激光雕刻石墨烯陣列電極測(cè)定曲美他嗪

劉凌波 李 雙 吳康兵，2*

（1華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 武漢 430074）

（2湖北大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院， 武漢 430062）

曲美他嗪（Trimetazidine， TMZ）是一種廣泛使用的冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張藥物，在心力衰竭和心絞痛的臨床治療上有顯著的療效［1-2］。然而它卻被列入《世界反興奮劑條例》的禁用清單，成為體育賽事禁用的物質(zhì)［3］，由其引起的禁賽風(fēng)波也是屢見(jiàn)不鮮［4］。因此，開(kāi)展靈敏、快速簡(jiǎn)便的曲美他嗪檢測(cè)新方法研究具有重要意義。電化學(xué)測(cè)量具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低和易實(shí)現(xiàn)在線現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)［5-6］，然而目前關(guān)于曲美他嗪的電化學(xué)檢測(cè)研究還較少［7］，采用三電極一體化的陣列電極對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)更是少見(jiàn)。

在激光照射下，芳香族碳質(zhì)前體可吸收的光子能量引起晶格振動(dòng)，極高的局部溫度使C—O、C= = O和N= = C 鍵在高溫下分解［8］。這些原子重新組合成小分子（CO、CO2、HCN 和C2H2）釋放出來(lái)，而剩余的芳香族化合物碎片則被重新排列形成石墨烯結(jié)構(gòu)［9-10］。目前，報(bào)道的碳質(zhì)前體包括多種合成聚合物（如聚酰亞胺［11］、聚四氟乙烯［12］和聚醚砜［13］等）和天然材料（如木材［14］、木質(zhì)素［15］和食物［16］）等，因此該技術(shù)被認(rèn)為是一種極具成本效益且環(huán)境友好的工藝。本文以聚酰亞胺薄膜為碳質(zhì)前體，通過(guò)激光雕刻技術(shù)并結(jié)合圖案化設(shè)計(jì)成功制備出石墨烯一體化電極陣列。研究了激光功率對(duì)石墨烯電極的結(jié)構(gòu)形貌、活性面積、電荷轉(zhuǎn)移能力以及對(duì)曲美他嗪氧化增敏效應(yīng)的影響?；诩す獾窨淌╆嚵须姌O顯著的信號(hào)放大效應(yīng)，建立了一種靈敏、簡(jiǎn)便的曲美他嗪電化學(xué)檢測(cè)新方法，并成功用于人體尿液樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CHI 660E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；總功率為15 W 的L1型聚焦迷你激光機(jī)（上海雕途實(shí)業(yè)公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LabRAM HR800型激光共焦拉曼光譜儀（法國(guó)Horiba JobinYvon 公司）；Nova Nano SEM 450型掃描電子顯微鏡（SEM，荷蘭FEI公司）。

曲美他嗪鹽酸鹽（＞95%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。聚酰亞胺膠帶、特氟龍膠帶和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯薄板購(gòu)于深圳市新宏森科技有限公司。Ag/AgCl 漿購(gòu)于上海聚隆電子科技有限公司。鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）、氯化鉀（KCl）、十二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、尿酸、抗壞血酸、尿素和葡萄糖均為分析純?cè)噭?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 一體化陣列電極的制備

首先，繪制一體化陣列電極的圖案并導(dǎo)入激光雕刻機(jī)中，設(shè)置為雕刻圖像。如圖1A所示，陣列的工作電極是一個(gè)直徑3 mm 的圓，參比電極（左側(cè)）和對(duì)電極（右側(cè)）是扇形環(huán)，陣列下半部分的長(zhǎng)條狀用于與電化學(xué)工作站電極線之間的連接。隨后，將聚酰亞胺（PI）膠帶均勻緊密地粘貼在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄板上，置于激光雕刻機(jī)下（圖1B）。調(diào)節(jié)雕刻深度（4%）和激光功率（50%、60%、70%和80%），經(jīng)雕刻后即可得到一體化石墨烯陣列電極（圖1C）。這里的深度指的是機(jī)器的理論加工厚度，即激光誘導(dǎo)石墨烯表面到PI基質(zhì)的距離，但實(shí)際的深度往往與材質(zhì)和功率有關(guān)。不同雕刻功率下制備的電極分別命名為L(zhǎng)IG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 陣列，如圖1D 中的操作所示，使用數(shù)字萬(wàn)用表對(duì)4 種陣列的左側(cè)列進(jìn)行電阻的測(cè)量與記錄。之后，對(duì)陣列進(jìn)行封裝。將特氟龍疏水膠帶與圓相切粘貼在陣列上，以分開(kāi)連接傳感區(qū)域和電極連接區(qū)域，再使用極細(xì)的軟毛刷將Ag/AgCl漿涂覆在陣列的參比電極上（圖1E），干燥剪切后即可使用。陣列與電化學(xué)工作站之間通過(guò)定制的電極夾連接。如圖1F 所示，將金屬尖頭與陣列的三電極對(duì)準(zhǔn)夾緊，再將工作站與電極夾上的三根導(dǎo)線連接即可進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，操作十分簡(jiǎn)便。

圖1 （A）一體化陣列的設(shè)計(jì)圖像； （B）激光雕刻過(guò)程； （C）激光雕刻后的一體化陣列； （D）一體化陣列的電阻測(cè)量； （E）封裝并涂覆了Ag/AgCl漿的一體化陣列電極； （F）一體化陣列與電化學(xué)工作站之間的連接方式Fig.1 （A） Design image of the integrated arrays； （B） Process of laser engraving； （C） Integrated arrays after laser engraving； （D） Resistance measurement of integrated arrays； （E） Integrated arrays after encapsulation and coating with Ag/AgCl slurry； （F） Connection between the integrated array and the electrochemical workstation

2 結(jié)果與討論

2.1 表征與分析

用拉曼光譜對(duì)雕刻后的一體化陣列電極進(jìn)行了表征。如圖2 所示，4 種陣列均可以觀測(cè)到石墨烯的3 個(gè)特征峰［17］，分別是D 峰（1358 cm-1）、G 峰（1589 cm-1）和2D 峰（2704 cm-1），而聚酰亞胺（PI）本身并無(wú)這些特征峰的出現(xiàn)。這表明經(jīng)激光雕刻后，成功生成了石墨烯。另外，通過(guò)D 峰與G 峰的強(qiáng)度比（ID/IG）來(lái)評(píng)估了石墨烯的缺陷水平［18］。LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 的ID/IG值分別為0.45、0.37、0.19 和0.24。當(dāng)激光功率太低時(shí)，會(huì)產(chǎn)生部分無(wú)定形碳，從而導(dǎo)致石墨化程度較低，缺陷含量較高［19］。因此，當(dāng)功率由50%升高至70%時(shí)，石墨化程度逐漸提升，缺陷含量逐漸降低。而當(dāng)功率過(guò)高時(shí)，會(huì)引起熱輻射區(qū)能量增加，石墨烯會(huì)在瞬時(shí)的高溫下發(fā)生局部氧化甚至結(jié)構(gòu)的坍塌，最終導(dǎo)致缺陷含量反而升高。

圖2 PI、LIG-50、LIG-60、LIG-70和LIG-80的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of PI， LIG-50， LIG-60， LIG-70 and LIG-80

用SEM 觀察了4 種陣列電極的平面/截面形貌。圖3A-3D 為雕刻后陣列電極的低分辨率俯視SEM圖像，可觀察到石墨烯整體沿著激光的雕刻路線產(chǎn)生，呈條紋狀。隨著激光功率的升高，陣列表面的結(jié)構(gòu)愈發(fā)疏松，孔狀結(jié)構(gòu)也更細(xì)密。這是因?yàn)榧す饩劢箤?dǎo)致局部溫度瞬間上升，釋放出了部分氣體產(chǎn)物形成了多孔蓬松結(jié)構(gòu)［20］。為了觀察石墨烯的精細(xì)結(jié)構(gòu)，圖3E-3H 給出了陣列電極的高分辨俯視SEM 圖，清楚地觀察到與石墨烯二維結(jié)構(gòu)相符的多層卷曲結(jié)構(gòu)。當(dāng)激光功率從50%上升至70%時(shí)，石墨烯片層逐漸變大且更趨于完整，表明雕刻功率直接影響了碳化程度和片層結(jié)構(gòu)。而當(dāng)功率繼續(xù)提升至80%時(shí)，石墨烯片層出現(xiàn)了濺射的小顆粒結(jié)構(gòu)，可能是由于石墨烯片層在該功率下遭到了部分破壞。

圖3 （A、E） LIG-50 陣列、（B、F） LIG-60 陣列、（C、G） LIG-70 陣列和（D、H） LIG-80陣列的俯視SEM圖像Fig.3 Top-view SEM images of （A， E） LIG-50 array， （B， F） LIG-60 array， （C， G） LIG-70 array and （D， H）LIG-80 array

進(jìn)一步從橫截面觀察了激光功率的影響。如圖4 所示，激光誘導(dǎo)后PI 表面產(chǎn)生了疏松多孔結(jié)構(gòu)的石墨烯。經(jīng)測(cè)量，LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 層厚度分別為19.18、32.35、36.01 和46.10 μm，而LIG-80 層厚度的驟然提升可能與疏松程度有關(guān)。另外，還觀察到激光功率的變化使得石墨烯與基質(zhì)之間的間隙逐漸增大，這極易造成石墨烯脫落，從而影響陣列電極的性能。

圖4 （A） LIG-50 陣列、（B） LIG-60 陣列、（C） LIG-70 陣列和（D） LIG-80 陣列的橫截面SEM圖像Fig.4 Sectional-view SEM images of （A） LIG-50 array， （B） LIG-60 array， （C） LIG-70 array and （D） LIG-80 array

2.2 電化學(xué)性能測(cè)試

以K3［Fe（CN）6］為探針，利用循環(huán)伏安法（CV）測(cè)定了4種陣列電極的活性面積。如圖5A-5D 所示，觀察到一對(duì)比較對(duì)稱的氧化還原峰，隨掃速的增加，峰電位變化較小，而氧化峰電流（Ipa）隨掃速的平方根（ν1/2）線性增加（圖5E）。通過(guò)Randles-Sevcik 方程［21］，得到LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 陣列電極的活性面積（A）分別為0.118、0.122、0.138和0.134 cm2。由此可見(jiàn)，激發(fā)功率（P）為70%制備的陣列電極的有效面積較大，這可能與其特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，還測(cè)量了4種陣列電極的電阻。如圖5F所示，激光功率越大，得到的陣列電極的電阻越小。雖然80%激光功率下得到的陣列電極的電阻更低，但由于石墨烯片層更蓬松易脫落，我們?nèi)詢A向于選擇70%功率下制備的陣列電極（LIG-70）。

圖5 不同掃速下5 mmol/L K3［Fe（CN）6］在LIG-50陣列（A）、LIG-60陣列（B）、LIG-70陣列（C）和LIG-80陣列（D）上的CV 曲線； （E）不同陣列電極上的Ipa-v1/2曲線； （F）陣列電極的電阻隨激光功率的變化（誤差棒為3 次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.5 CV curves of 5 mmol/L K3［Fe（CN）6］ on （A） LIG-50 array， （B） LIG-60 array， （C） LIG-70 array and （D） LIG-80 array at different scan rates；（E） The plots of Ipa-v1/2 on different arrays； （F） Resistance changes of different arrays with laser power （error bars represent the standard deviation of three measurements）

為了篩選出電化學(xué)性能最優(yōu)的陣列，研究了曲美他嗪在不同石墨烯陣列電極上的阻抗。如圖6A所示，在0.1 mol/L，pH=6.5 的磷酸緩沖溶液中，0.5 mmol/L 曲美他嗪在4 種石墨烯陣列電極上的Nyquist圖譜均出現(xiàn)一個(gè)較大的半圓。Nyquist圖中圓弧的直徑代表電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct），直徑越大，Rct越大，電荷轉(zhuǎn)移能力就越低。通過(guò)內(nèi)插圖的Randles等效電路擬合得到，LIG-50、LIG-60、LIG-70和LIG-80陣列電極的Rct值分別為17.5、16.6、14.7和15.8 kΩ。隨著激光功率的增大，制備出的石墨烯陣列電極的電荷轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。而LIG-80陣列的Rct略大于LIG-70陣列，可能與石墨烯片層被部分破壞有關(guān)。

圖6 （A） 0.5 mmol/L 曲美他嗪在不同陣列電極上的Nyquist 圖，偏壓： 0.55 V，頻率范圍： 0.03～10000 Hz，內(nèi)插圖為Randles等效電路，其中Rs、CPE、Rct和Zw分別代表溶液電阻、常相位角元件、電荷轉(zhuǎn)移電阻和Warburg阻抗。（ B） 10 μmol/L曲美他嗪在不同陣列電極上的LSV曲線Fig. 6 （A） Nyquist plots of 0.5 mmol/L TMZ on different arrays； Bias voltage： 0.55 V， Frequency range： 0.03～10000 Hz； Inset： the Randles equivalent circuit （Rs， CPE， Rct and Zw represent the solution resistance， constant phase angle element， charge transfer resistance and Warburg impedance）.（B） LSV curves of 10 μmol/L TMZ on different arrays

用線性掃描伏安法（LSV）研究了曲美他嗪在4 種陣列的氧化信號(hào)。如圖6B 所示，陣列電極在0.10 mol/L，pH=6.5 的磷酸鹽緩沖溶液中的曲線非常平滑（虛線）； 當(dāng)加入10 μmol/L 曲美他嗪后則在0.61 V 出現(xiàn)一個(gè)氧化峰（實(shí)線）。比較發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪在LIG-70 陣列電極上的氧化信號(hào)最強(qiáng)。綜上所述，激光雕刻功率對(duì)石墨烯陣列電極的電化學(xué)性能有明顯影響，當(dāng)激光功率為70%時(shí)制備得到的石墨烯陣列電極（即LIG-70）的有效面積較大，電子交換能力更強(qiáng)，對(duì)曲美他嗪的氧化增強(qiáng)效應(yīng)也更加顯著。

用CV 研究了不同掃速下曲美他嗪在LIG-70陣列電極上的電化學(xué)行為。如圖7A 所示，曲美他嗪在0.10 mol/L，pH=6.5 磷酸鹽緩沖溶液中只出現(xiàn)一個(gè)氧化峰，峰電流隨掃速線性增加（內(nèi)插圖），而氧化峰電位隨掃速增加而逐漸正移，并且峰電位（Epa）與掃速的自然對(duì)數(shù)lnv呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖7B）。這說(shuō)明曲美他嗪的氧化是吸附控制的不可逆過(guò)程。根據(jù)Epa-lnv曲線的斜率和Laviron公式（公式（1））：

圖7 （A）不同掃速下20 μmol/L 曲美他嗪在LIG-70 陣列上的CV 曲線，內(nèi)插圖為Ipa-v 曲線； （B） Epa-ln v 曲線；（C） 20 μmol/L曲美他嗪在不同pH值磷酸鹽緩沖溶液中的CV曲線，掃速為100 mV/s； （D） Epa-pH曲線Fig.7 （A） CV curves of 20 μmol/L TMZ on LIG-70 array at different scan rates， inset： Ipa-v plot； （B） Plot of Epa-ln v；（C） CV curves of 20 μmol/L TMZ in phosphate buffer with different pH values on LIG-70 array at a scan rate of 100 mV/s；（D） Plot of Epa-pH

式中，K為常數(shù)，α是電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)，v是掃速，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，R是氣體常數(shù)，T是絕對(duì)溫度，可計(jì)算出參與氧化過(guò)程的電子數(shù)為2。進(jìn)一步研究了曲美他嗪在0.10 mol/L，不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中的電化學(xué)行為。從圖7C可知，Epa隨pH值增大而負(fù)移，說(shuō)明其氧化過(guò)程有質(zhì)子參與。如圖7D所示，Epa-pH 曲線的斜率為-0.051 V/pH，與等電子質(zhì)子轉(zhuǎn)移時(shí)的理論值-0.059 V/pH 十分接近，因此表明相同數(shù)量的質(zhì)子和電子參與了曲美他嗪的氧化。因此，曲美他嗪的氧化是一個(gè)2電子、2質(zhì)子過(guò)程，與文獻(xiàn)［22-23］報(bào)道結(jié)果相符。

2.3 曲美他嗪的檢測(cè)

為了獲得更高的響應(yīng)信號(hào)，分別考察了緩沖溶液pH值（圖8A）、初始電位（圖8B）和富集時(shí)間（圖8C）對(duì)曲美他嗪在LIG-70陣列電極氧化峰電流的影響，獲得了如下的最佳測(cè)定條件： pH=6.5，初始電位為0 V，富集時(shí)間為6 min。在最佳測(cè)試條件下，考察了不同濃度的曲美他嗪在陣列電極上的響應(yīng)情況。如圖8D所示，當(dāng)沒(méi)有曲美他嗪時(shí)，未出現(xiàn)氧化峰； 當(dāng)加入不同濃度的曲美他嗪后，出現(xiàn)一個(gè)明顯的氧化峰，峰高隨濃度增加而逐漸提高。圖8E 給出了標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)曲美他嗪的氧化峰電流（Ipa）與其濃度（c）在0.5～20 μmol/L 的范圍內(nèi)呈現(xiàn)很好的線性，線性回歸方程為Ipa（μA）=2.00c（μmol/L），相關(guān)系數(shù)（r）為0.9998。基于3倍信噪比計(jì)算得到的檢出限為0.15 μmol/L。

圖8 （A） pH 值、（B）初始電位和（C）富集時(shí)間對(duì)5 μmol/L 曲美他嗪氧化峰電流的影響；（ D）不同濃度的曲美他嗪在LIG-70 陣列電極上的LSV 曲線；（ E）曲美他嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（ F）曲美他嗪及與干擾物共存時(shí)的響應(yīng)信號(hào)。誤差棒均為3次測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig. 8 Effects of（ A） pH values，（ B） initial potential and（ C） accumulation time on the oxidation peak current of 5 μmol/L TMZ；（ D） LSV curves of TMZ with different concentrations on LIG-70 array；（ E） The calibration curve of TMZ； （F） Response siganls of 5 μmol/L TMZ in the absence and in the presence of interfertants. The error bars represent the standard deviations of three measurements

考察了尿液中可能存在的物質(zhì)對(duì)曲美他嗪測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8F所示。發(fā)現(xiàn)5 μmol/L曲美他嗪?jiǎn)为?dú)存在時(shí)的氧化信號(hào)與400 μmol/L抗壞血酸（AA）、1 mmol/L尿素（UR）、40 μmol/L尿酸（UA）、5 mmol/L葡萄糖（GLU）共同存在時(shí)的氧化信號(hào)相比改變很?。ǎ?%），表明制備的陣列電極有較好的抗干擾能力，在尿液分析中有較好的應(yīng)用前景。

將采集的3 份健康志愿者的尿液用0.10 mol/L，pH=6.5 的磷酸鹽緩沖溶液稀釋5 倍后直接進(jìn)行測(cè)定。均未檢出曲美他嗪，于是進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于2%，說(shuō)明重現(xiàn)性好。測(cè)定結(jié)果如表1所示，加標(biāo)回收率在96.0%～106.2%范圍內(nèi)，說(shuō)明陣列電極有較高的準(zhǔn)確度和較好的實(shí)用性。

表1 尿液中曲美他嗪的測(cè)定 （n=3）Table 1 Determination of TMZ in urine samples from volunteers （n=3）

3 結(jié) 論

首先，對(duì)聚酰亞胺膠帶進(jìn)行圖案化設(shè)計(jì)出陣列電極，然后，借助激光雕刻簡(jiǎn)便地制備出一體化石墨烯陣列電極。當(dāng)激光功率從50%增加到70%時(shí)，制備的石墨烯陣列電極的有效面積和電子交換能力逐漸增強(qiáng)，對(duì)曲美他嗪的氧化增強(qiáng)效應(yīng)也更加顯著。但是雕刻功率過(guò)高（如80%），石墨烯陣列電極更蓬松易脫落，其傳感性能反而逐漸下降。以激光功率為70%制備的一體化石墨烯陣列電極為傳感平臺(tái)，構(gòu)建了一種快速簡(jiǎn)便的曲美他嗪電化學(xué)檢測(cè)方法，并成功用于人體尿液樣品分析，展示出較好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。研究結(jié)果成功拓展了曲美他嗪的檢測(cè)方法，可為藥品質(zhì)量的監(jiān)督評(píng)價(jià)以及體育賽事的興奮劑檢測(cè)提供理論。