附能力Fig.5 Biofilm forming ability and cells adhesion ability of two strains lactic acid bacteria at different times

2.7 Hela 細(xì)胞黏附能力測定

乳酸菌的黏附能力是發(fā)揮益生作用的首要條件[31]。蘇帥等[32]以人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞為黏附模型，以黏附能力較強的鼠李糖乳桿菌LGG 為陽性對照菌株，對乳酸菌的體外黏附能力進(jìn)行評估，結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌和長雙歧桿菌單獨或聯(lián)合使用在HT-29 細(xì)胞上都表現(xiàn)出良好的黏附性。圖5b為3 株乳酸菌對Hela 細(xì)胞黏附的結(jié)果，在光鏡下觀察Hela 細(xì)胞無明顯變化，且所篩選的產(chǎn)AI-2乳酸菌不同程度地黏附在Hela 細(xì)胞周圍。其中高產(chǎn)AI-2 乳酸菌SCT-2 黏附數(shù)量最多，達(dá)到102 CFU/細(xì)胞，與陽性對照相比，黏附率提高17.4%，且達(dá)到DL10 黏附數(shù)量的3 倍，黏附能力最強。低產(chǎn)AI-2 乳酸菌DL10 黏附數(shù)量最少，黏附能力最差。Jia 等[33]研究表明luxS 缺失的乳酸桿菌對Caco-2 細(xì)胞的黏附能力降低，且luxS 與乳酸桿菌對胃腸環(huán)境的高耐受性相關(guān)。這與本結(jié)果相似。推測AI-2 產(chǎn)生量與乳酸菌黏附能力呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

乳酸菌具有抑菌、抗癌、改善腸道菌群等益生功能，是食品工業(yè)中的重要菌種。作為細(xì)菌種間交流的特殊信號分子AI-2，具有調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、相關(guān)基因的表達(dá)等生理功能。本研究篩選獲得1 株高產(chǎn)AI-2 的植物乳桿菌SCT-2 和低產(chǎn)AI-2的植物乳桿菌DL10。通過驗證確定兩株植物乳桿菌中均存在調(diào)控AI-2 合成的luxS 基因。與低產(chǎn)AI-2 乳酸菌比較，高產(chǎn)AI-2 植物乳桿菌SCT-2的生物膜產(chǎn)量、耐酸性、耐膽鹽、抑菌率與細(xì)胞黏附性等特性均有提高。綜上所述，AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)具有調(diào)控乳酸菌的生物膜形成能力、耐膽鹽性、抑菌能力及細(xì)胞黏附性等益生特性。