HPLC法測(cè)定楊梅樹不同藥用部位的楊梅苷含量

劉 娥，鄒福賢，范世明

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明中醫(yī)藥傳承工作室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬泉州市正骨醫(yī)院，福建 泉州 362000；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

楊梅（Morella rubra Lour.）的栽培歷史超過2 000 年，藥用歷史超過1 700 年，楊梅根、根皮、樹皮、枝、葉和果實(shí)均可入藥［1］。《本草綱目》記載楊梅果實(shí)去痰、止嘔噦、消食下酒，樹皮及根主治惡瘡疥癩、牙痛。此外《貴州草藥》《江西民間草藥驗(yàn)方》《福建藥物志》也均有記載楊梅不同藥用部位的功效主治，主要為行氣活血、通關(guān)開竅、消腫解毒，主治跌打損傷、骨折、外傷出血等疾病［2-4］。楊梅主要含有豐富的黃酮類成分，如楊梅苷、楊梅素、楊梅醇、槲皮素、槲皮苷、蘆丁和山柰素等，其中楊梅苷含量遠(yuǎn)高于其他成分［5-8］。現(xiàn)代藥理研究表明楊梅苷具有抗菌［9］、抗氧化［5，10］、抗病毒［11］、抗腫瘤［12］、降血糖［13］及鎮(zhèn)痛［14］作用，能夠抑制破骨細(xì)胞分化［15］，改善心肌收縮功能，抑制細(xì)胞凋亡［16］，說明楊梅苷為楊梅樹的活性成分之一。

然而，目前關(guān)于楊梅的研究多集中在其果實(shí)風(fēng)味，關(guān)于其不同藥用部位活性成分的研究較少［17］。此外楊梅樹每年均需修枝剪葉，產(chǎn)生大量的楊梅樹藥材資源，若能充分利用起來將有利于中藥資源的可持續(xù)發(fā)展，避免極大的浪費(fèi)，因此本研究擬對(duì)楊梅樹的不同藥用部位進(jìn)行楊梅苷含量測(cè)定，為深入開發(fā)楊梅藥用資源奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 KQ-500VDY 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；PX225DZH 十萬分之一電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；FA1204B 萬分之一電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；Essentia LC-16 高效液相色譜儀（日本SHIMADZU 公司；SPD 紫外檢測(cè)器、Milli-Q 超純水儀均購自德國Merck 集團(tuán)。

1.2 試劑與藥材 楊梅苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥95.2%，批號(hào)：111806-201703）；色譜純乙腈（天津市康科德科技有限公司）；色譜純甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水經(jīng)Milli-Q 超純水儀處理；3 批楊梅樹樣品均采自福建省南安市，經(jīng)范世明正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定其基源為楊梅科植物楊梅（Morella rubra Lour.）。楊梅果根據(jù)其顏色、硬度和大小分為5 個(gè)成熟階段：楊梅果Ⅰ期表面呈現(xiàn)淡粉色和青色，縫合線明顯，肉柱連接緊密，果實(shí)直徑＜1 cm；楊梅果Ⅱ期表面淡粉色，略有泛白，肉柱連接緊密，果實(shí)直徑與Ⅰ期變化不大；楊梅果Ⅲ期表面粉色，部分紅色，肉柱連接緊密，果實(shí)開始膨大；楊梅果Ⅳ期表面紅色，色澤均勻，肉柱軟硬適中，果實(shí)直徑超過1 cm；楊梅果Ⅴ期表面為暗紅色，色澤均勻，肉柱軟潤飽滿，果實(shí)直徑超過1 cm［18-20］。見圖1。

圖1 楊梅果的不同分期

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 分別取3 批楊梅樹的不同藥用部位（根木質(zhì)部、根韌皮部、樹韌皮部、枝韌皮部、枝木質(zhì)部、葉、果）的干燥粗粉各3 份，每份0.5 g，精密稱定后置于錐形瓶中，加入甲醇30 mL；稱定整個(gè)錐形瓶及溶液質(zhì)量，隨后置于超聲波清洗器中超聲（40 ℃，45 kHz）處理30 min；取出錐形瓶，冷卻至室溫，再稱定整個(gè)錐形瓶及溶液質(zhì)量；用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，將溶液過0.45 μm 微孔濾膜，取過濾的中段溶液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取純度為95.2%的楊梅苷對(duì)照品10.22 mg 置于10 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，定容，搖勻，制成0.972 9 mg/mL 溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Ultimate?XB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）等度洗脫10 min，設(shè)置流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長為260 nm，進(jìn)樣量為10 μL。分別取不同藥用部位的供試品溶液和對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示：楊梅苷色譜峰對(duì)稱，與相鄰色譜峰分離度良好，基線平穩(wěn)，理論板數(shù)均不低于20 000，表明該方法專屬性強(qiáng)。

圖2 楊梅不同藥用部位樣品色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下配制的對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，搖勻，分別配成3.891 8、11.675 0、19.459 0、48.647 0、97.294 0、194.590 0 μg/mL 對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以楊梅苷濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性回歸方程為Y＝2.787 6×104X－2.461 0×104，r＝0.999 9，表明楊梅苷濃度在3.891 8～194.590 0 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度考察 精密吸取“2.4”項(xiàng)下配制的48.647 0 μg/mL 對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示：楊梅苷的峰面積RSD 為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 通過對(duì)楊梅根的韌皮部和木質(zhì)部進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)楊梅根中韌皮部與木質(zhì)部的質(zhì)量占比為15∶85，故將根韌皮部與根木質(zhì)部粗粉按質(zhì)量比15∶85 混合均勻作為混合樣品。取1 份混合樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示：楊梅苷的峰面積RSD 為0.260 0%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察 取“2.6”項(xiàng)下方法制作的混合樣品6 份，每份0.500 0 g，按“2.1”及“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，按線性回歸方程計(jì)算樣品中楊梅苷含量。結(jié)果顯示：6份樣品楊梅苷平均含量為0.240 0%，RSD 為1.590 0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度考察 取“2.6”項(xiàng)下方法制作的混合樣品6 份，每份0.250 0 g，精密稱定，再分別向每份樣品中精密加入濃度為0.972 9 mg/mL 楊梅苷對(duì)照品溶液0.600 0 mL。按“2.7”項(xiàng)下楊梅苷平均含量占比結(jié)果計(jì)算樣品中楊梅苷原有含量，按“2.1”及“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并檢測(cè)楊梅苷含量，同時(shí)計(jì)算回收率。結(jié)果顯示：楊梅苷的平均回收率為97.703 5%，RSD 為2.271 3%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 楊梅根部楊梅苷含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度考察

2.9 含量測(cè)定 分別取3 批楊梅的不同藥用部位樣品各3 份，按“2.1”及“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，按線性回歸方程計(jì)算樣品中楊梅苷含量，記錄3 批楊梅不同藥用部位樣品的平均值，見表2。結(jié)果顯示：楊梅不同藥用部位中楊梅苷含量在0.043 0%～13.917 0%，各個(gè)藥用部位楊梅苷含量差別較大，樹韌皮部＞根韌皮部＞枝韌皮部＞葉＞枝木質(zhì)部≈根木質(zhì)部＞果；楊梅果隨著成熟度的增加，楊梅苷含量在逐漸降低。

表2 楊梅樹不同藥用部位中楊梅苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 HPLC 方法優(yōu)化 不同文獻(xiàn)中楊梅苷含量測(cè)定時(shí)所選擇的檢測(cè)波長并不相同，有260、358、360 nm［21-24］。因此，為確定楊梅根中楊梅苷的最佳檢測(cè)波長，本研究將供試品溶液和對(duì)照品溶液在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)楊梅苷在225、260、350 nm 處有波峰，而225 nm 處于紫外檢測(cè)末端，容易產(chǎn)生干擾，260 nm 處吸收強(qiáng)度高于350 nm，且供試品溶液在260 nm 下楊梅苷色譜峰附近無其他色譜峰干擾，因此選擇260 nm 作為檢測(cè)波長，檢測(cè)結(jié)果更加靈敏。此外，本研究所確定的流動(dòng)相洗脫程序?yàn)榈榷认疵?，相比于其他文獻(xiàn)中的梯度洗脫［20］，基線更為平穩(wěn)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3.2 楊梅不同藥用部位楊梅苷含量比較 有文獻(xiàn)報(bào)道楊梅葉中楊梅苷含量為1.430 0%［21］，果實(shí)中含量為0.041 3%［22］，與本研究所測(cè)得結(jié)果較為接近。通過對(duì)楊梅不同藥用部位的楊梅苷含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)：楊梅苷主要集中在韌皮部，而又以樹韌皮部中含量最高，是根韌皮部或者枝韌皮部的3～5 倍；果實(shí)中含量最低，平均含量在0.066 9%，僅為樹韌皮部的1/200。因此，根據(jù)楊梅苷的藥理作用，若要發(fā)揮其抗菌、降血糖、鎮(zhèn)痛等方面的療效，應(yīng)當(dāng)選擇楊梅樹韌皮部入藥。

綜上所述，本研究建立了一種簡(jiǎn)便快捷的HPLC 方法以便于測(cè)定楊梅樹中楊梅苷含量，該方法明確了楊梅樹不同藥用部位中楊梅苷含量的分布，其中以韌皮部和葉中含量最高，這為楊梅果樹修枝剪葉所產(chǎn)生的大量枝條再利用和深入開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有助于中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。