三維葡萄糖電化學傳感器與膠原水凝膠集成實時監(jiān)測細胞代謝

姚春瑩 朱曉艷 劉艷玲*

（1武漢大學化學與分子科學學院， 武漢 430072）

（2武漢商學院食品科技學院， 武漢 430056）

葡萄糖作為最主要供能物質在大部分細胞中通過有氧途徑進行代謝［1］，即葡萄糖在細胞質中被轉化為丙酮酸，丙酮酸完全降解成水和二氧化碳，并釋放出大量三磷酸腺苷（ATP）［2］； 在缺氧條件下，丙酮酸則會在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸并釋放較少的ATP，該過程也被稱為糖酵解。 細胞代謝活動越旺盛，葡萄糖消耗量越多，因此，葡萄糖消耗已經(jīng)成為評價細胞生長代謝的重要指標，異常的葡萄糖代謝與多種疾病的發(fā)生密切相關。 在血液中，葡萄糖濃度的偏高或偏低均會引起機體代謝紊亂，誘導糖尿病、心血管疾病等病癥的發(fā)生［3-4］。 在神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)元對葡萄糖的攝取降低造成代謝產生的能量減少，長時間的能量供應不足導致突觸丟失和神經(jīng)元死亡［5-7］。腫瘤細胞即使在氧氣充足條件下，仍然以糖酵解的代謝方式獲取能量，這種反常的低產能糖代謝模式為腫瘤細胞的生長、增殖和轉移提供物質基礎［8-9］。因此，細胞葡萄糖代謝活動的實時連續(xù)監(jiān)測，對細胞代謝機制的理解、藥物篩選研究和疾病臨床治療均具有重要意義。

目前，已經(jīng)發(fā)展了多種分析方法用于細胞葡萄糖濃度的測定，包括熒光光譜法［10］、比色法［11］、色譜-質譜聯(lián)用法［12］、拉曼散射法［13］和電化學方法［14］等。 其中，電化學生物傳感器具有操作簡單、可微型化和響應速度快等優(yōu)勢，在細胞［15］、血液［16和活體組織［17］葡萄糖含量分析中廣泛應用。 生物酶催化作用的高效率和特異性使其被廣泛應用于電化學傳感器構建，目前葡萄糖酶型傳感器主要利用高穩(wěn)定性的葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase， GOD），并借助電子媒介體或者導電材料將酶活性中心的電子傳遞到電極表面，實現(xiàn)對葡萄糖的高靈敏、選擇性檢測。 近些年，納米科技的飛速發(fā)展為新型葡萄糖電化學傳感器構建提供了更多選擇，例如納米顆粒［18］、導電聚合物［19］、碳材料［20］和復合納米材料［21-23］等引入電極界面，大大地提高了葡萄糖酶電極的靈敏度。 盡管如此，目前所報道的傳感器對細胞葡萄糖代謝水平實時監(jiān)測仍然面臨挑戰(zhàn)，這是由于傳統(tǒng)平面培養(yǎng)的細胞在結構和功能方面與體內三維基質環(huán)境自然生長的細胞相差甚遠，而現(xiàn)有的傳感器大多是基于二維電化學傳感器，很難與細胞三維培養(yǎng)體系集成并進行細胞代謝活動實時監(jiān)測。

在前期工作中［24］，通過靜電吸附和電化學沉積等技術，依次在三維多孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架表面組裝導電聚合物聚（3，4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）、碳納米管（CNTs）和普魯士藍納米顆粒（PB NPs），制備了對H2O2電化學還原反應具有催化作用的三維電極（PCP）。 本研究工作在該電極表面進一步固定GOD，構建了三維葡萄糖電化學傳感器GOD/PCP，將包裹了腫瘤細胞（MCF-7）的膠原水凝膠填充到傳感器的孔隙，搭建了兼具三維細胞培養(yǎng)和電化學檢測功能的集成平臺。 細胞培養(yǎng)過程中，電極表面的GOD能夠催化氧化環(huán)境中的葡萄糖，產生葡萄糖酸和電活性分子H2O2，H2O2發(fā)生電化學還原反應時產生的電子通過媒介分子普魯士藍傳遞電極表面，從而實現(xiàn)傳感器對三維細胞培養(yǎng)體系葡萄糖消耗水平的實時動態(tài)監(jiān)測（圖1）。

圖1 三維葡萄糖電化學傳感器構建及細胞代謝檢測原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the fabrication of 3D glucose electrochemical sensor and the detection principle of glucose metabolism in 3D cell culture

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI660A 型電化學工作站（上海辰華有限公司）；GeminiSEM 500 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM，德國Zeiss 公司）；Nicolet-6700 型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國Thermo Fisher 公司）；LSM 900 型激光共聚焦熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司）；PDC-002 型等離子體清潔機（美國Herrick 公司）；HC-2062 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Direct-Q3 型超純水儀（美國Millipore公司）。

導電聚合物聚（3，4-乙烯二氧噻吩）∶ 聚（苯乙烯磺酸鹽）（PEDOT∶PSS， Clevios PH1000）分散液購自武漢卓鑫科技有限公司。 單壁碳納米管（SWCNTs，外徑＜2 nm，長度5～30 μm）購自南京先豐納米材料科技有限公司。 PDMS交聯(lián)劑及預聚體購自美國 Momentive Performance Materials公司。 泡沫鎳模板（厚度1.0 mm）購自昆山嘉億盛電子新型材料有限公司。 丙酮（CH3CHOCH3）、無水乙醇（CH3CH2OH）、硝酸（HNO3）、鹽酸（HCl）、氯化鉀（KCl）、二甲基亞砜（DMSO）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）和氯化鈉（NaCl）購自國藥集團化工試劑有限公司。 羧甲基纖維素鈉（CMC）、氯化鐵（FeCl3）、聚乙二醇二縮水甘油醚（PEGDE）和葡萄糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 尿酸（Uric acid）購自東京化成工業(yè)株式會社（日本）。 GOD、聚二烯丙基二甲基氯化銨、多巴胺（Dopamine）、抗壞血酸（Ascorbic acid）、乙酰膽堿（Acetylcholine）、牛血清白蛋白、聚乙烯亞胺、乳酸（Lactate）、果糖（Fructose）和半乳糖（Galactose）均購自美國 Sigma-Aldrich公司。 實驗中所使用的試劑均為分析純，所有實驗用水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 三維葡萄糖電化學傳感器構建

三維多孔PCP 電極根據(jù)前期發(fā)表工作［24］制備，步驟簡單概括為： 首先，采用PDMS 預聚體復制泡沫鎳多孔結構，通過離心、固化和刻蝕等步驟制備三維多孔PDMS 支架； 然后，通過靜電組裝、疏水作用和化學沉積方式，在PDMS 支架表面依次固定PEDOT、CNTs 和PB NPs，得到多孔PB NPs/CNTs/PEDOT（PCP）電極。 在此基礎上，通過交聯(lián)劑PEGDE 將GOD 固定在三維電極表面，形成酶型三維葡萄糖電化學傳感器GOD/PCP。

1.2.2 傳感器與細胞三維培養(yǎng)體系集成

將膠原溶液與DMEM 完全培養(yǎng)基混合均勻并調節(jié)pH 值至中性，加入2×105cell/mL 的MCF-7 細胞懸浮液，使得混合液中膠原的終濃度為1.0 mg/mL，并立即將混合液灌注到三維GOD/PCP 傳感器孔隙中，并確保液體浸沒整個傳感器。 然后，將傳感器放置于恒溫培養(yǎng)箱中，使膠原溶液在傳感器孔隙中完全凝膠化。 MCF-7 細胞在膠原水凝膠中培養(yǎng)一定時間后，進行活性染色和顯微成像。

1.2.3 細胞葡萄糖代謝實時監(jiān)測

MCF-7細胞與膠原溶液混合以及注入GOD/PCP 骨架過程與上部分步驟一致，待細胞穩(wěn)定2 h后，吸出培養(yǎng)基，并使用無菌PBS 緩沖溶液靜置清洗。 以GOD/PCP 電極為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極，Pt 電極為對電極，在恒定電壓為0.0 V 條件下，通過安培計時電流法進行檢測。 檢測過程中PBS 緩沖液中加入紫杉醇抗癌藥物，使得紫杉醇藥物的最終濃度為10和100 μmol/L。 而對照組則是加入相同體積PBS緩沖液或沒有細胞存在的條件下加入相同體積紫杉醇溶液。

2 結果與討論

2.1 GOD/PCP電極的制備與表征

PCP電極按照文獻［24］方法制備，圖2A為PCP電極的SEM圖片，結果顯示其為三維多孔支架結構，孔徑尺寸在200 μm 左右。 圖2B 進一步顯示其表面粗糙、分布有納米顆粒聚集物，為PB NPs。 PCP 電極修飾葡萄糖酶GOD后，依然保持清晰、連續(xù)和貫通的多孔結構（圖2C），有利于后續(xù)膠原水凝膠灌入及細胞三維培養(yǎng)。 同時，相較于PCP電極高倍數(shù)SEM 結果，GOD/PCP 電極的PB NPs顆粒表面附著一層薄膜（圖2D），可能是GOD被固定在電極表面所形成的蛋白膜。

圖2 （A、B）三維PCP電極和（C、D）GOD/PCP電極在不同放大倍數(shù)下的掃描電子顯微成像圖片F(xiàn)ig.2 SEM images at different magnifications for （A， B） PCP electrode and （C， D） GOD/PCP electrode

接著，通過傅里葉變換紅外光譜儀對GOD/PCP 電極的特征官能團進行表征（圖3）。 PCP 電極在2082 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰（黑線），對應于普魯士藍中Fe2+-CN-Fe3+的C≡N 伸縮振動峰； GOD/PCP 電極（紅線）在1652、1542和1108 cm－1處的吸收峰，分別對應于葡萄糖氧化酶中酰胺基團的“C= = O”伸縮振動峰、“N—H”彎曲振動峰，以及可能歸屬于PEGDE 上的“C—O—C”伸縮振動峰。 以上結果充分證明了GOD成功修飾在三維PCP電極表面。

圖3 PCP電極和GOD/PCP電極的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PCP electrode and GOD/PCP electrode

為考察GOD/PCP傳感器對目標分子的電化學響應能力，采用循環(huán)伏安法記錄了PCP、GOD/PCP電極在2 mmol/L葡萄糖溶液的循環(huán)伏安（Cyclic voltammetry， CV）曲線。 如圖4A所示，PCP電極表面沒有固定葡萄糖氧化酶時，電極在PBS溶液和2 mmol/L葡萄糖溶液中的循環(huán)伏安行為幾乎一致，僅在0～0.2 V之間出現(xiàn)普魯士藍的典型氧化還原峰。 而修飾了葡萄糖氧化酶的GOD/PCP 電極，在2 mmol/L 葡萄糖溶液中0 V 處普魯士藍的還原峰電流顯著增加（圖4B）。 以上電化學結果再次證明，葡萄糖氧化酶已成功修飾在PCP電極表面，且對葡萄糖具有良好的電化學響應性能。

圖4 （A） PCP電極和（B） GOD/PCP電極分別在PBS和2 mmol/L葡萄糖溶液中的CV曲線，掃速均為10 mV/sFig.4 CVs of （A） PCP electrode and （B） GOD/PCP electrode in PBS （black） and 2 mmol/L glucose （red） solution with a scan rate of 10 mV/s

2.2 GOD/PCP電極的電化學傳感性能

為了進一步考察GOD/PCP 電極對葡萄糖的傳感性能，采用計時電流法表征了GOD/PCP 電極對一系列濃度梯度葡萄糖的安培響應。 在攪拌條件下，通過連續(xù)加入不同濃度的葡萄糖標準溶液，得到圖5A 中所示計時電流響應曲線。 GOD/PCP 電極對葡萄糖的響應速度較快，約在3 s 內便達到電流穩(wěn)態(tài)，且在0.05～5.0 mmol/L 濃度范圍內表現(xiàn)出靈敏電流響應。 另外，根據(jù)圖5B 線性方程相關系數(shù)R2=0.998 推斷，傳感器對葡萄糖的響應在0.05～5.0 mmol/L 濃度范圍內呈良好線性關系，計算得到的檢測靈敏度為10.0 μA/（mmol·L-1），檢測限為0.02 mmol/L。 以上電化學結果表明，三維GOD/PCP 傳感器對葡萄糖具有優(yōu)良的電化學檢測性能，為后期實時監(jiān)測細胞葡萄糖消耗量奠定了基礎。

圖5 （A） GOD/PCP電極對不同濃度葡萄糖標準液的安培響應曲線，施加電位為0.0 V； （B） GOD/PCP電極對葡萄糖響應的校準曲線； （C） GOD/PCP電極對1.0 mmol/L葡萄糖和10.0 mmol/L干擾物質安培響應的統(tǒng)計圖（n=5）Fig. 5 （A） Amperometric responses of GOD/PCP electrode to a series of increasing glucose concentrations in PBS solution at a potential of 0.0 V（vs.Ag/AgCl）； （B） Corresponding calibration curve of GOD/PCP electrode to glucose；（C） Statistical results of amperometric response of GOD/PCP electrodes to 1.0 mmol/L glucose and 10.0 mmol/L potential interfering substances （n=5）

細胞在生命活動中產生的多種類型部分代謝物，可能會干擾電極對葡萄糖的檢測，因此，選用了一些典型的潛在代謝物和電活性物質對GOD/PCP 電極進行了抗干擾測試，包括果糖、半乳糖、乳酸、乙酰膽堿、尿酸、多巴胺和抗壞血酸。 利用安培計時電流法比較了GOD/PCP 電極對10.0 mmol/L 干擾物質和1.0 mmol/L 葡萄糖的響應ΔI（圖5C），可見即使這些干擾物質的濃度為葡萄糖的10倍，GOD/PCP電極對葡萄糖的電流響應遠大于干擾物分子。 這得益于GOD對底物葡萄糖的高效選擇性以及PB對產物H2O2優(yōu)異的電催化性能，使得三維GOD/PCP電極在較低電位（0.0 V）下實現(xiàn)葡萄糖高選擇性檢測。

2.3 GOD/PCP電極內的細胞三維培養(yǎng)

體內腫瘤細胞生長在周圍充滿基質的三維微環(huán)境，本工作選擇膠原作為腫瘤細胞培養(yǎng)基質。 將乳腺癌細胞MCF-7 與I 型膠原混合均勻并填充在GOD/PCP 傳感器空隙，形成三維電化學傳感和細胞培養(yǎng)體系的集成平臺。 為了便于觀察細胞在三維葡萄糖傳感器內的分布情況和生長狀態(tài)，采用交聯(lián)法將Cy3標記的鏈霉親和素固定在PCP支架，使其被黃色熒光分子標記。 細胞在傳感器內培養(yǎng)24 h后，使用細胞活性染色劑鈣黃綠素（Calcein-AM，綠色）和死細胞核染色劑碘化丙啶（PI，紅色）對MCF-7細胞進行染色（圖6A）。 共聚焦熒光成像結果顯示，MCF-7 細胞在黃色支架空隙內均勻分散，且在不同高度均有分布（圖6B）。 另外，熒光成像結果顯示MCF-7細胞幾乎全部保持高活性（綠色熒光），表明該三維傳感器的存在不影響細胞自身生長狀態(tài)。

圖6 （A） GOD/PCP 電極（黃色，Cy3標記）與MCF-7細胞（綠色，Calcein-AM 染色）三維培養(yǎng)體系集成的共聚焦成像圖； （B） MCF-7細胞培養(yǎng)24 h后被Calcein-AM和PI染色的熒光成像圖Fig. 6 （A） 3D reconstruction from confocal microscope images of MCF-7 cultured in the integrated platform and labeled with Calcein-AM（green） and PI （red） for cell and Cy3 （yellow） for GOD/PCP electrode； （B） Fluorescent image of MCF-7 cultured in the platform for 24 h and labeled with Calcein-AM and PI

2.4 MCF-7細胞葡萄糖消耗過程實時監(jiān)測

在上述工作基礎上，利用三維電化學傳感和細胞培養(yǎng)集成平臺實時監(jiān)測了MCF-7 細胞消耗葡萄糖的代謝行為。 紫杉醇是一種常用的化療藥物，可用于治療女性乳腺癌，主要作用機制是通過與微管結合阻止細胞分裂時染色體的分離，加速癌細胞死亡。 因此，采用抗癌藥物紫杉醇作為藥物刺激，考察了紫杉醇對MCF-7 細胞葡萄糖代謝活動的影響。 為了實現(xiàn)藥物刺激下細胞葡萄糖消耗的實時監(jiān)測，將MCF-7細胞和膠原混合液注入電化學傳感器中，穩(wěn)定2 h后，加入新培養(yǎng)基作為電解液，用于實時監(jiān)測紫杉醇藥物作用下細胞培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗。 實驗中向儲液池中加入不同體積的紫杉醇溶液，使得紫杉醇最終濃度為10和100 μmol/L。

在本工作中，電化學生物傳感器記錄的電流值與胞外培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖的濃度成正比，當細胞消耗周圍培養(yǎng)基中的葡萄糖時，引起葡萄糖濃度降低，表現(xiàn)為電流值下降。 即細胞消耗的葡萄糖量越多，傳感器測量的電流值下降幅度越明顯。 此處，將檢測開始時的電流值表示為I0（葡萄糖含量最大），檢測過程中某一時刻的電流值表示為I，因此I/I0或者ΔI/I0（ΔI=I0-I）可以實時反映細胞周圍環(huán)境中葡萄糖的濃度變化，即MCF-7細胞對培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗情況。

圖7 A 和7B 分別為在沒有和有MCF-7 細胞存在時GOD/PCP 電極記錄的I/I0隨時間變化曲線，圖7C為2種情況下在0～400 s和401～3600 s時間段內ΔI/I0統(tǒng)計數(shù)據(jù)。 結果顯示，在0～400 s時間內（綠色背景部分），當沒有細胞存在時，GOD/PCP 電化學傳感器的電流值下降了0.9%，這是因為傳感器表面的葡萄糖氧化酶在連續(xù)檢測過程中會消耗培養(yǎng)基中少量的葡萄糖。 當傳感平臺有細胞存在時，細胞代謝活動使記錄到的電流值下降了1.8%。 然后，GOD/PCP 電化學傳感器對三維培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖水平進行了連續(xù)較長時間（3600 s）檢測。 在401～3600 s時間范圍內，對于不含細胞的傳感平臺，傳感器記錄的電流值下降了6.4%； 而對于含有大量腫瘤細胞的傳感平臺，傳感器電流值下降了13.8%。 這是由于培養(yǎng)基中的葡萄糖被MCF-7細胞消耗，使得培養(yǎng)基中葡萄糖濃度大幅下降。

圖7 GOD/PCP電極在（A）無和（B）有MCF-7細胞存在下的I/I0隨時間變化曲線； （C） GOD/PCP電極在0～400 s和401～3600 s時間內的ΔI/I0變化統(tǒng)計， ***P＜0.001Fig. 7 Amperometric response of GOD/PCP platform （A） without（w/o） and （B） with（w/） MCF-7 cells cultured therein； （C） Statistic analysis of the ΔI/I0 during the periods of 0～400 s and 401～3600 s. ***P＜0.001

在此基礎上，考察了抗癌藥物紫杉醇對三維培養(yǎng)環(huán)境中MCF-7 細胞葡萄糖代謝的影響。 圖8A和8B 分別為MCF-7 細胞經(jīng)10 和100 μmol/L 紫杉醇孵育后，GOD/PCP 電極記錄的I/I0隨時間變化曲線，圖8C 為兩種情況下在0～400 s 和401～3600 s 時間段內ΔI/I0統(tǒng)計數(shù)據(jù)。 在藥物處理前0～400 s時間內，電流值下降無顯著性差異，表明藥物刺激刺激前細胞對葡萄糖的消耗速率一致。 在經(jīng)藥物刺激MCF-7 細胞后的401～3600 s 時間范圍內，10 μmol/L 紫杉醇處理條件下，傳感器記錄的電流值下降了10. 1%； 對于100 μmol/L 紫杉醇處理細胞，傳感器記錄的電流值下降了7. 2%。 可見，相較于正常培養(yǎng)的細胞（ΔI/I0值為13. 8%），藥物作用后細胞對培養(yǎng)基中葡萄糖消耗速率下降，且藥物濃度越高細胞消耗葡萄糖的速率越慢。 由于葡萄糖消耗速率可直接反映細胞糖代謝狀態(tài)，這些結果表明抗癌藥物對MCF-7 細胞糖代謝有較強的抑制作用，藥物濃度越高抑制作用越明顯。

圖8 GOD/PCP 電極在MCF-7細胞經(jīng)（A） 10 μmol/L 和（B） 100 μmol/L 紫杉醇處理前后的I/I0隨時間變化曲線；（C） GOD/PCP電極在0～400 s和401～3600 s時間內的ΔI/I0變化統(tǒng)計。 ns： 無顯著性差異， ***P＜0.001Fig. 8 Amperometric response of GOD/PCP platform before and after MCF-7 were treated with （A） 10 μmol/L paclitaxel and（ B） 100 μmol/L paclitaxel；（ C） Statistic analysis of the ΔI/I0 during the periods of 0～400 s and 401～3600 s. ns： no significance， ***P＜0.001

3 結 論

通過在前期發(fā)展的三維電極表面修飾葡萄糖氧化酶，構建了一種靈敏度高、選擇性好的三維葡萄糖電化學生物傳感器。 將含有腫瘤細胞的膠原水凝膠填充到三維生物傳感器孔隙中，為腫瘤細胞提供了類似體內生長情況的三維微環(huán)境，可實時監(jiān)測細胞對基質中葡萄糖的消耗，并考察了抗癌藥物對腫瘤細胞能量代謝的抑制效果。 鑒于葡萄糖在細胞代謝活動中的重要作用，該傳感器可作為細胞自身葡萄糖釋放以及消耗環(huán)境葡萄糖行為的實時動態(tài)監(jiān)測平臺，在細胞代謝、藥物篩選和癌癥研究中具有良好應用前景。