HPLC-VWD法測定鉤藤不同部位4種化學成分的含量

徐鮮鈞，文佳珂，李 晉

（1.福建省武夷山生物研究所，福建 南平 354300；2.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

鉤藤為茜草科植物鉤藤［Uncaria rhynchophylla（Miq.） Miq. ex Havil.］、大葉鉤藤［Uncaria macrophylla Wall.］、毛鉤藤［Uncaria hirsuta Havil.］、華鉤藤［Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.］或無柄果鉤藤［Uncaria sessilifrudus Roxb.］的干燥帶鉤莖枝，具有清熱平肝、熄風止痙的功效［1］。有研究表明：鉤藤具有抗氧化、抗壓、抗癲癇、抗焦慮、抗抑郁等多重藥理作用［2-7］，臨床常用來治療神經(jīng)及心血管系統(tǒng)疾病［8-9］，如高血壓、癲癇、阿爾茨海默病等［10-11］。鉤藤化學成分較復雜，主要含有生物堿、黃酮、三萜、酚類等，其中生物堿類成分［12］，尤其是鉤藤堿與異鉤藤堿被認為是鉤藤發(fā)揮降壓作用的主要活性成分［13］。然而，鉤藤中的其他成分，如異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿以及一些酚酸類成分（綠原酸、隱綠原酸等）也存在降壓活性［14-16］。

本研究以綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化學成分為考察指標，對2 個產(chǎn)地鉤藤3 個不同部位（根、葉、帶鉤莖枝）的化學成分含量進行研究，通過含量差異分析，為鉤藤質(zhì)量研究及進一步的資源開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；G1314A1200 VWD 檢測器（美國Agilent 公司）；超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；200T 粉碎機（武義海納電器有限公司）；MSA225P-0CE-DU 十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q academic 超純水機（美國Millipore 公司）。

1.2 材料 超純水（美國Millipore 公司）；甲酸（美國Anaqua Chemicals Supply 公司）；乙腈和甲醇（天津市康科德科技有限公司）。鉤藤藥材采集于福建省武夷山市五夫鎮(zhèn)和上梅鄉(xiāng)，經(jīng)曬干或烘干后用于實驗，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學常艷旭教授鑒定為鉤藤［Uncaria rhynchophylla （Miq.） Miq. ex Havil.］。

1.3 對照品 綠原酸（批號：DSTDL002101）、異去氫鉤藤堿（批號：DST200825-018）、毛鉤藤堿（批號：DST210201-009），純度均＞98.0%，均自購于成都德斯特生物技術有限公司；隱綠原酸（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-1803240，純度≥99.07%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫，洗脫梯度為：0～5 min，5%～9%（B）；5～14 min，9%～9%（B）；14～23 min，9%～14%（B）；23～35 min，14%～18%（B）；35～55 min，18%～18%（B）；55～86 min，18%～35%（B）；86～88 min，35%～95%（B）。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；波長：254 nm；進樣體積：10 μL。鉤藤樣品溶液及混合對照品溶液色譜圖見圖1。

圖1 鉤藤混合對照品溶液及樣品溶液色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 武夷山市五夫鎮(zhèn)和上梅鄉(xiāng)生產(chǎn)的鉤藤鮮品曬干或烘干后，將其根、葉、帶鉤莖枝粉碎，過50 目篩，精密稱取藥材粉末0.50 g，加75%甲醇10 mL，超聲（350 W，40 KHz）1 h，離心，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿對照品各1.00 mg，加甲醇配成濃度為1 mg/mL 對照品溶液，儲存于4 ℃冰箱中備用。

2.4 供試品溶液的制備與考察

2.4.1 提取條件優(yōu)化 ① 提取溶液濃度的選擇：以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取功率250 W、提取時間為40 min 時，分別考察25%、50%、75%甲醇及純甲醇溶液對鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化合物提取量的影響；② 提取時間優(yōu)化：以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液、提取功率250 W 時，考察提取時間為40、50、60、70 min 時對4 種化合物提取量的影響；③ 提取功率優(yōu)化：以4種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液，提取時間60 min 時，考察超聲功率為150、250、350、450W 時對4 種化合物提取量的影響。結(jié)果顯示：75%甲醇溶液為最佳提取溶劑，60 min 為最佳提取時間，350 W 為最佳提取功率。

2.4.2 線性關系考察 取“2.3”項下的對照品溶液，配制綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿濃度分別為400、20、200、200 μg/mL 混合對照品溶液，再稀釋成不同濃度的系列混合對照品溶液。按“2.1”項下條件分析，以峰面積為Y 坐標，對照品濃度為X 坐標，繪制標準曲線，得到4 種化學成分的線性回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表1。4 種化學成分在各自線性范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 4種化學成分的線性關系考察結(jié)果

2.4.3 精密度考察 精密吸取鉤藤葉部位的同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿4 種化合物峰面積的RSD 分別為2.77%、3.43%、4.84%、4.38%，保留時間的RSD 分別為0.05%、0.05%、0.03%、0.02%（n＝6）。4 種化合物峰面積和保留時間的RSD 均在5%以內(nèi)，表明該方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 時進樣分析，記錄峰面積。綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿4 種化合物峰面積的RSD 分別為1.59%、2.38%、2.34%、4.62%，保留時間的RSD分別為0.22%、0.24%、0.11%、0.06%（n＝6）。4 種化合物峰面積和保留時間的RSD 均在5%以內(nèi)，表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性考察 取同一批藥材，按“2.2”項下供試品制備方法同時制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，計算綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿含量，并計算4 種化合物的RSD 分別為1.28%、1.89%、2.64%、0.95%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察 取鉤藤葉粉末6 份，每份12.5 mg，精密稱定，分別精密加入綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿、毛鉤藤堿的對照品適量，各成分對照品的加入量與樣品中各成分的含量相當；按“2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各化合物的加樣回收率及RSD。綠原酸，隱綠原酸，異去氫鉤藤堿，毛鉤藤堿的加樣回收率分別為97.0%、97.3%、102%、99.5%，RSD 分別為1.62%、2.50%、0.72%、1.29%。

2.5 樣品含量測定 取2 個產(chǎn)地鉤藤不同部位，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定，計算綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿及毛鉤藤堿含量，結(jié)果見表2。2 個產(chǎn)地鉤藤不同部位4 種化合物含量存在差異：綠原酸、隱綠原酸在葉中含量較高，毛鉤藤堿在根部含量較高；此外，異去氫鉤藤堿在根部的含量相比于在帶鉤莖枝和葉2 個部位，含量相對較低。

表2 2 個產(chǎn)地鉤藤不同部位4 種化學成分的含量 mg/g

3 討 論

本團隊通過對福建省武夷山市7 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)野生鉤藤藥材資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：五夫鎮(zhèn)和上梅鄉(xiāng)2 個地區(qū)的野生鉤藤較為豐富。目前，關于該地區(qū)野生鉤藤資源的研究尚未報道，因此，采用穩(wěn)定可靠的分析方法，深入研究該產(chǎn)區(qū)野生鉤藤質(zhì)量，對進一步促進野生鉤藤藥材資源開發(fā)具有重要意義。故本研究以上述兩地的鉤藤為研究對象，通過優(yōu)化的供試品溶液制備方法，來明確兩地鉤藤不同部位的綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿含量情況。

3.1 供試品溶液制備方法優(yōu)化 本實驗分別考察25%、50%、75%甲醇及純甲醇溶劑，提取時間及提取功率對鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿提取量的影響。以4 種化合物總提取量為評價指標，當提取溶劑為75%甲醇溶液（提取功率250 W，提取時間40 min），4 種化合物含量最高；提取時間60 min（提取溶劑為75%甲醇溶液，提取功率250 W），4 種化合物含量與70 min 相當，表明60 min 基本提取完全；提取功率350 W 時（提取溶劑為75%甲醇溶液，提取時間60 min），4 種化合物含量均高于其他提取功率。故供試品溶液制備方法最終確定為：以75%甲醇溶液為提取溶劑，超聲提取60 min，提取功率為350 W。

3.2 含量差異分析 本實驗建立了同時測定鉤藤中4 種化學成分含量的HPLC-VWD 分析方法，經(jīng)方法學驗證，該方法穩(wěn)定可靠。同時對比了4 種化學成分在鉤藤3 個不同部位（根、葉、帶鉤莖枝）的含量，結(jié)果表明：2 種有機酸（綠原酸和隱綠原酸）在葉中含量較多，毛鉤藤堿在根部含量較高，而異去氫鉤藤堿在根部含量較低，2 個產(chǎn)地鉤藤的實驗結(jié)果相一致。此外，對比2 個產(chǎn)地鉤藤4 種化學成分的含量：上梅鄉(xiāng)鉤藤葉部的綠原酸含量高于五夫鎮(zhèn)鉤藤，隱綠原酸含量則相反；五夫鎮(zhèn)鉤藤葉和根部的異去氫鉤藤堿含量均高于上梅鄉(xiāng)鉤藤，帶鉤莖枝部的則相反，且五夫鎮(zhèn)鉤藤根部的毛鉤藤堿含量高于上梅鄉(xiāng)鉤藤。

本實驗通過建立HPLC-VWD 含量測定方法，對鉤藤不同部位的4 種化學成分含量進行測定，方法學考察結(jié)果表明：本實驗建立的同時測定鉤藤中綠原酸、隱綠原酸、異去氫鉤藤堿和毛鉤藤堿含量的HPLC-VWD 分析方法精密度高、穩(wěn)定性好，可用于鉤藤中化學成分含量測定。這為鉤藤藥材的質(zhì)量標準完善提供了參考。