黑豆納豆激酶粗提取物的免疫調(diào)節(jié)作用

田玥瑋，張永坡*，高春艷，趙晉忠，杜維俊

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部 山西晉中030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山西晉中 030801）

納豆是以煮熟的大豆為原料，通過接種納豆菌發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)保健食品[1]，除了含有納豆激酶、SOD、異黃酮等多種活性物質(zhì)外，還富含氨基酸、有機酸、寡聚糖等有益于人體腸道健康的營養(yǎng)成分[2]。近年來，由于人們越來越關(guān)注納豆類產(chǎn)品的保健功能，國內(nèi)外學(xué)者研究了納豆及其主要活性物質(zhì)納豆激酶的多種功能作用[3]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有治療心血管疾病[4]、溶解血栓[5]、降血壓[6]、抗癌[7]、抗氧化[8]等保健功能。黑豆含有多酚、花色苷、黃酮等多種活性物質(zhì)，相對于黃豆含量更高，因此黑豆更具藥用價值[9]。研究表明，食用黑豆能夠增加多酚濃度，有助于改善血管功能，并通過減少人體氧化應(yīng)激，從而降低患心血管疾病的風(fēng)險[10]。本文以壺關(guān)大黑豆為原料，發(fā)酵制備提取納豆激酶粗提取物，得到黑豆納豆激酶粗提取物（Black bean nattokinase crude extract，BNCE）。

動物實驗表明，納豆激酶通過口服給藥能減少大鼠頸動脈形成的血栓質(zhì)量，具有顯著的溶栓效果[11]。本文以不同濃度的BNCE 進(jìn)行處理，研究其對小鼠的體外溶栓作用，以期為黑豆納豆激酶溶栓作用的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物成分對RAW264.7 細(xì)胞具有免疫促進(jìn)[12]或免疫抑制[13]或二者兼具的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[14]。目前關(guān)于納豆激酶的免疫調(diào)節(jié)作用尚未見報道。為研究BNCE對細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響，本研究以RAW264.7 細(xì)胞為試驗?zāi)Ｐ停芯緽NCE 對正常狀態(tài)及脂多糖（LPS）激活狀態(tài)下RAW264.7 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為納豆激酶的免疫調(diào)節(jié)作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

壺關(guān)大黑豆，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室；RAW264.7 細(xì)胞，天津醫(yī)科大學(xué)。

1.2 主要試劑

納豆菌粉，尚川生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），阿拉丁公司；氯化鈉、硫酸銨、溴化鉀、乙醇、冰乙酸，天津大茂化學(xué)試劑廠；纖維蛋白原、尿激酶、凝血酶、瓊脂、RPMI Medium 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂多糖（LPS）、噻唑藍(lán)（MTT）、中性紅染色液、小鼠白細(xì)胞介素-6 試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α 試劑盒、小鼠白介素-1β試劑盒，北京索萊寶有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

儀器及設(shè)備詳見表1。

表1 儀器及設(shè)備一覽表Table 1 List of instruments and equipment

1.4 試驗方法

1.4.1 BNCE 的制備、提取與分離 將黑豆仔細(xì)挑選并稱取25 g，用蒸餾水清洗2～3 遍以除去表面雜質(zhì)，加入100 mL 蒸餾水浸泡過夜。浸泡好的黑豆放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃滅菌30 min 后取出，冷卻至30～40 ℃。稱取0.3 g 納豆菌粉，采用直投式納豆芽孢桿菌的方法，用40 ℃左右的蒸餾水溶解納豆菌粉，充分溶解后均勻地接種到黑豆上以保證黑豆表面均有菌液。將接種后的黑豆放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度37 ℃，濕度70%，發(fā)酵18 h。把發(fā)酵好的黑豆放入4 ℃冰箱后熟24 h，得到黑納豆成品。

將黑納豆成品放入-20 ℃冰箱預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥，干燥后用粉碎機打粉并過篩得到黑納豆凍干粉。稱取適量黑納豆凍干粉，并與生理鹽水按照1∶10（g/mL）的料液比混勻，混勻后的溶液放入4 ℃冰箱靜置12 h。之后在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心10 min，棄掉沉淀，保留上清，即為黑豆納豆激酶粗提取液。

向20 mL 黑豆納豆激酶粗提取液中緩慢加入固體硫酸銨使其終濃度達(dá)到20%飽和度（110 g/L）[11]，放入4 ℃冰箱靜置12 h。之后在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心10 min，棄掉沉淀，保留上清。向上述得到的上清中緩慢加入固體硫酸銨使其終濃度達(dá)到60%飽和度（360 g/L），同樣靜置、離心，棄掉上清，保留沉淀。將最終得到的沉淀進(jìn)行冷凍干燥，然后在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆茫纯傻玫胶诙辜{豆激酶粗提取物（Black bean nattokinase crude extract，BNCE）。

1.4.2 BNCE 的結(jié)構(gòu)初探 通過紅外光譜分析和掃描電鏡探究BNCE 的結(jié)構(gòu)。稱取適量BNCE 樣品與溴化鉀粉末按質(zhì)量比1∶100 混合，充分研磨后壓片，用紅外光譜儀在波長400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描采集數(shù)據(jù)，通過傅里葉紅外光譜法測定BNCE 的特征吸收峰。將冷凍干燥后的BNCE 粉末粘到銅質(zhì)樣品臺上，吹去未粘牢的樣品粉末，然后對樣品表面進(jìn)行噴金，通過掃描電鏡觀察BNCE 的表面形狀和結(jié)構(gòu)。

1.4.3 BNCE 酶活的測定 采用纖維蛋白平板法測定BNCE 的酶活。稱取25 mg 纖維蛋白原并用10 mL 生理鹽水充分溶解，緩慢均勻地加入并不斷攪拌至澄清，得到乳白色的纖維蛋白原溶液（2.5 mg/mL）。稱取0.15 g 瓊脂粉用10 mL 生理鹽水溶解，加熱使瓊脂粉完全溶解得到瓊脂溶液（1.5%），并于60 ℃水浴保溫。向裝有1 000 U 的凝血酶粉末管中加入1 mL 生理鹽水，充分溶解并稀釋得到25 U/mL 的凝血酶溶液。

先將上述配好的10 mL 纖維蛋白原溶液和10 mL 瓊脂溶液混勻后倒入培養(yǎng)皿，后向培養(yǎng)皿中加入1 mL 凝血酶溶液，并快速攪拌使其混勻，在攪拌過程中要防止氣泡產(chǎn)生。靜置冷卻，待培養(yǎng)皿中溶液完全凝固方可制成纖維蛋白平板。點樣時，在平板上打出小孔并吸出小孔里的液體，再向打好的小孔中加入20 μL 待測溶液。點樣完成后，將纖維蛋白平板放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度37 ℃，濕度70%，反應(yīng)18 h。反應(yīng)結(jié)束后對平板上小孔周圍溶解圈的直徑進(jìn)行測量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

以尿激酶作為陽性對照，把酶活為50 000 U/g的尿激酶粉末用生理鹽水分別配制成1 000，800，600，400，200，100，50 U/mL 的濃度。按照上述方法，打好小孔后，每孔加入20 μL 尿激酶溶液，反應(yīng)后對溶解圈的直徑進(jìn)行測量，計算面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 BNCE 的溶栓率測定 動物血塊法檢測BNCE 的體外溶栓作用。取多份新鮮小鼠血液于2 mL 離心管中，靜置使其凝固，將血凝塊吸干多余水分后分別稱重，并同時放入相應(yīng)的離心管中。稱取適量BNCE 樣品，用生理鹽水溶解稀釋至156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/mL，以生理鹽水作為對照。將配制好的樣品溶液各取1 mL加入裝有血凝塊的離心管中，于37 ℃條件下水浴，在作用4 h 和8 h 后，將血凝塊取出吸干多余水分，分別稱重并計算樣品作用4 h 和8 h 后的溶栓率。溶栓率計算公式如下：

式中，m——溶解前血凝塊質(zhì)量（g）；m0——溶解后血凝塊質(zhì)量（g）。

1.4.5 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響 采用MTT 比色法探究BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響。RAW264.7 細(xì)胞用1640 培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%～90%時，消化傳代，2～3 代后方可進(jìn)行試驗處理。將細(xì)胞按1×105個/mL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后分組。1）正常狀態(tài)下的細(xì)胞：①空白對照組：只加培養(yǎng)基；②LPS 組：加入終濃度為2.5 μg/mL 的LPS；③BNCE 處理組：加入不同質(zhì)量濃度的BNCE 進(jìn)行處理（經(jīng)過試驗初篩最終選取6個BNCE終質(zhì)量濃度：15.625，30.25，62.5，125，250，500 μg/mL）；2）LPS 激活狀態(tài)下的細(xì)胞：①空白對照組：只加培養(yǎng)基；②LPS 組：加入終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 的LPS；③LPS+BNCE 處理組：加入與正常狀態(tài)BNCE 處理組相同濃度的BNCE 進(jìn)行處理后，再加入終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 的LPS。細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后，向每孔加入10 μL 的MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μL 的DMSO，振蕩10 min 后，使用酶標(biāo)儀在570 nm 波長處對其吸光度進(jìn)行檢測，計算細(xì)胞相對增殖率，每孔設(shè)置3 個復(fù)孔取平均值。細(xì)胞相對增殖率計算公式如下：

1.4.6 時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響 采用MTT 比色法探究時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響。按照上述試驗分組，加入相對應(yīng)的藥物處理后，分別培養(yǎng)12，24，36 h。再向每孔中加入10 μL的MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μL DMSO，振蕩10 min 后，使用酶標(biāo)儀在570 nm 波長處檢測吸光度，并計算細(xì)胞相對增殖率，每孔設(shè)置3 個復(fù)孔取平均值，比較不同培養(yǎng)時間分別對細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞相對增殖率按式（2）計算。

1.4.7 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞吞噬率的影響

采用中性紅染色法探究BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞吞噬率的影響。將細(xì)胞按1×105個/mL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后按照上述試驗分組，加入相對應(yīng)的藥物處理，培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，向每孔100 μL 0.1%中性紅溶液繼續(xù)培養(yǎng)，30 min 后棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2～3 次。再向每孔加入100 μL 裂解液（乙醇∶冰乙酸體積比為1∶1），4 ℃靜置過夜，使用酶標(biāo)儀在540 nm波長處檢測吸光度。細(xì)胞吞噬率計算公式如下：

1.4.8 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6、TNFα 和IL-1β 的影響 采用ELISA 法探究BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的影響。細(xì)胞按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)處理，收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，測定細(xì)胞各因子的濃度水平。

1.4.9 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果采用Excel 和Graph Pad Priam 8 分析，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BNCE 的結(jié)構(gòu)

BNCE 的紅外光譜吸收峰如圖1 所示，3 342.94 cm-1寬峰是N-H 鍵伸縮振動峰，2 928.99 cm-1處的峰是C-H 鍵伸縮振動峰。1 655.21，1 553.89，1 243.78 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶，進(jìn)一步說明分離出的BNCE 成分具有蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[15]。1 402 cm-1處的峰是C-H 鍵的變形振動峰，1 079.39 cm-1是C-O 伸縮振動吸收峰。在900 cm-1以下，有619.19 cm-1一個指紋特征峰。

圖1 BNCE 的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of BNCE

掃描電鏡下BNCE 表觀形貌如圖2 所示。400 倍下，BNCE 呈團(tuán)狀分布，表面附著微小碎片；3 500 倍下，BNCE 表觀呈大小不同且無規(guī)則的碎片形狀，碎片表面光滑。

圖2 BNCE 的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of BNCE

2.2 BNCE 的酶活

按照1.4.3 的方法制備所得的纖維蛋白平板，初始為不透明的乳白色，點樣后小孔周圍呈現(xiàn)透明的溶解圈，其原因是纖溶性物質(zhì)會逐漸溶解纖維蛋白，從而導(dǎo)致乳白色消失[16]。以尿激酶酶活（U/mL）為橫坐標(biāo)，尿激酶在纖維蛋白平板上的溶解圈面積（mm2）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.189x+349.55。不同尿激酶濃度所對應(yīng)的溶解圈面積如表2 所示，尿激酶酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 所示。該方程表明尿激酶酶活與纖維蛋白平板上的溶解圈面積呈線性關(guān)系，因此可以作為衡量樣品纖溶活性的指標(biāo)。BNCE 在纖維蛋白平板上的溶解圈如圖4 所示。將BNCE 在纖維蛋白平板上的溶解圈面積代入方程，計算得到BNCE 酶活為6 148 U/g。

圖3 尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of urokinase activity

圖4 BNCE 在纖維蛋白平板上的溶解圈Fig.4 The dissolving ring of BNCE on a fribin plate

表2 不同濃度的尿激酶所對應(yīng)的溶解圈面積Table 2 Fribin plate area corresponding to urokinase of different concentrations

2.3 BNCE 的溶栓作用

不同質(zhì)量濃度BNCE 樣品對小鼠體外血凝塊的溶解時間與溶栓率見圖5。由圖5 可見，隨著質(zhì)量濃度的增加，BNCE 的溶栓作用逐漸增強，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性；隨著時間的延長，BNCE的溶栓作用也逐漸增強，表現(xiàn)出一定的時間依賴性。因此，BNCE 具有一定的體外溶栓作用。

圖5 不同濃度的BNCE 對小鼠體外血凝塊的溶解率Fig.5 Thrombolysis rate of BNCE with different concentration on blood clot in vitro in mice

2.4 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO 能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀測定其吸光度（OD）值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，OD 值越大，說明活細(xì)胞的數(shù)量越多[17]。表3 的結(jié)果表明，在正常狀態(tài)下，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的升高，RAW264.7 細(xì)胞的相對增殖率呈上升趨勢。加入LPS 刺激后，RAW264.7 細(xì)胞的相對增殖率仍具有濃度依賴性。MTT 試驗結(jié)果表明，在正常狀態(tài)和LPS 激活狀態(tài)下，BNCE 質(zhì)量濃度在15.625～500 μg/mL 范圍內(nèi)，各濃度對RAW264.7 細(xì)胞均有促增殖作用，無細(xì)胞毒性。

表3 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Table 3 Effects of BNCE on the proliferation in RAW264.7 cells

表4 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞吞噬率的影響Table 4 Effects of BNCE on the phagocytosis rate of RAW264.7 cells

2.5 時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響

基于BNCE 對細(xì)胞會促增殖且無毒性的影響，進(jìn)而研究了在正常狀態(tài)和LPS 激活狀態(tài)下，時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖6 所示，無論在正常狀態(tài)（a）還是LPS 激活狀態(tài)（b）下，24 h 時RAW264.7 細(xì)胞的增殖率均為最大。因此，選取24 h 為最佳作用時間。

圖6 時間對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of time on the proliferation in RAW264.7 cells

2.6 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞吞噬率的影響

RAW264.7 細(xì)胞是一種具有重要功能的吞噬細(xì)胞，在清除異物和病原體方面發(fā)揮重要作用。在病原體入侵或自身組織發(fā)生病理性變化時，它能發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)殺傷作用從而消滅抗原。吞噬率是衡量RAW264.7 細(xì)胞活性的一個重要指標(biāo)[18]。由表6可得，LPS（2.5 μg/mL）刺激后的細(xì)胞吞噬率是對照組的1.5 倍。與對照組相比，BNCE 在質(zhì)量濃度為15.625～500 μg/mL 時，RAW264.7 細(xì)胞的吞噬率增加且具有濃度依賴性。以上結(jié)果說明BNCE能夠增強RAW264.7 細(xì)胞的吞噬率，對機體的免疫調(diào)節(jié)具有重要作用。

2.7 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥IL-6、TNF-α 和IL-1β 的影響

炎癥細(xì)胞因子是指參與炎癥反應(yīng)的各種細(xì)胞因子。眾多炎癥細(xì)胞因子中，在免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)中起主要作用的是IL-6、TNF-α、IL-1β[19]等。

IL-6 是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，它參與機體的免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，對機體的防御起重要作用[20]。由圖7 可見，與對照組相比，隨著BNCE質(zhì)量濃度的增加，IL-6 的分泌量逐漸降低，表明BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6 具有抑制作用。與LPS 組相比，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的增加，IL-6 的分泌量先降低后增加，在質(zhì)量濃度為125 μg/mL 時，IL-6 的分泌量達(dá)到最小值，且質(zhì)量濃度為62.5～500 μg/mL 時，IL-6 分泌量的水平均沒有高于LPS 組，表示BNCE 能夠降低IL-6 分泌量的水平，并能抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖7 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6 的影響Fig.7 Effects of BNCE on the production of IL-6 in RAW264.7 cells

TNF-α 是一種單核因子，主要由活躍的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，并且能促進(jìn)這些細(xì)胞分泌及表達(dá)IL-6、IL-1β、膠原酶和黏附分子等，更能反映機體的炎癥反應(yīng)，在免疫功能中起著至關(guān)重要的作用[21]。由圖8 可見，與對照組相比，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的增加，TNF-α 的分泌量先增加后降低，在質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時，TNF-α 的分泌量達(dá)到最大值，且質(zhì)量濃度為62.5～250 μg/mL時，TNF-α 的分泌量有濃度依賴性，表明BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 具有促進(jìn)作用。與LPS 組相比，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的增加，TNF-α的分泌量降低并呈現(xiàn)出濃度依賴性，表示BNCE能夠有效降低TNF-α 分泌量的水平，并有效抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖8 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的影響Fig.8 Effects of BNCE on the production of TNF-α in RAW264.7 cells

IL-1β 既參與多種細(xì)胞活動，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡，還可活化T 細(xì)胞、B 細(xì)胞，促進(jìn)多種免疫分子相關(guān)基因表達(dá)，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[22]。由圖9 可見，與對照組相比，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的增加，IL-1β 的分泌量增加并呈現(xiàn)出濃度依賴性，表明BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 具有促進(jìn)作用。與LPS 組相比，隨著BNCE 質(zhì)量濃度的增加，IL-1β 的分泌量降低并呈現(xiàn)出濃度依賴性，表示BNCE 能夠有效降低IL-1β 分泌量的水平，并有效抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，與其對TNF-α 的抑制作用結(jié)果類似。

圖9 BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 的影響Fig.9 Effects of BNCE on the production of IL-1β in RAW264.7 cells

RAW264.7 細(xì)胞活化后會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、酶類和促炎介質(zhì)，對微生物和腫瘤細(xì)胞具有強大的殺傷作用，然而若受到過多內(nèi)毒素的刺激，可能會出現(xiàn)顱腦損傷、心肌缺血、局部或全身炎癥反應(yīng)以及某些其它疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，部分天然產(chǎn)物成分對人體有一種雙向的免疫調(diào)節(jié)功能，可使機體的免疫功能從過高或過低的水平恢復(fù)到正常水平[23]。這些天然產(chǎn)物不僅是一種免疫激活劑，可提高機體的免疫水平，同時也可以作為一種免疫抑制劑，能夠在一定程度上避免機體的免疫系統(tǒng)因免疫過度而受損。上述結(jié)果顯示，BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-1β 具有類似的雙向免疫調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

從黑豆納豆中提取得到的BNCE 具有蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，表觀呈現(xiàn)大小不同且無規(guī)則的碎片形狀，具有一定的纖溶活性。體外溶栓作用試驗結(jié)果表明：BNCE 的溶栓作用具有一定的濃度依賴性和時間依賴性。以RAW264.7 細(xì)胞作為試驗?zāi)Ｐ?，研究BNCE 對RAW264.7 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明：1）BNCE 在質(zhì)量濃度為15.625～500 μg/mL，作用時間為24 h 時，可以促進(jìn)正常狀態(tài)以及LPS 激活狀態(tài)下RAW264.7 細(xì)胞的增殖，無細(xì)胞毒性，并且能增強RAW264.7 細(xì)胞的吞噬率，具有濃度依賴性；2）BNCE 在質(zhì)量濃度為62.5～500 μg/mL 時，可以活化正常狀態(tài)下的RAW264.7 細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的分泌，具有一定的濃度依賴性，這表明BNCE 能夠提高機體的免疫水平，是一種免疫激活劑；3）BNCE 在質(zhì)量濃度為62.5～500 μg/mL 時，不僅能抑制正常狀態(tài)下的RAW264.7 細(xì)胞IL-6 的分泌，也能抑制LPS 激活狀態(tài)下RAW264.7 細(xì)胞IL-6、TNF-α 和IL-1β 的分泌，這表明BNCE 在一定程度上也能夠防止免疫過度造成的機體損傷，是一種免疫抑制劑。有關(guān)溶栓作用和免疫調(diào)節(jié)的進(jìn)一步作用機制，仍需通過后續(xù)試驗繼續(xù)探究。