茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌致病力的抑制作用

張德福，閆天慧，，勵(lì)建榮，楊秋紅，艾曉輝，董 靖*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所 武漢 420223）

水產(chǎn)品是重要的動(dòng)物蛋白來(lái)源之一[1]。魚肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白質(zhì)和富含人體必需微量營(yíng)養(yǎng)素等優(yōu)點(diǎn)，有助于均衡營(yíng)養(yǎng)和健康[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖是全球發(fā)展最快的動(dòng)物性食品生產(chǎn)部門，在全球糧食安全中占有至關(guān)重要的地位[2]。隨著人們生活水平的提高和對(duì)水產(chǎn)品需求的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖在世界范圍內(nèi)迅速發(fā)展。自2000 年以來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖方式趨向于集約化，然而隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各類傳染性疾病在水產(chǎn)養(yǎng)殖中頻繁暴發(fā)[1]，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)水產(chǎn)品的食品安全和人類健康造成潛在威脅[3]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是廣泛分布于淡水養(yǎng)殖環(huán)境中的一種人-畜-魚共患致病菌，已經(jīng)成為一種重要的食源性病原菌。其既可以導(dǎo)致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物患病，還可以通過(guò)受污染的水、患病魚等導(dǎo)致人類感染敗血癥、腸道感染、腹瀉、皮膚病等疾病[4]。目前，已有從水環(huán)境、飲用水、廢水甚至魚、蝦、肉、牛奶和蔬菜等多種食品中分離出該菌的報(bào)道[5]?？刂剖人畾鈫伟鷮?dǎo)致的食源性疾病非常重要。

嗜水氣單胞菌有多種毒力因子參與其致病力，如氣溶素、溶血素、腸毒素和生物被膜等。其中，氣溶素是嗜水氣單胞菌分泌的一種蛋白毒素，并且是嗜水氣單胞菌主要的毒力因子之一，具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性[10]。氣溶素的成孔機(jī)制已被清晰闡述[11]，氣溶素經(jīng)胰蛋白酶或其它蛋白酶活化后，方具有活性，活化的氣溶素可結(jié)合到上皮細(xì)胞等敏感細(xì)胞表面，并形成具有孔道結(jié)構(gòu)的七聚體，從而破壞細(xì)胞膜的通透性屏障而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。以氣溶素為靶標(biāo)進(jìn)行藥物篩選，有望成為抗耐藥性嗜水氣單胞菌感染藥物研發(fā)的新路徑。

茶多酚是存在于茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包含兒茶素類、黃酮類、酚酸類等成分，其中兒茶素是其主體成分[12]。大量學(xué)者對(duì)茶多酚的相關(guān)研究表明，茶多酚具有降脂、減肥、調(diào)血脂、殺菌、消炎、抗病毒、保肝、護(hù)肝等作用[13]。余春燕等[12]發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)外源膳食補(bǔ)充茶多酚來(lái)預(yù)防人與動(dòng)物的心肌相關(guān)疾病。張蒙等[14]發(fā)現(xiàn)氧化型茶多酚可以通過(guò)改變高脂飲食老年大鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改善大鼠的健康狀況。朱娜等[15]發(fā)現(xiàn)茶多酚中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯是抑菌的主要成分，并對(duì)飲用水具有一定消毒效果。為研究抗嗜水氣單胞菌感染的天然藥物，本研究通過(guò)生長(zhǎng)曲線、溶血活性、熒光熱漂移、七聚體形成和體內(nèi)、外致病力評(píng)價(jià)等試驗(yàn)，研究了茶多酚的抗嗜水氣單胞菌感染作用，為以茶多酚為主要成分的藥物研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 由本實(shí)驗(yàn)室保存；茶多酚、恩諾沙星，中國(guó)食品藥品檢定研究院；脫纖維羊血，南京茂捷微生物科技有限公司；乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒、活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒、ECL試劑盒，上海翌圣生物科技股份有限公司；純化氣溶素由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)原核表達(dá)純化獲得并保存；抗氣溶素多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（ZDS-1160）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZHWY-100B），上海智成分析儀器制造有限公司；搖床振蕩器（TS-1000），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀（680），美國(guó)伯樂(lè)公司；分光光度計(jì)（UV-1600PC），德潤(rùn)誠(chéng)生物科技有限公司；高速微量離心機(jī)（D2012），大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiScope6000Exp），上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 最小抑菌濃度測(cè)定

采用微量稀釋法測(cè)定茶多酚、恩諾沙星2 種藥物對(duì)嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）[16]。用MHB 培養(yǎng)基對(duì)藥物進(jìn)行二倍稀釋，茶多酚質(zhì)量濃度由512 μg/mL 稀釋至2 μg/mL，恩諾沙星質(zhì)量濃度由32 μg/mL 稀釋至0.125 μg/mL，每孔中培養(yǎng)基體積為100 μL。嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 在28 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，10 000×g 離心1 min 收集菌體，菌體經(jīng)PBS 洗滌后，用MHB 調(diào)整濃度至為5×105CFU/mL。向每孔中加入100 μL 菌液，并設(shè)置對(duì)照。以不長(zhǎng)菌的孔中最低的藥物濃度作為該藥的MIC。

1.4 生長(zhǎng)曲線

從培養(yǎng)皿中無(wú)菌挑取XS-91-4-1 單菌落，在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1%比例將培養(yǎng)好的菌液加入到100 mL 新鮮的培養(yǎng)基中，在28 ℃搖床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.3。分別取20 mL 菌液分裝至5 個(gè)玻璃錐形瓶中加入128，64，32，16，0 μg/mL 質(zhì)量濃度的茶多酚，不加藥物的菌液作為陰性對(duì)照。28 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h，用分光光度計(jì)每30 min 記錄1 次OD600nm吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 溶血試驗(yàn)

1.5.1 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物上清液的溶血試驗(yàn)將嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 在28 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nnm=0.3，將菌液分裝于6 個(gè)無(wú)菌錐形瓶中，分別加入16，8，4，2，1，0 μg/mL 質(zhì)量濃度的茶多酚，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至嗜水氣單胞菌與茶多酚共培養(yǎng)體系OD600nm=1.5 時(shí)，10 000×g 離心1 min 收集菌液上清。向菌液上清中加入胰蛋白酶（20 μg/mL），在室溫條件下作用10 min，使菌液上清中的氣溶素活化。

秦風(fēng)在班上一如既往地沉默，可能他真的不喜歡說(shuō)話，努力幾次后，我也有些“心有余而力不足”的挫敗感。每一次都是我滔滔不絕地說(shuō)了半天，他就回應(yīng)我一個(gè)字——“嗯”，實(shí)在是讓人崩潰。有同學(xué)在背后叫他“悶葫蘆”，我覺(jué)得很形象，但為了團(tuán)結(jié)，還是阻止大家這樣叫他，或許他需要時(shí)間來(lái)適應(yīng)吧。

溶血試驗(yàn)在1.5 mL 離心管中進(jìn)行，溶血體系由875 μL 溶血緩沖液，100 μL 胰蛋白酶處理后的菌液上清和25 μL 脫纖維綿羊紅細(xì)胞組成，充分混勻后在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，然后通過(guò)離心（10 000×g，1 min）去除未裂解的紅細(xì)胞，取上清液用分光光度計(jì)測(cè)定OD543nm處的吸光值。將只加溶血緩沖液和紅細(xì)胞的試驗(yàn)組作為陰性對(duì)照組，0.1%Triton X-100 處理的紅細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.5.2 純化氣溶素的溶血試驗(yàn) 根據(jù)之前的研究[17]用純化的氣溶素測(cè)定茶多酚對(duì)氣溶素溶血活性的影響。茶多酚與純化氣溶素的反應(yīng)體系為1 mL，首先向離心管中加入溶血緩沖液975 μL、純化氣溶素（5 μg/mL）和終質(zhì)量濃度分別為16，8，4，2，1，0 μg/mL 的茶多酚，放入37 ℃培養(yǎng)箱中10 min，使氣溶素與藥物充分反應(yīng)，然后加入25 μL脫纖維綿羊紅細(xì)胞，充分混勻后，在37 ℃反應(yīng)15 min。

1.6 免疫印記試驗(yàn)

取1.5.1 中激活的菌液上清作為免疫印跡試驗(yàn)樣品，上清液用BCA 總蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品中的總蛋白濃度。取適量樣品與蛋白上樣緩沖液混勻，在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，簡(jiǎn)短離心（3 000×g，1 min）后，取20 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后將凝膠上的蛋白通過(guò)半干法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)印后的膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入抗嗜水氣單胞菌氣溶素抗體常溫（25 ℃）反應(yīng)1 h，TBST 洗滌5 次后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗反應(yīng)1 h，洗滌后使用ECL 試劑檢測(cè)。

1.7 熒光熱漂移試驗(yàn)

熒光熱漂移試驗(yàn)采用Protein Thermal Shift染料試劑盒，并按說(shuō)明書操作。向八排管中加入Thermal Shift 緩沖液5 μL，8×Thermal Shift Dye 2.5 μL，純化氣溶素（終質(zhì)量濃度10 μg/mL）1 μL和茶多酚（終質(zhì)量濃度32 μg/mL）0.6 μL，添加氣溶素儲(chǔ)存緩沖液，使反應(yīng)體系補(bǔ)足20 μL，0.6 μL DMSO 組作為陰性對(duì)照。將體系混勻后，將八排管置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上，以1.6 ℃/min 的速度從25 ℃加熱到90 ℃，在Ex/Em=490/530 處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.8 七聚體形成試驗(yàn)

按Iacovache 等[18]報(bào)道的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生七聚體。取質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的激活氣溶素20 μL，加入到1.5 mL 離心管中，向每管中按比例加入相同體積的茶多酚，使體系中氣溶素與茶多酚的物質(zhì)的量的比與1.5.2 溶血試驗(yàn)一致。將混合好的反應(yīng)體系置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10 min，然后加入pH 值為7.2 的HEPES 緩沖液，繼續(xù)將混合物在室溫條件下靜置孵育1 h，聚丙烯酰胺凝膠電泳（8%）后觀察分析。

1.9 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.9.1 LDH 釋放試驗(yàn) 人肺上皮細(xì)胞（A549）生長(zhǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）中，細(xì)胞置于37 ℃含有5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)48 h。生長(zhǎng)好的細(xì)胞加入濃度為0.25%的胰蛋白酶消化，用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸并按1.5×105個(gè)/孔接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃，5%CO2的條件下繼續(xù)培 養(yǎng)16 h 備用。5 μg/mL活化氣溶素加入茶多酚使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到32，16，8，4，0 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置反應(yīng)10 min 后，加入到細(xì)胞中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心（1 000×g，5 min）取上清液，按試劑盒操作步驟加入試劑，反應(yīng)30 min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm 處的吸光度。

1.9.2 細(xì)胞染色 取1.9.1 LDH 試驗(yàn)后的細(xì)胞，用無(wú)菌PBS 洗滌3 次，加入活/死細(xì)胞染色試劑后，置于暗處反應(yīng)30 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞圖像并拍照。

1.10 試驗(yàn)治療學(xué)

將90 尾體質(zhì)量為（150±10）g 斑點(diǎn)叉尾鮰隨機(jī)分為3 組，每組30 尾，飼養(yǎng)于200 L 的玻璃缸中，保持水溫為（28±2）℃，溶解氧5.5～5.8 mg/L，分組后在該環(huán)境下暫養(yǎng)10 d。嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 在LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600nm=1，離心收集菌體；洗滌后將菌液用無(wú)菌PBS 調(diào)整至1.5×108CFU/mL。茶多酚組和陽(yáng)性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)魚分別通過(guò)腹腔注射200 μL 菌液，陰性對(duì)照組注射相同體積的無(wú)菌PBS，建立嗜水氣單胞菌感染模型。茶多酚組在感染后6 h 開(kāi)始口灌50 mg/kg劑量的茶多酚溶液，2 個(gè)對(duì)照組灌服PBS，每12 h一次，連續(xù)灌胃3 d。每24 h 觀察各試驗(yàn)組魚的活動(dòng)情況及發(fā)病魚癥狀，并記錄各組魚的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響

MIC 測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 的MIC 高于256 μg/mL，而恩諾沙星為4 μg/mL。由此可見(jiàn)，茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 基本無(wú)抑菌活性，且該菌株對(duì)恩諾沙星具有一定耐藥性。為研究不同濃度茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響，繪制了5 h 內(nèi)茶多酚與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。如圖1 所示，茶多酚質(zhì)量濃度在16～128 μg/mL 時(shí)，嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)與未添加藥物組相比無(wú)顯著性差異。綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，質(zhì)量濃度為16～128 μg/mL的茶多酚與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)后對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

圖1 茶多酚與嗜水氣單胞菌XS-91-4-1共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of A.hydrophila XS-91-4-1 co-cultured with tea polyphenols

2.2 茶多酚對(duì)氣溶素活性的抑制作用

通過(guò)共培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚可劑量依賴性的降低共培養(yǎng)物上清液的溶血活性。如圖2a 所示，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為1，2，4，8 μg/mL 時(shí)，上清液的溶血百分比分別為38.58%±2.65%，28.82%±2.18%，21.61%±2.89%和14.58%±2.16%，而空白組溶血百分比為79.25%±4.31%。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度達(dá)到1 μg/mL 及以上時(shí)，其溶血百分比與空白組相比差異顯著。該結(jié)果提示，茶多酚可能通過(guò)抑制氣溶素表達(dá)或活性降低其溶血活性。因此，本試驗(yàn)研究了茶多酚對(duì)純化氣溶素和嗜水氣單胞菌分泌氣溶素活性的影響。如圖2b 所示，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為1，2，4，8 μg/mL 時(shí)，純化后的氣溶素的溶血百分比從未添加藥物處理組的86.98%±21.81%依次下降到44.26%±2.64%，26.27%±11.63%，16.37%±3.27%，7.29%±2.68%，當(dāng)質(zhì)量濃度在1 μg/mL 及以上時(shí)，差異顯著。如圖3 所示，通過(guò)蛋白免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度茶多酚與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)后，其上清液中氣溶素的含量沒(méi)有變化。以上3 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚可在較低質(zhì)量濃度下通過(guò)直接抑制嗜水氣單胞菌氣溶素的活性，降低其溶血活性，對(duì)氣溶素的分泌沒(méi)有影響。

圖2 茶多酚與氣溶素介導(dǎo)的溶血活性的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of tea polyphenols against aerolysin mediated hemolysis

圖3 茶多酚對(duì)細(xì)菌上清液中氣溶素產(chǎn)物的影響Fig.3 Influence of tea polyphenols on aerolysin production in bacterial supernatants

2.3 茶多酚提高氣溶素的熱穩(wěn)定性

通過(guò)熒光熱漂移試驗(yàn)研究茶多酚對(duì)氣溶素?zé)岱€(wěn)定性的影響如圖4 所示，反應(yīng)體系中加入32 μg/mL 茶多酚后，使氣溶素的Tm值向右移動(dòng)了4.8 ℃，超過(guò)了2 ℃。該結(jié)果表明，茶多酚與氣溶素結(jié)合后可提高其熱穩(wěn)定性，提示茶多酚與氣溶素發(fā)生了相互作用。

圖4 茶多酚對(duì)氣溶素?zé)岱€(wěn)定性的影響Fig.4 Impact of tea polyphenols on thermal stability of aerolysin

2.4 茶多酚抑制氣溶素的寡聚化

如圖5 所示，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的升高，氣溶素七聚體的量逐漸下降，當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度達(dá)到1 024 μg/mL 時(shí)，未檢測(cè)到有七聚體形成。氣溶素單體通過(guò)結(jié)合于易感細(xì)胞的表面形成具有孔道的七聚體，七聚體導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性被破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，茶多酚可以通過(guò)抑制七聚體的形成來(lái)降低氣溶素的活性。

圖5 茶多酚對(duì)氣溶素七聚體形成的抑制作用Fig.5 Inhibition of heptamer formation by addition of tea polyphenols

2.5 茶多酚對(duì)氣溶素介導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖6 所示，隨著茶多酚質(zhì)量濃度的升高，A549 細(xì)胞上清液中LDH 釋放比例逐漸下降。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度分別為1，2，4，8 μg/mL 時(shí)，其LDH 釋放百分比分別為74.58%±9.38%，53.49%±13.57%，46.19%±7.44%，24.39%±13.42%。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度達(dá)到16 μg/mL 及以上時(shí)，LDH 下降比例與無(wú)藥物處理組相比差異顯著。細(xì)胞染色如圖7a～7c 所示，未經(jīng)處理的細(xì)胞呈綠色（圖7a），表明該細(xì)胞為活細(xì)胞；用氣溶素處理過(guò)的細(xì)胞表現(xiàn)為紅色（圖7b），提示為死亡細(xì)胞；氣溶素與16 μg/mL 的茶多酚反應(yīng)后再加入到細(xì)胞體系，可見(jiàn)細(xì)胞死亡明顯減少（圖7c）。以上結(jié)果表明，LDH 釋放和細(xì)胞染色試驗(yàn)均能反映出A549 細(xì)胞經(jīng)藥物處理前、后的損傷或死亡情況，茶多酚處理后可顯著降低氣溶素介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

圖6 茶多酚對(duì)氣溶素介導(dǎo)的A549 細(xì)胞LDH釋放的影響Fig.6 Impact of tea polyphenols on LDH release of A549 cells mediated by aerolysin

圖7 茶多酚對(duì)氣溶素介導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.7 Protective effect of tea polyphenols on aerolysin mediated cell injury

2.6 茶多酚對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染的保護(hù)作用

通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)氣溶素介導(dǎo)的細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，提示茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌感染有一定的保護(hù)作用。通過(guò)腹腔注射的方法構(gòu)建了斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染模型。人工感染后，斑點(diǎn)叉尾鮰感染后出現(xiàn)了明顯的發(fā)病，主要表現(xiàn)為游動(dòng)失調(diào)，體質(zhì)量下降等，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)死亡魚腹腔內(nèi)有大量積水，腸道內(nèi)有出血點(diǎn)，與自然感染的癥狀相同，表明模型構(gòu)建成功。如圖8 所示，陽(yáng)性對(duì)照組未經(jīng)任何藥物治療，試驗(yàn)第8 天時(shí)存活率為3.33%；而灌服50 mg/kg 茶多酚治療后斑點(diǎn)叉尾鮰的存活率為60%，兩組差異極顯著。該研究結(jié)果表明，茶多酚可降低嗜水氣單胞菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的致病力。

圖8 茶多酚對(duì)人工感染嗜水氣單胞菌的斑點(diǎn)叉尾鮰的治療作用Fig.8 Therapeutic effect of tea polyphenols on channel catfish infected with A.hydrophila

3 討論

嗜水氣單胞菌可以引起水產(chǎn)動(dòng)物和人類的多種疾病，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外高度重視。戚偉等[19]在因采食魚塘水草而患病死亡的仔豬肝臟及病變腸道中發(fā)現(xiàn)致病菌株包含嗜水氣單胞菌；Vivekanandhan 等[20]對(duì)市售的536 個(gè)魚類樣本和278 個(gè)對(duì)蝦樣本進(jìn)行檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦和魚類有不同程度的帶菌率；馬恩紅等[21]對(duì)暴發(fā)感染性腹瀉事件的研究表明，患者是因飲用了被嗜水氣單胞菌所污染的井水而患病。從以上研究可以發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌對(duì)食品安全存在嚴(yán)重的威脅。

抗菌藥物被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性感染的預(yù)防和治療[22]，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥性，并呈現(xiàn)多重耐藥的特點(diǎn)[23]。Vivekanandhan 等[24]從印度南部出售的海鮮中分離出的319 株嗜水氣單胞菌，均對(duì)甲氧西林和利福平耐藥，對(duì)桿菌肽的耐藥率為99%，對(duì)其它抗菌藥物也有不同程度的耐藥。李愛(ài)華等[25]對(duì)我國(guó)魚類嗜水氣單胞菌進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，26 株試驗(yàn)菌株均對(duì)青霉素類藥物具有耐藥性，且多數(shù)菌株具有多重耐藥性。本研究中嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 對(duì)恩諾沙星的最小抑菌濃度為4 μg/mL，表明該菌對(duì)恩諾沙星耐藥。

成孔毒素通常是由細(xì)菌分泌的一類毒素，在肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、結(jié)核分枝桿菌和嗜水氣單胞菌等多種重要病原菌的毒力中發(fā)揮重要作用。成孔毒素可作用于真核細(xì)胞，在其細(xì)胞膜上形成寡聚體并產(chǎn)生孔道，從而引起細(xì)胞膨脹和溶解。寡聚化是成孔毒素發(fā)揮溶細(xì)胞活性的必經(jīng)階段。因此，抑制寡聚化是中和成孔毒素活性的一種手段。Xie 等[26]發(fā)現(xiàn)，金合歡素能在不抑制豬鏈球菌生長(zhǎng)的濃度下劑量依賴性地抑制豬鏈球菌溶血素的寡聚化，并通過(guò)下調(diào)MAPK信號(hào)通路減輕豬鏈球菌介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。Wang等[27]報(bào)道了楊梅素可以作為金黃色葡萄球菌α-溶血素的抑制劑，通過(guò)抑制α-溶血素的寡聚化抑制金黃色葡萄球菌的毒力。Lv 等[28]從天然化合物中發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制肺炎鏈球菌溶血素的活性，通過(guò)寡聚化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能劑量依賴性的降低溶血素寡聚體的形成，并對(duì)肺炎鏈球菌人工感染模型動(dòng)物起治療作用。以上研究表明，成孔毒素可作為研究抗毒力藥物的靶標(biāo)。因此，本研究建立了氣溶素寡聚化形成試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，氣溶素與茶多酚共孵育后，通過(guò)加入HEPES 使反應(yīng)體系的pH 降低至氣溶素可形成寡聚化的條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)氣溶素形成七聚體有抑制作用，并呈劑量依賴性，與以上研究結(jié)果一致。

自抗毒力策略用于研究抗耐藥性病原菌感染藥物以來(lái)備受關(guān)注。氣溶素作為嗜水氣單胞菌的主要毒力因子，與其致病力密切相關(guān)，是研究抗嗜水氣單胞菌感染的潛在靶標(biāo)。國(guó)內(nèi)外已篩選到多種抑制氣溶素表達(dá)、活性的化合物，并闡明了其作用機(jī)制。Srinivasa 等[29]發(fā)現(xiàn)柚皮苷作為一種群體感應(yīng)抑制劑，可抑制嗜水氣單胞菌氣溶素、生物被膜等毒力因子，并對(duì)感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用。然而柚皮苷對(duì)氣溶素誘導(dǎo)溶血活性的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度高達(dá)750 μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)中茶多酚的有效作用濃度。Takahashi 等[30]研究了4 種吲哚[3，2-b]喹啉對(duì)細(xì)菌主要成孔毒素活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)每一種吲哚[3，2-b]喹啉衍生物均能不同程度地降低溫和氣單胞菌氣溶素的溶血活性，其中C-11 位含有氨基的兩種化合物對(duì)氣溶素活性的抑制作用最強(qiáng)。這些化合物除了直接抑制氣溶素的活性，還對(duì)溫和氣單胞菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，因此，長(zhǎng)時(shí)間使用該種化合物容易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性[30]。本研究中，通過(guò)測(cè)定茶多酚與嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響，其對(duì)氣溶素活性的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其MIC。因此，使用茶多酚治療嗜水氣單胞菌感染僅會(huì)降低其致病力，不會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生選擇性壓力，不易產(chǎn)生耐藥性。譚宏亮等[31]研究了多酚類化合物白藜蘆醇對(duì)嗜水氣單胞菌毒力的抑制作用，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可在質(zhì)量濃度≥32 μg/mL 時(shí)顯著抑制上清液的溶血活性，并顯著提高感染了嗜水氣單胞菌的異育銀鯽的存活率。以上研究表明，通過(guò)抑制氣溶素的表達(dá)或活性可降低嗜水氣單胞菌的體內(nèi)、外致病力。本研究通過(guò)溶血試驗(yàn)、蛋白免疫印跡和熒光熱漂移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚可直接與氣溶素結(jié)合，從而使其失去溶血活性；進(jìn)一步的寡聚化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚與氣溶素結(jié)合后可導(dǎo)致氣溶素?zé)o法形成功能性七聚體。

近年來(lái)隨著細(xì)菌耐藥性的不斷出現(xiàn)，人們對(duì)天然化合物抗菌特性的研究也逐漸增多[32]。茶多酚是由多種多酚類物質(zhì)組成的混合物，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶多酚最小抑菌質(zhì)量濃度大于256 μg/mL，表明茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌基本無(wú)抑菌活性。此外，通過(guò)生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)茶多酚不會(huì)影響嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)。Bhattacharya 等[33]從茶中提取的多酚物質(zhì)對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行抗毒力試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)可以抑制霍亂弧菌蛋白酶的分泌，防止細(xì)菌穿透腸黏液層并在腸上皮細(xì)胞中定殖，從而降低霍亂弧菌的致病力。此外，茶多酚還廣泛應(yīng)用于保健食品、食藥加工、果蔬保鮮等領(lǐng)域[34]，而茶多酚對(duì)嗜水氣單胞菌體內(nèi)、外致病力的抑制作用尚未報(bào)道。本研究的結(jié)果顯示茶多酚可以有效的抑制嗜水氣單胞菌分泌的毒力因子氣溶素的活性，有希望作為抗嗜水氣單胞菌耐藥的候選藥物。

4 結(jié)論

本文研究了茶多酚對(duì)食源性病原菌嗜水氣單胞菌體內(nèi)、外致病力的抑制作用。結(jié)果顯示，茶多酚在體外對(duì)嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，然而可劑量依賴性的降低嗜水氣單胞菌分泌的氣溶素的活性，茶多酚能直接與氣溶素結(jié)合，使其無(wú)法形成具有孔道的七聚體而失去活性，茶多酚還可以通過(guò)抑制氣溶素活性，來(lái)降低嗜水氣單胞菌的體內(nèi)、外致病力。本研究為嗜水氣單胞菌感染的治療提供了先導(dǎo)化合物和新的策略。