基于小分子識別的光電化學傳感器用于組氨酸檢測

楊翠翠 葉曉雪

（湖北大學健康科學與工程學院， 化學化工學院， 武漢 430062）

組氨酸（His）是組成人體蛋白質(zhì)的21 種基本氨基酸之一，由于His 不能自行合成，只能從食物中攝取，是一種必需氨基酸。His 廣泛參與多種生理和病理過程，如炎癥、神經(jīng)傳遞、過敏反應、血紅蛋白合成和胃酸分泌等［1-2］。His 可以與β-丙氨酸縮合形成肌肽和鵝絲氨酸，在抗氧化應激反應中起重要作用［3］。它也可以脫羧形成組胺，進一步參與炎癥反應。在神經(jīng)系統(tǒng)中，His在維護保護神經(jīng)元髓鞘中起著重要作用［4］。除此之外，His獨特的咪唑基團使其可以在生理環(huán)境中部分質(zhì)子化，進而通過質(zhì)子穿梭效應參與多種酶催化反應［5］。哺乳動物血液中His濃度為70～125 μmol/L［6］，血漿中His水平異常變化可能與癲癇、精神分裂癥、肝硬化和His血癥等多種疾病相關(guān)［7-9］，因此血漿中His的檢測具有重要的臨床意義。

迄今為止，已發(fā)展了多種可靠的氨基酸檢測方法，如高效液相色譜法（HPLC）［10］、毛細管電泳法［11］、紫外-可見光譜法［12］和串聯(lián)質(zhì)譜法等［13］，但這些方法存在前處理步驟復雜、耗時冗長、儀器昂貴或需要衍生化等問題，難以用于臨床快速檢測。電化學（EC）傳感技術(shù)具有簡單、快速和低成本的優(yōu)勢，是具有潛力的臨床診斷工具。His作為一種電活性氨基酸，可以采用直接電化學氧化法進行檢測［14］。比如，Zhang等［15］利用功能化的多壁碳納米管和分子印跡膜修飾電極制備了His 電化學傳感器，在一定程度上提高了靈敏度和選擇性。然而，由于His 在水溶液中的電活性非常弱［16］，因此需要在較高的電位下才能被氧化，這導致His 的直接電化學檢測面臨信號重疊、所需過電位過大等問題，不利于復雜生物樣品中His 的高選擇性和高靈敏檢測。因此，仍需發(fā)展新的檢測方法以滿足His在生物樣品中靈敏、快速和高選擇性檢測的需要。光電化學（PEC）傳感是一種基于電化學傳感技術(shù)發(fā)展起來的分析方法，繼承了電化學傳感操作簡單、價格低廉和易于微型化等優(yōu)點［17-19］。PEC 傳感器通常由光源、光電轉(zhuǎn)換元件、識別元件和信號收集元件等幾部分組成。當激發(fā)光照射電極表面的光電活性材料時，光能轉(zhuǎn)化為電能，產(chǎn)生電信號。因采用光作為激發(fā)信號，電作為檢測信號，二者之間互不干擾，從而使PEC 傳感體系具有更低的背景噪音和更高的靈敏度［20-21］。然而，由于缺乏合適的識別機制，到目前為止PEC傳感用于His檢測仍未見報道。

基于以上分析，本研究提出了一種基于化學識別策略的PEC 傳感方法用于His的靈敏、快速和高選擇性檢測。利用小分子探針對目標物的特異性識別，實現(xiàn)光電信號轉(zhuǎn)導的特異性調(diào)控（圖1）。首先，合成了一種能特異性識別His 的小分子探針2-丁基-6-（2-（4-（二乙基氨基）2-羥基亞芐基）肼基）-1H-苯并異喹啉-1，3（2H）-二酮（NCH），將其與硝酸銅共同孵育形成NCH-Cu2+。與His特異性反應后，其在395 nm處的光吸收會明顯減弱。以碲化鎘量子點（CdTe QDs）作為光電活性材料，其在395 nm波長的光激發(fā)下會產(chǎn)生較明顯的光電流信號。將CdTe QDs與NCH-Cu2+共同修飾到ITO電極上，采用395 nm波長的光激發(fā)時，由于二者對該波長共同吸收，CdTe QDs 產(chǎn)生的光電流信號減弱。NCH-Cu2+與His 反應后，其光吸收減弱，即對395 nm激發(fā)光的吸收能力下降，從而使電極表面更多的光電活性材料（CdTe QDs）被激發(fā)，繼而產(chǎn)生增強的光電流信號，光電流信號的增加幅度與His濃度相關(guān)。Cu2+與His的絡合常數(shù)為1.58×1010，高于Cu2+與其它氨基酸的絡合常數(shù)［22］，這有利于生物樣品中His 的特異性檢測。除此之外，有機小分子探針作為一種結(jié)構(gòu)靈活的小分子，通過合理設計小分子結(jié)構(gòu)，該傳感策略很容易拓展至其它目標物的檢測，如氨基酸、活性氧、活性氮和生物硫醇等生物小分子。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI 660E 型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；PEC-10W 395 nm 激光器（廣州彤泰科技公司）；UV-2650 型紫外-可見分光光度計（UV-Vis，日本Shimadzu 公司）；ASCEND-400 型核磁共振波譜儀（NMR，德國Bruker公司）。

檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）、硝酸鎘（Cd（NO3）2）、巰基丙酸、硼氫化鈉（NaBH4）、亞碲酸鈉（Na2TeO3）、4-肼-1，8-萘酰亞胺、4-二乙基氨基水楊酸，精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Iso）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、谷胱甘肽（GSH）、次氯酸鈉、過氧化氫、1，1-二乙基-2-羥基-二硝基肼鈉鹽（DEA NONOATE）鈉鹽、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、抗壞血酸、葡萄糖、硝酸鎂、硝酸鉀、硝酸鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化銅、氯化鐵、氯化亞鐵和氯化錳均購自上海阿拉丁試劑有限公司； 二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、乙二醇、無水乙醇（EtOH）、濃鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉（NaOH）、正己烷和甲苯均購自上海國藥試劑有限公司，以上試劑均為分析純； 實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 ITO電極的制備

1）取ITO 導電玻璃，切割成長1.5 cm，寬0.5 cm 的尺寸，用丙酮、EtOH 和超純水分別超聲清洗15 min，放于60 ℃烘箱中烘干。

2）將銅絲裁剪成5 cm 左右的長度，蘸取合適劑量的導電銀膠，粘于ITO 玻璃導電面的末端，靜置使導電銀膠凝固。待導電銀膠凝固后，用絕緣膠水涂于導電膠表面，起絕緣和加固作用。

1.2.2 CdTe QDs的制備

CdTe QDs參照文獻［23］合成，實驗條件稍作修改。

1）將C6H5Na3O7100 mg、Cd（NO3）259 mg 和巰基丙酸25 μL 溶于50 mL 去離子水中，超聲3 min，使其分散均勻。

2）用1 mol/L的NaOH溶液將混合溶液調(diào)節(jié)至pH=11，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中。

3）分別加入18.9 mg NaBH4和11.1 mg Na2TeO3，超聲使其分散均勻，然后將裝有混合溶液的圓底燒瓶置于100 ℃油浴鍋中，攪拌回流3 h。

4）將反應后混合溶液冷卻至室溫，加入等量異丙醇，可以觀察到圓底燒瓶中有暗紅色沉淀產(chǎn)生，靜置，待沉淀完全后離心（10000 r/min，10 min）。然后用異丙醇洗滌沉淀，重復3 次，收集沉淀，即得到CdTe QDs，放于60 ℃烘箱中真空干燥后備用。

1.2.3 探針NCH-Cu2+的制備

有機小分子NCH參照文獻［24］合成，實驗條件稍作修改，反應式如圖2所示。

將4-溴-1，8-萘酐（277 mg，1.0 mmol）和正丁胺（88 mg，1.5 mmol）加入到含有30 mL 乙醇的雙頸圓底燒瓶中。80 ℃攪拌回流2 h后，停止加熱，將混合物冷卻至室溫，然后過濾干燥，得到化合物1（N-異丙基-4-溴-1，8-萘酐）為黃灰色固體，產(chǎn)率為74.3%。然后，將化合物1（96 mg，30 mmol）與2.5 mL 85%水合肼（40 mmol）在30 mL 乙醇中進行第2 步反應。將反應混合物經(jīng)80 ℃回流加熱4 h。冷卻至室溫后，過濾得到橙色沉淀產(chǎn)物，為化合物2（4-肼-1，8-萘酰亞胺），產(chǎn)率為65.6%?；衔?、2的1H NMR譜圖見輔助材料圖S1和S2，可證明其成功合成。

將化合物2（0.141 g，0.5 mmol）溶于20 mL 甲醇中，加入4-二乙基氨基水楊酸（0.116 g，0.6 mmol），將混合溶液加熱至80 ℃回流7 h。冷卻至室溫后，將紅色混濁液過濾，沉淀用甲醇洗滌3次，得到小分子探針NCH，產(chǎn)率為67.3%。

1H NMR（400 MHz， DMSO），δ：11.22（s，1H），10.22（s，1H），8.79（d，J=8.5 Hz，1H），8.62（s，1H），8.46（dt，J=8.2，2.0 Hz，1H），8.35（d，J=8.5 Hz，1H），7.75（dd，J=8.4，7.3 Hz，1H），7.49（d，J=8.8 Hz，1H），7.41（d，J=5.0 Hz，1H），6.31（dt，J=8.9，2.3 Hz，1H），6.17（d，J=2.4 Hz，1H），5.75（s，2H），4.06～4.00（m， 2H），3.37（dd，J=7.3，5.1 Hz，3H），1.35（h，J=7.5 Hz，4H），1.15～1.11（m，6H）。1H NMR 譜圖見輔助材料圖S3，可證明其成功制備。

將NCH溶于體積分數(shù)為1%的DMSO溶液中，配置濃度為1 mmol/L的溶液。另配置濃度為10 mmol/L的Cu（NO3）2溶液，將之與NCH溶液以1∶2的體積比混合，渦旋震蕩3 min，得到His的探針NCH-Cu2+。

1.2.4 構(gòu)建光電化學傳感器

1）取CdTe QDs 溶于去離子水，配置濃度為0.25～1.25 g/L 的溶液，然后將該溶液與1.2.3 小節(jié)制備的NCH-Cu2+溶液等體積混合，超聲混勻后備用。

2）取步驟1）混合溶液5 μL，滴涂于ITO 電極表面，在60 ℃下真空干燥。然后，將3 μL 濃度為0.1%的Nafion溶液滴涂于電極表面，得到修飾電極NCH-Cu2+/CdTe/ITO。

1.2.5 光電化學測試

所有的電化學及光電化學測試均在電化學工作站上進行，參比電極和對電極分別為銀/氯化銀電極和鉑絲電極。電解質(zhì)溶液為PBS 緩沖液（pH=7.4），激發(fā)光源為波長395 nm、功率為3 W 的LED 燈。測試模式為黑暗15 s，光照5 s，黑暗5 s，交替測試。

1.2.6 大鼠血清制取

所有動物實驗均按照中國動物福利委員會實驗動物護理和使用指南進行，并經(jīng)中國湖北大學動物實驗中心機構(gòu)動物護理和使用委員會批準。

實驗用成年大鼠（SD，雄性，350 g）。用酒精棉球擦拭大鼠尾部，并剪去其尖端，長度約5 mm，使用抗凝管收集大鼠血液，將收集的大鼠血液進行離心（2000 r/min， 10 min）。離心后，取上層清液，即為試驗用大鼠血清。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe QDs和NCH-Cu2+探針的表征及光學性質(zhì)

首先，通過X射線衍射對所合成CdTe QDs的進行表征，如圖3所示。CdTe QDs晶體在24.42、40.82和47.76（°）的衍射峰與JCPDS 15-0770 標準卡一致，表明CdTe QDs成功制備。

圖3 CdTe QDs的XRD圖譜Fig.3 XRD pattern of CdTe QDs

對制備的CdTe QDs 及探針NCH-Cu2+進行光學表征。如圖4A 所示，探針NCH-Cu2+與CdTe QDs 在350～550 nm 范圍內(nèi)的光吸收重疊，這是二者能發(fā)生競爭吸收的基礎。當探針NCH-Cu2+與目標物His 反應后，其在395 nm處的吸光度值顯著下降，在500 nm處的吸收值則明顯增加，此處僅在395 nm 處對傳感器進行了研究。由于CdTe QDs 在395nm 處有明顯的吸收，表明所合成的CdTe QDs 可以在395 nm 波長下被激發(fā)。接下來，用不同濃度的His與NCH-Cu2+探針共同孵育，再檢測其光吸收值的變化，如圖4B 所示。隨著His 濃度的升高，探針在395 nm 處的吸收值逐漸降低，即NCH-Cu2+對光的競爭吸收能力隨著His濃度的升高而減弱。目標物His可通過識別反應調(diào)控探針在395 nm 處的光吸收性質(zhì)，進而影響其對光的競爭吸收能力，這為目標物調(diào)控光電流信號的大小提供了依據(jù)。

圖4 （A） CdTe QDs、NCH-Cu2+及其加入His 后的UV-Vis 吸收光譜； （B） NCH-Cu2+與不同濃度His（0、10、20、40、70和100 μmol/L）孵育后的UV-Vis吸收光譜Fig.4 （A） UV-Vis absorption spectra of CdTe QDs， NCH-Cu2+ and NCH-Cu2+-His； （B） UV-Vis absorption spectra of NCH-Cu2+ in the presence of the varying amount of His（0， 10， 20， 40， 70 and 100 μmol/L）

2.2 光電化學傳感器的構(gòu)建過程

為了證明PEC 傳感器的成功構(gòu)建，對電極修飾過程進行PEC 響應和電化學阻抗譜（EIS）測試。如圖5A所示，圖5A曲線a為裸ITO電極，幾乎沒有光電流信號產(chǎn)生。修飾CdTe QDs后，由于其良好的光電轉(zhuǎn)換效率，在395 nm 波長光的激發(fā)下，CdTe/ITO 產(chǎn)生明顯的光電流信號（圖5A曲線b）。進一步修飾探針NCH-Cu2+后，由于NCH-Cu2+與CdTe QDs之間的競爭吸收作用，NCH-Cu2+/CdTe/ITO 產(chǎn)生的光電流信號顯著下降（圖5A曲線d）。NCH-Cu2+/CdTe/ITO與60 μmol/L的His溶液共同孵育后，由于His與探針NCHCu2+發(fā)生識別反應導致探針在395 nm 處的吸收值降低，競爭吸收能力減弱，光電流信號回升（圖5A 曲線e）。為了排除His 本身對光電流信號的影響，將CdTe/ITO 與60 μmol/L 的His 共同孵育5 min 后測試其光電流響應，結(jié)果如圖5A曲線c所示，His對CdTe/ITO產(chǎn)生的光電流信號沒有影響，表明只有當His探針NCH-Cu2+存在時，His才能引起光電流信號變化。

圖5 PEC傳感器的（A）光電流響應和（B） EIS表征Fig.5 （A） Photocurrent response and （B） EIS diagram of PEC sensor

同樣用電化學阻抗譜（EIS）表征了電極的修飾過程，在EIS中，半圓弧的直徑反映了電荷轉(zhuǎn)移電阻的大小，因此，半圓弧越小，意味著電極的導電性越好。如圖5B 曲線a 所示，ITO 電極具有良好的導電性，其阻抗值Ret最小。修飾了CdTe QDs后，Ret明顯增大（圖5B曲線b），這是由于CdTe QDs作為半導體其導電性能較弱，導致修飾后的電極Ret增大。修飾探針NCH-Cu2+后，導電性進一步降低（圖5B曲線c）。如圖5B曲線d所示，將NCH-Cu2+/CdTe/ITO 電極與60 μmol/L的His溶液共同孵育后，Ret幾乎沒有變化，這表明與His對修飾電極的導電性沒有影響。上述結(jié)果證明，該PEC傳感器的成功構(gòu)建，并且可以用于檢測His。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

作為生理環(huán)境中常見的電子給體抗壞血酸（AA）濃度可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，所以考察了AA濃度對傳感器信號的影響。如圖6A所示，光電流在一定范圍內(nèi)隨著電解液中AA濃度的增加而增大，在濃度為200 μmol/L時達到最大值，所以實驗采用的電解液中的AA濃度為200 μmol/L。此濃度與大鼠血清中的AA 濃度匹配［25］。圖6B 是對CdTe QDs 質(zhì)量濃度的優(yōu)化，在其質(zhì)量濃度為1 g/L 時光電流達到最大值，因此實驗采用的CdTe QDs 質(zhì)量濃度為1 g/L。如圖 6C 所示，隨著探針NCH-Cu2+濃度的增大，競爭吸收作用增加，光電流響應逐漸降低，在濃度大于2 mmol/L時，光電流降低速率趨于平緩，所以最終選擇的探針濃度為2 mmol/L。如圖6D 所示，隨著與His 反應時間增加，NCH-Cu2+-CdTe/ITO 的光電流信號逐漸增大，在60 s時達到峰值，隨后光電流不再增大，因此最終采用的反應時間為60 s。

圖6 電解液中AA 濃度（A）、電極修飾過程中CdTe QDs質(zhì)量濃度（B）、探針 NCH-Cu2+濃度（C）和反應時間（D）對光電流的影響Fig. 6 Effects of the concentration of AA（A）， CdTe QDs（B）， NCH-Cu2+ （C） and the reaction time（D） on the photocurrent response

2.4 光電化學傳感器對His的分析性能

對所構(gòu)建的光電化學傳感器的分析性能進行了測試，如圖7A 和7B 所示，在His 濃度（cHis）為0～60 μmol/L 范圍內(nèi)，NCH-Cu2+/CdTe/ITO 所產(chǎn)生的光電流信號變化值（ΔI）隨著cHis的增加而增加，且ΔI與cHis呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為ΔI=4.20+1.36cHis（R2=0.998），檢出限為4.29 μmol/L（S/N=3）。

圖7 PEC傳感器與不同濃度組氨酸孵育后的光電流響應（A）及標準曲線圖（B）Fig.7 The photocurrent responses （A） and calibration curve （B） of PEC sensor for detecting different concentrations of His cHis： 0， 10， 20， 30， 40， 50， 60 μmol/L

2.5 光電化學傳感器的選擇性、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

為了評估該傳感器的選擇性，在相同實驗條件下，考察了NCH-Cu2+-CdTe/ITO 與多種潛在干擾物共同孵育后，其光電流信號的變化。干擾物包括多種金屬離子（K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+）、氨基酸（Gly、Leu、Lys、Iso、Arg、Tyr、Val、Met）、活性氧（ClO－、H2O2、NO、ONOO－）、谷胱甘肽（GSH）、AA、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和葡萄糖（Glu）等。如圖8所示，與干擾物共同孵育后，NCH-Cu2+/CdTe/ITO 的光電流信號沒有顯著變化，只有His 存在時，其光電流信號才有明顯變化。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的光電化學傳感器對His 具有優(yōu)異的選擇性，可用于復雜體系中His 的高特異性測定。

圖8 PEC傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the PEC sensor

除了選擇性，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性也是傳感器性能的重要指標。如圖9A 所示，將所構(gòu)建的傳感器在連續(xù)10個周期的光暗循環(huán)模式下進行測試，觀察到比較穩(wěn)定的光電流，隨著時間和循環(huán)次數(shù)增加，光電流信號幾乎沒有衰減，表明所構(gòu)建的PEC傳感器具有較好的穩(wěn)定性。隨后，抽取5組傳感器在同一條件下進行光電信號測試，結(jié)果如圖9B所示，可以看到所構(gòu)建的PEC傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

圖9 PEC傳感器的（A）穩(wěn)定性和（B）重現(xiàn)性Fig.9 Stability （A） and reproducibility （B） of the constructed PEC sensor

2.6 血清中His的檢測

在以上結(jié)果的基礎上，進一步評估了所構(gòu)建的His 傳感器在真實血清樣品中的分析準確性。分別取了3只SD大鼠的血液，離心制取血清，檢測結(jié)果如圖10所示。根據(jù)以上實驗得到的線性回歸方程，計算可得大鼠血清中的His 濃度為50 μmol/L，3 組樣本間p＜0.05，與文獻［26］報道一致。圖10 結(jié)果還表明，所構(gòu)建的PEC傳感器在血清中重現(xiàn)性較好，可以應用于復雜的生物環(huán)境。

圖10 PEC傳感器檢測大鼠血清中的His水平Fig.10 Detection of histidine in rat serum by PEC sensor

另外，為了增加實驗結(jié)果的可信度，設計了加標回收實驗。將處理好的大鼠血清稀釋5 倍，然后在其中分別加入組氨酸，使血清稀釋液中的組氨酸濃度分別增加10、15 和20 μmol/L。實驗結(jié)果如表1 所示，3 組加入不同濃度His 的樣品回收率在95.90%～103.20%之間，RSD 值在3.12～4.07 之間，該結(jié)果證明了所構(gòu)建的PEC傳感器可以應用于血清樣品中組氨酸的檢測。

表1 加標回收法測定稀釋大鼠血清中的HisTable 1 Determination of His in diluted rat serum by the standard recovery method

3 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了一種基于小分子識別的His光電化學傳感器。該傳感器通過小分子探針與目標物之間的化學識別解決了傳統(tǒng)光電化學傳感器無法檢測非電化學活性物質(zhì)的問題。小分子探針與目標物之間的高特異性反應保障了傳感器的高選擇性，具有在復雜體系中對目標物進行測定的能力。更重要的是，通過對小分子探針結(jié)構(gòu)的設計，可以將該光電化學傳感器的構(gòu)建測量拓展至其它物質(zhì)的檢測，擴大了光電化學傳感器的應用范圍，為光電化學傳感的應用提供了新的思路。

輔助材料（Supporting Information）［化合物1，2，NCH的1H NMR譜圖］可以從本刊網(wǎng)站（http：//yyhx.ciac.jl.cn/）下載。